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活体荧光成像结合金属离子检测研究乙基麦芽酚氧钒对阿尔茨海默病的作用

范文

何志军　白杨　赵琼晖　欧阳霈　倪嘉缵　刘琼　甘文标　张学记

摘?要?阿尔茨海默病（Alzheimer's disease， AD）是老年人中的主要痴呆类型。目前临床用药物只能缓解症状、无治疗效果，因此，亟需开发有效的AD治疗药物。本研究以三转基因AD模型小鼠3×Tg?AD为研究对象，对2月龄AD小鼠分别给予0.2和1.0 mmol/L乙基麦芽酚氧钒（BEOV）饮用水2个月，采用旷场实验、高架十字迷宫、Y迷宫3种行为学测试法，发现BEOV可以显著改善4月龄AD小鼠的自发活动、探索和记忆能力、减轻小鼠的焦虑状态。采用活体荧光成像技术在体追踪检测2.5和3.5月龄小鼠脑皮层神经元树突棘的变化，发现YFP荧光小鼠树突棘数量呈增多趋势; 而3×Tg?AD与YFP小鼠杂交后代AD?YFP小鼠的树突棘则呈下降趋势。与AD?YFP鼠相比较，补充1.0 mmol/L BEOV的AD?YFP小鼠，脑皮层神经元总树突棘、蘑菇型树突棘、细小型树突棘数量均呈显著增加，说明BEOV可保护神经元、减少小鼠树突棘的丢失。采用电感耦合等离子体质谱（ICP?MS）检测3×Tg?AD鼠脑金属离子水平，结果表明， 1.0 mmol/L BEOV能显著提高鼠脑V和Se的水平、降低Fe、Zn、Hg、Pb、Bi和Ni的水平，说明V可与Se协同调控AD鼠脑中多种金属离子水平。本研究表明， BEOV可通过调控AD鼠脑中多种金属离子的内稳态平衡，保护神经细胞，抑制AD小鼠神经元树突棘丢失，从而增强小鼠记忆能力，干预AD病理进程。

关键词?阿尔茨海默病; 乙基麦芽酚氧钒; 活体荧光成像; 树突棘; 电感耦合?等离子体质谱

1?引言

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease， AD）是一种神经退行性疾病。临床表现为认知和记忆功能障碍，日常生活能力进行性减退，并伴随有精神疾病症状和行为障碍。AD有三大病理特征：脑部海马和皮层区β淀粉样蛋白（β?amyloid protein， Aβ）在细胞外聚集形成老年斑（SP）、神经元中过度磷酸化的Tau蛋白异常聚集形成神经纤维缠结（NFT）、神经元突触功能异常及锥体神经元丢失[1]。根据2019年世界卫生组织指南“降低认知衰退与痴呆风险”中的数据[2]，全球痴呆患者约5千万，每年新增痴呆病例近1千万， AD是痴呆病中最常见的一种类型[3～5]。预计到2050年中国60岁以上老人将达4.38亿。目前临床使用的抗AD药物只能用于缓解症状，不能逆转或阻止AD病程，因此，亟需研发有效的AD治疗药物。

AD患者脑内存在胰岛素抵抗。II型糖尿病（T2DM）患者罹患AD的风险明显高于非糖尿病人[6]。AD和T2DM在信号传导上游具有交叉点与共同通路，提示糖尿病治疗药物有可能改善AD的病理变化。钒化合物对糖尿病的作用效果和机制已有大量报道[7～10]，但它们对AD作用的报道甚少。目前，已发现乙酰丙酮氧钒能通过调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）信号通路抑制AD模型小鼠脑中Aβ的生成，改善AD小鼠的学习记忆能力，并通过调控糖原合成酶激酶?3β（GSK?3β）信号通路减少SH?SY5Y细胞中tau蛋白的过度磷酸化[11，12]。钒酸钠可激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B （PI3K/PKB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等激酶，降低大鼠海马tau蛋白的磷酸化[13]。有关钒化合物对AD脑中金属离子内稳态的调控及神经元树突棘生长发育的影响，尚未见报道。

