《酱醪配制阶段添加良性乳酸菌解决酱油二次沉淀的研究》-农学论文，农业论文-论文范文参考-科学狗论文网

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酱醪配制阶段添加良性乳酸菌解决酱油二次沉淀的研究

范文

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摘要：根据乳酸菌显微镜细胞形态、耐盐性试验、产物中有害物质含量（组胺和酪胺），从菌种库3株乳酸菌中鉴定出R3为良性乳酸菌;通过扩大培养工艺，使得R3乳酸菌培养液的细胞数达到109;将培养液在酱醪配制阶段添加至酱醪中，发酵180d后，试验罐的天然油的二次沉淀是对照样的10%。

关键词：良性乳酸菌;细胞形态;耐盐性试验;组胺和酪胺

中图分类号 TS264文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）09-0131-04

Study on a Long-term Preservation Method of Aspergillus

Hua Huanhuan et al.

（Guangdong Meiweixian Flavoring Foods Co.， Ltd.， Zhongshan 528400， China）

Abstract： Brown rice with water to cook for 15min， the boiled brown rice and bran are mixed with 5∶1 by weight，taking them into the flask. Each triangular flask has a thickness of 7-10cm medium，triangle bottle with tampons and kraft paper seal，sterilization at 121℃ 20min. Inoculated with Aspergillus oryzae in the Erlenmeyer flask， 35℃ culture 72h. The mature Aspergillus oryzae was vacuum dried to about 10% moisture， the dried bacteria were stored in a refrigerator at-20℃， save for up to 20 years.

Key words： Btown rice; Vacuum dry; Dry and frozen

1 引言

酱油是人们生活所必需的调味品之一，我国每年均会大量出口酱油。虽然我国出口的酱油都是选用上等原料生产的，产品出厂经严格灭菌、过滤、检测等工序，出口时无沉淀物，但经一段时间库存和销售的酱油有二次沉淀析出，使酱油质量下降，从而影响了酱油在国际市场的竞争力。酱油在生产和储存的各个阶段都可能产生沉淀，从发酵罐中放出来的未经灭菌的酱油称为原油，这种原油产生的沉淀称为原沉淀;原油加热处理后，放置一段时间后生成的沉淀物称为一次沉淀;成品酱油在储存或货架销售过程中产生的沉淀为二次沉淀。二次沉淀的产生是当今我国酱油行业普遍存在的尚未解决的一大难题。经显微镜检测及成分分析，二次沉淀主要是大量菌体聚集而成，其次是原料中未分解的蛋白质组成。

本研究旨在提供一种酱醪中添加良性乳酸菌，以抑制恶性乳酸菌的增殖，從而减少酱油中的恶性乳酸菌菌体;恶性乳酸菌细胞单个、分散的存在于酱醪中，良性乳酸菌细胞几个连接在一起，成团存在于酱醪中。原油过滤时，可以将良性乳酸菌的菌体除去，进而解决酱油二次沉淀的问题。

2 材料与方法

2.1 供试材料酿造酱油生产原料：黄豆、面粉、麸皮，从市场采购。乳酸菌：广东美味鲜调味食品有限公司菌种库提供。酵母抽提物、牛肉膏、蛋白胨、磷酸二氢钾等试剂：由广州化学试剂厂提供。

2.2 主要设备显微镜、培养箱、超净工作台、NK式蒸煮锅、发酵池、发酵罐。

2.3 培养基配方1（MRS培养基）：酪蛋白胨10g、牛肉浸取物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、吐温801g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g、琼脂20g、氯化钠58.5g、蒸馏水1000mL，pH6.8。配方2（番茄汁琼脂培养基）：酵母抽提物5g、牛肉膏10g、乳糖20g、葡萄糖2g、磷酸氢二钾2g、吐温801g、乙酸钠5g、琼脂15g、番茄汁50mL、加水至1000mL，pH6.8。配方3（番茄酱琼脂培养基）：蛋白胨20g、牛肉膏3g、酵母膏3g、番茄酱100g、乳糖20g、氯化钠5g、碳酸钙10g、加水至1000mL，pH6.8。

