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HPLC法测定肿节风提取物中反丁烯二酸的方法及优化

范文

龙昶文韦剑发李盛毅李柏蓉黎冬梅朱晓莹

摘要目的：探索及优化HPLC法测定肿节风提取物中反丁烯二酸的方法。方法：采用单因素试验分别对HPLC法测定肿节风提取物中反丁烯二酸的流动相比例、流动相PH值、流速、柱温进行优化，每个因素设定4个水平，以找出每个因素的最适宜水平。结果：在乙腈-磷酸V：V=15：85、磷酸PH=3、流速为1ml/min，柱温28℃条件下，对对照品与供试品进行色谱分离结果较满意。结论? 经单因素实验优化实验条件可以用于测定肿节风中反丁烯二酸含量。

关键词肿节风反丁烯二酸高效液相色谱法单因素试验

中图分类号：R284.1文献标识码：A

肿节风为近年研究较多的中草药，又名草珊瑚、九节茶等，味苦，辛，性平，具有清热凉血，活血消斑，祛风通络的功效。现代医学研究表明肿节风的化学成分主要有：有机酸、黄酮、倍半萜、挥发油、香豆素等多种化学成分，具有抗菌消炎、抗肿瘤、抗病毒等多种活性。

1仪器与试药

高效液相色谱仪：戴安 -3000高效液相色谱仪，紫外可变检测器（ 3000），变色龙6.8工作站、色谱柱：AccLaim C18（250nm？.6nm，5 m）、电子分析天平、水浴锅、超纯水仪、负压过滤器、超声波清洗器、中药粉碎机。对照品反丁烯二酸（批号：111541-201102，中国食品药品检定研究院）、肿节风药材（购于百色市生物医药有限公司，产地：玉林）经本院张树球教授鉴定为肿节风药材。磷酸为分析纯、乙腈为色谱纯，超纯水。

2方法与结果

2.1对照品和供试品的制备

精密称取反丁烯二酸对照品8mg，置于100ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45 m有机微孔滤膜过滤即可。

精密称定肿节风药材茎粉末1.0g，置100ml锥形瓶中，加入约50ml甲醇，于70℃水浴回流提取1h，将提取液于60℃水浴挥干，残渣用乙腈（原液与乙腈体积比为4：1）超声10min溶解，0.45 m有机滤膜过滤，即为供试品。

2.2对照品检测波长的选择

取对照品溶液，在流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（20：80），流速1ml/min，柱温30℃、进样量为20 l的条件下，进行3D紫外扫描，反丁烯二酸在220nm有最大吸收峰，选择220nm作为检测波长。

2.3单因素试验

以流动相的配比、流动相PH值、流速、柱溫作为影响色谱分离效果的单因素，分别对反丁烯二酸标准品进行色谱分离，以找出不同因素的适宜范围。

2.3.1流动相的配比对色谱分离的影响

在柱温为28℃、检测波长为220nm、流动相磷酸PH2.9、流速为1ml/min，进样量为20 l的条件下，以乙腈：磷酸体积比分别为：V：V=25：75、20：80、15：85、13：87条件下，分别进样色谱分离。结果以乙腈-磷酸V：V=15：85色谱分离效果较佳。

2.3.2流动相PH值对色谱分离的影响

在柱温为28℃、检测波长为220nm、乙腈-磷酸V：V=15：85、流速为1ml/min，进样量为20 l的条件下，以磷酸PH 2.9、3、3.5、4条件下，分别进样色谱分离。结果以磷酸PH=3色谱分离效果较佳。

2.3.3流速对色谱分离的影响

在柱温为28℃、检测波长为220nm、乙腈-磷酸V：V=15：85、磷酸PH=3，进样量为20 l的条件下，以流速为0.8、0.9、1、1.5ml/min条件下，分别进样色谱分离。结果以流速为1ml/min色谱分离效果较佳。

2.3.4柱温对色谱分离的影响

在检测波长为220nm、乙腈-磷酸V：V=15：85、磷酸PH=3、流速为1ml/min，进样量为20 l的条件下，以柱温为26、28、30、35℃条件下，分别进样色谱分离。结果以柱温28℃色谱分离效果较佳。

2.4对照品及样品测定结果

在检测波长为220nm、乙腈-磷酸V：V=15：85、磷酸PH=3、流速为1ml/min，柱温28℃，进样量为20 l的条件下，分别进样色谱分离，结果见下图1。

3讨论

影响色谱分离效果的因素主要有HPLC检测器;色谱柱填料孔径大小及其粒径分布均匀性、色谱柱直径;流动相的组成、比例、PH值;流速;柱温;进样量等。欲分离出较理想的色谱图，须对上述影响因素进行调整优化，相比硬件设施的改变，对流动相、流速、柱温等因素进行优化更经济可行。在本实验室条件下，按照参考文献提供方法得到图谱并不理想。经过单因素实验，在检测波长为220nm、乙腈-磷酸V：V=15：85、磷酸PH=3、流速为1ml/min，柱温28℃，进样量为20 l的条件下，对照品与供试品进行色谱分离较满意，理论塔板数不低于2000。为下一步实验创造条件。

基金项目：右江民族医学院教改立项项目（右医院字[2011]28号）;右江民族医学院2013年度校级大学生创新训练计划立项项目（XJACX201316）。

参考文献

[1] 中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：207-208.

[2] 郁建生，李英伦.草珊瑚研究进展[J].安徽农业科学，2005，33（12）：2390-2392.

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