乙基麦芽酚氧钒（Bis（ethylmaltolato）oxovanadium， BEOV）具有良好的水溶性及愉悦的麦芽香气，其干预糖尿病和癌症的作用和机制已有报道。BEOV具有类胰岛素作用，能够促进葡萄糖摄取和抑制脂肪分解。与其它钒化合物相比， BEOV具有良好的小肠上皮细胞吸收性和低毒性[14]，在降血糖方面具有良好的效果[15，16]。BEOV可通过血脑屏障进入中枢神经系统，并与胰岛素受体或类胰岛素受体结合。因此推测它可能对AD也有治疗作用。

金属离子为机体维持正常生理功能所必需物质。然而， AD患者脑内通常会出现金属离子内稳态失衡，例如出现Fe3+、Cu2+和Zn2+的大量积累，以及氧化还原活性金属离子的失调，诱导产生活性氧（ROS），导致神经元损伤[17～21]。因此，针对金属离子内稳态失衡进行AD病理进程的干预，有望成为一种潜在的AD治疗方法[22 ～ 24]。

树突棘是神经元树突分枝上的棘状突起，是神经元间形成突触的主要部位。在學习记忆过程中，突触可塑性常与树突棘的形成、脱落、扩张和萎缩等形态变化相伴发生。本研究采用正置激光共聚焦显微镜对三转基因AD荧光小鼠（AD?YFP）脑皮层神经元树突棘的变化进行活体追踪成像，在体研究BEOV对神经元生长发育的作用。同时，采用电感耦合等离子体质谱（ICP?MS）检测AD小鼠脑组织中金属离子的变化，探索BEOV干预AD病理过程的机制。

2?实验部分

2.1?仪器与试剂

正置荧光显微镜、FV?1000双光子激光扫描显微镜（日本Olympus公司）; 解剖显微镜（德国Leica公司）; 微型牙科钻（德国Fine Science Tools公司）; 旷场实验系统（深圳瑞沃德生命科技有限公司）; 十字高架迷宫系统（深圳瑞沃德生命科技有限公司）; R500通用型小动物麻醉机（深圳瑞沃德生命科技有限公司）; 高压微波消解仪（美国CEM公司）; 7700A电感耦合等离子体质谱仪（美国Agilent公司）。

BEOV（纯度>99%，武汉贝尔卡生物医药公司）; 戊巴比妥钠（美国Sigma公司）; 电子级纯度HNO3（阿拉丁试剂有限公司）; 异氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司）; 义齿基托树脂自凝牙托水（上海新世纪齿科材料有限公司）; 人工脑脊液（南京亿迅生物科技有限公司）。

2.2?实验方法

2.2.1?动物饲养与给药?三转基因AD模型小鼠（品系： B6;129?Psen1tm1MpmTg（APPSwe，tauP301L）1Lfa/J; 缩写： 3×Tg?AD; 编号： 004807）购于美国Jackson动物实验室，能在脑内过表达人源突变基因APPswe、tauP301L以及鼠源PS1M146V突变基因。将24只2月龄AD小鼠随机分成3组，分别为AD组、饮用含低浓度或高浓度BEOV水的AD给药组，每组8只小鼠。同时选取8只同月龄的野生型小鼠（品系： B6： 129SF2/J）作为正常对照组（WT组）。给药组小鼠分别饮用浓度为0.2和1.0 mmol/L的EBOV溶液，其它组小鼠饮用超纯水，给药2个月后处死。