2.4 试验方法

2.4.1 乳酸菌分离纯化培养基配方的确定配方1（MRS培养基）：酪蛋白胨10g、牛肉浸取物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、吐温801g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g、琼脂20g、氯化钠58.5g、蒸馏水1000mL，pH6.8。配方2（番茄汁琼脂培养基）：酵母抽提物5g、牛肉膏10g、乳糖20g、葡萄糖2g、磷酸氢二钾2g、吐温801g、乙酸钠5g、琼脂15g、番茄汁50mL、加水至1000mL，pH6.8。配方3（番茄酱琼脂培养基）：蛋白胨20g、牛肉膏3g、酵母膏3g、番茄酱100g、乳糖20g、氯化钠5g、碳酸钙10g、加水至1000mL，pH6.8。

2.4.2 乳酸菌分离纯化方法的确定方案1（稀释涂布法，有氧培养）：（1）将分别盛有9mL生理盐水的6支试管灭菌，并按顺序进行编号;（2）用移液管吸取1mL培养的菌液，注入试管中，用手指轻压移液管上的橡皮，吹吸3次，使菌液与水充分混匀;（3）从10-1倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入10-2倍稀释的试管中，重复第2步的混匀操作，以此类推，直到完成最后1支试管的稀释;（4）取少量菌液滴加在培养基表面，用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面方案2（二重皿扁平培养法，见图1厌氧培养）：将干热灭菌的培养皿的盖皿，按常法进行平板培养，流入培养基还没有凝固前，将底皿的底面压入盖皿培养基内，令其凝固，盖皿和底皿之间的空隙则用熔化的石蜡加以密封，隔绝空气，将其放在无菌大型培养皿内。

2.4.3 通过乳酸菌显微镜细胞形态确定乳酸菌的优劣通过显微镜检测乳酸菌的细胞形态，几个细胞粘连在一起的乳酸菌称为良性乳酸菌。使用显微镜对经相同条件下（相同培养基、相同培养温度和无氧条件）扩大培养的3株乳酸菌培养液进行镜检，步骤如下：（1）配制1.5LMRS液体培养基，分装于3个1L的三角瓶中，每个三角瓶装500mL;（2）将分装好的培养基于121℃、灭菌30min，冷却，备用;（3）将3株乳酸菌分别接种于灭过菌的培养基中，于35℃培养5d;（4）将盖玻片用酸洗液浸泡10s左右，用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，用擦镜纸擦拭干净。此步骤中不能用酒精点燃杀菌，否则盖玻片会断裂;（5）用滴管滴半滴蒸馏水于载玻片上，使用灭过菌玻璃吸管吸取培养物，滴一滴培养物于载玻片上;（6）盖上盖玻片，确保无气泡;（7）观察细胞形态，拍照。

2.4.4 通过耐盐性试验确定3株乳酸菌的优劣（1）配制1.5L高盐分的乳酸菌扩大培养基（头油10%、葡萄糖5%、盐分18%），分装于3个1L的三角瓶中，每个三角瓶装500mL;（2）将分装好的培养基于121℃、灭菌30min，冷却，备用;（3）将3株乳酸菌分别接种于灭过菌的培养基中，于35℃培养5d，每天检测培养物的pH和细胞数;（4）通过检测培养物的pH和细胞数，确定这3株乳酸菌在高盐培养基条件的生长情况;（5）选出耐盐性强的乳酸菌，更适于酱油酿造。

2.4.5 通过检测产物中有害物质的含量（组胺和酪胺）判断乳酸菌优劣（1）实验室规模制作大曲：蒸熟的黄豆与面粉按照1∶0.4比例混合，接种米曲霉3.042，装入铝饭盒中于30℃恒温培养44h，制得成熟的大曲;（2）实验室规模制醪：取150g大曲与450g23波美的盐水混合制成酱醪，装于1个1L三角瓶种;（3）分别取实验例2中培养好的3种乳酸菌添加至3瓶酱醪中，使得每瓶酱醪中乳酸菌的细胞数达到106，以不添加乳酸菌的那瓶酱醪为对照样;（4）将添加乳酸菌的酱醪放置在30℃培养箱，恒温发酵30d，每10d检测上清液的pH，发酵完成后，检测上清液中组胺和酪胺的含量，进而判断这3株乳酸菌的优劣。

2.4.6 筛选出的良性乳酸菌R3应用于酱油酿造解决二次沉淀问题（1）将乳酸菌R3按照以上扩大培养的方法扩大培养，使得细胞数达到109;（2）将培养好的乳酸菌R3添加至的面积为65m2的发酵罐的酱醪中，使得酱醪中的细胞数为106，添加时机为酱醪配制阶段添加乳酸菌;（3）以同一天投料的，未添加乳酸菌的65m2发酵罐为对照罐;（4）发酵过程管理：发酵时间为3d、7d、15d、30d、45d、60d、90d复油搅拌酱醪，发酵180d放出头油;（5）用0.1μm膜过滤法过滤天然油，过滤后的天然油经煮制、调配、热沉3d，取上清液，装入玻璃瓶，封口，常温放置60d，观察酱油的二次沉淀。

3 结果与分析

3.1 乳酸菌分离纯化培养基的配方由表1可知：用配方1分离纯化得到的乳酸菌细胞数最多，说明培养基配方1最适用于乳酸菌的生长。

3.2 乳酸菌分離纯化的方法由图2、图3及表2可知：分离纯化乳酸菌时，用二重皿扁平培养法得到的细胞数高于稀释涂布法。说明乳酸菌在厌氧条件下生长的好，乳酸菌扩大培养时，需厌氧培养。

3.3 3株乳酸菌的细胞形态图4是在中国微生物网购买的嗜盐片球菌，命名为R1，从细胞形态看，单个细胞排列、较分散;图5是上海微生物酿造研究所购买的乳酸菌，命名为R2，从细胞形态看，是乳酸菌杆菌;图6是我司酱醪中分离得到的乳酸菌，命名为R3，从细胞形态看，是几个细胞连接在一起的片球菌。由此可见，酱醪中分离得到的乳酸菌为良性乳酸菌，更适于酱油酿造解决二次沉淀。

3.4 3株乳酸菌的耐盐性由表3可知，R1和R2这2株乳酸菌在高盐条件下扩大培养时，pH值下降缓慢，说明其生长繁殖较慢，产乳酸的含量低，乳酸菌R3更适合生长于高盐的培养基，pH下降快速，说明其繁殖能力强。由表4可知，R1和R2这2株乳酸菌在高盐条件下扩大培养时，细胞增殖较慢，培养至5d时细胞数为107，乳酸菌R3培养至5d时细胞数为109，达到目标值，说明酱醪分离得到的乳酸菌更适合生长于高盐培养基。

由表5可知，添加乳酸菌R3发酵的水黄中组胺和酪胺含量最少，说明乳酸菌R3更适于酱油酿造。

3.5 乳酸菌R3解决酱油酿造解决二次沉淀的效果由表6可知，添加乳酸菌R3发酵的酱油二次沉淀析出的时间比未添加乳酸菌的酱油晚，且放置60d时添加乳酸菌的酱油二次沉淀减少很多。试验证明，添加良性乳酸菌可以解决酱油中的二次沉淀问题，同时充分说明酱油中的二次沉淀主要是由恶性乳酸菌的菌体构成的。

4 结论

以MRS培养基配方及二重皿扁平培养法分离得到的3株乳酸菌，根据乳酸菌的显微镜细胞形态、耐盐性试验、产物中有害物质含量（组胺和酪胺），鉴定出乳酸菌R3（公司酱醪中分离得到的乳酸菌）为良性乳酸菌;通过扩大培养工艺，使得R3乳酸菌培养液的细胞数达到109;将培养液在酱醪配制阶段添加至酱醪中，发酵180d后，试验罐的天然油的二次沉淀是对照样的10%。

参考文献

[1]刘庆玮.浅谈酱油的稳定性[J].中国酿造，1990（6）：13-18.

[2]陈有容，刘庆玮.酱油中沉淀及浑浊物产生的原因初探[J].天津微生物，1989（2）：32-37.

[3]李水泉，姚恕.中性蛋白酶发酵工艺优化研究[J].微生物学通报，1995，22（3）：155-154.

[4]林祖申.影响酱油感官指标的色泽浑浊和沉淀的研讨[J].中国调味品，1997（7）：2-4.

[5]李大锦，王汝珍.低盐固态发酵法酱油技术进步现状和发展[J].江苏调味副食品，2002，05：1-3.

（责编：张宏民）

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