转基因荧光小鼠（品系： B6.Cg?Tg（Thy1?YFP）HJrs/J; 名称： thy1?YFP?H; 缩写： YFP）由甘文标教授实验室提供。AD小鼠与YFP小鼠杂交筛选获得2.5月龄雄性AD?YFP小鼠9只，随机分为3组，每组3只，其中2组分别给予含0.2和1.0 mmol/L BEOV的饮用水，作为给药组，给药1个月。另一组AD?YFP小鼠给予超纯水，作为AD对照组。再选取3只同月龄同性别的YFP小鼠作为正常对照组，饮用超纯水。所有小鼠都在温度为22℃±1℃、相对湿度为60%±5%、光照节律为12L∶12D（7：00～19：00）条件下的动物房中饲养，小鼠都能够自由摄取饮用水和食物。

2.2.2?小鼠行为学检测??（1）旷场实验（OFT）?用于评价动物在新异环境中自主探索能力和紧张程度。旷场实验箱100 cm×100 cm×30 cm，底部平均分成16个25 cm×25 cm的正方形小格，正上方2 m处架有一个活动记录仪，背景噪音保持在65 dB以下。将小鼠放入试验箱中央，开始记录，让小鼠自由探索5 min，详细实验步骤见文献[25]。实验测试指标：小鼠穿过格子数（Cross grid）、后肢站立次数（Rearing）、尿便次数（Defecation）等。（2）高架十字迷宫（EPM）?用于评价小鼠的焦虑状态。由2个封闭臂（35 cm×5 cm×10 cm）、2个开放臂（35 cm×5 cm），一个连接4个臂的中央平台等组成。测试前，先将小鼠放置在一个盒中让其自由探索5 min，然后迅速将小鼠置于十字迷宫的中央平台上测试5 min，详细操作步骤见文献[26]。实验测试的指标包括：小鼠进入开放臂的次数（OE）、时间（OT），小鼠进入封闭臂的次数（CE）、时间（CT）; 小鼠进入封闭臂和开放臂的总次数（OE+CE）; 小鼠进入开放臂次数比例（POE， %）=OE/（OE+CE）×100%; 小鼠进入开放臂时间比例（POT， %）=OT/（OT+CT）×100%。（3） Y迷宫?用于评价小鼠的记忆能力。由3个等长的臂（40 cm×3 cm×12 cm）组成，每个臂之间夹角为120°。测试时，将小鼠置于其中一个臂的末端，让其在Y迷宫中自由探索8 min，记录并分析小鼠进入迷宫各臂的顺序、时间及次数。小鼠在迷宫臂中的转移顺序（如ABC， ?BAC， CBA而不算ABA）作为一次交替，从而反映了小鼠的辨别及记忆能力。详细操作步骤见文献[27]。实验测试指标：小鼠进臂的交替次数和进臂总次数。计算小鼠的交替率，交替率=[交替次数/（进臂总次数-2）]×100%。

2.2.3?脑皮层神经元树突棘的活体荧光成像?在荧光成像前，将2.5月龄的荧光小鼠麻醉，清理小鼠头顶目标区域的毛发，剪开头皮，暴露出颅骨。清理干净后，利用立体定位法确定所要观察及成像的目标区域。先将两个不锈钢钉平行固定于特制的金属板上，然后利用502胶水将打磨之后的小鼠颅骨粘在不锈钢钉上，随后用牙科水泥对颅骨进一步固定，固定完成后，在解剖镜下用微型牙科钻对颅骨进行打薄处理，直径约为0.5～1 mm，颅骨的厚度磨薄至约20 μm。在暴露的小鼠颅骨上滴加人工脑脊液（ACSF）浸润，防止打磨完后的脑组织长时间暴露在外面而引起损伤。随后将小鼠放置于双光子成像系统下进行荧光成像。成像完成后，待小鼠清醒，将其放回原笼中继续饲养1个月。当小鼠到达3.5月龄后，按照同样的方法，对同一位置重复成像。实验测试的指标主要包括树突棘的形态及数量。利用ImageJ 和Graphpad Prism7软件对图像中神经元树突棘进行统计和分析。

2.2.4?金属离子的电感耦合等离子体质谱检测?小鼠完成相关行为学实验后，麻醉处死，取出大脑，准确称量左半脑的重量，加入10 mL 10%的电子级纯度HNO3，装入消解管在微波消解仪中150℃消解120 min。消解完全后定容至20.0 mL。稀释消化液到适当浓度，采用电感耦合等离子质谱仪（ICP?MS）测定各组小鼠脑组织中9种元素（V、Se、Fe、Cu、Zn、Hg、Bi、Pb、Ni）的含量，同步操作样品空白及质量控制样品。元素测定过程中所使用的仪器均经过国家质检部门检定和校准。ICP?MS测定小鼠脑组织样品时采用外标法和国家一级标准物质人发（GBw09101a）进行质量控制。

2.2.5?統计学分析

采用SPSS17.0软件分析处理数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One?way ANOVA），组间两两比较采用SNK?q检验， p <0.05为差异有统计学意义。

3?结果与讨论

4?结论

以三转基因AD模型小鼠3×Tg?AD为研究对象，通过旷场实验＼，十字迷宫和丫迷宫3种行为学实验检测，发现BEOV可以显著改善4月龄AD小鼠的自发活动和探索记忆能力，减轻小鼠的焦虑状态。通过在体观测小鼠脑神经元树突棘的变化，发现补充BEOV能抑制AD?YFP小鼠脑神经元树突棘的减少，显著增加总树突棘、蘑菇型树突棘、细小型树突棘的数量。通过检测小鼠脑组织中金属离子含量的变化，发现BEOV能显著提高AD小鼠脑组织中V和Se含量水平、降低Fe、Zn、Hg、Pb、Bi、Ni含量水平。研究结果表明， BEOV能通过调控AD鼠脑中金属离子的内稳态平衡，保护神经细胞，抑制AD小鼠神经元树突棘丢失，从而干预AD病理进程。

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Application of in Vivo Fluorescence Imaging and Metal Ion

Detection for Investigation of Bis（ethylmaltolato）

Oxidovanadiumon Alzheimer's Disease

HE Zhi?Jun1， BAI Yang2， ZHAO Qiong?Hui4， OUYANG Pei1， NI Jia?Zuan1，

LIU Qiong*1， GAN Wen?Biao*2， ZHANG Xue?Ji*3

1（College of Life Sciences & Oceanography， Shenzhen University， Shenzhen 518055， China）

2（Key Laboratory of Chemical Genomics， Peking University Shenzhen Graduate School， Shenzhen 518055， China）

3（College of Biomedical Engineering， Health Science Center， Shenzhen University， Shenzhen 518055， China）

4（Shenzhen Food Inspection Center of CIQ， Shenzhen 518042， China）

Abstract?Alzheimer's disease （AD） is a major type of dementia in the elderly. Clinical medication at present can only relieve symptoms but has no therapeutical effect. Thus， it is urgent to develop an effective drug for the treatment of AD. In this study， 2?month?old triple transgenic AD model mice （3×Tg?AD） were treated respectively with 0.2 and 1.0 mmol/L bis（ethylmaltolato） oxidovanadium IV （BEOV） in drinking water for 2 months. The open field test， the elevated plus?maze test and the Y maze test were applied to those mice， showing that BEOV could significantly improve the exploratory ability， memory capacity and exercise ability and relieve the anxiety of 4?month?old 3×Tg?AD mice. The dendritic spines of pyramidal neurons in neocortex were detected by in?vivo two?photon imaging of YFP and AD?YFP mice （the offspring of 3×Tg?AD and YFP mice）. The numbers of dendritic spines increased in YFP mice but decreased in AD?YFP mice from 2.5?month?old to 3.5?month?old. Treatment with 1.0 mmol/L BEOV in the AD?YFP mice significantly increased the numbers of total dendritic spines， mushroom spines and thin spines， which suggested that BEOV could protect cortical neurons and reduce the loss of dendritic spines. The levels of metal ions in the brain of mice were further measured by inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP?MS）. The results showed that 1.0 mmol/L BEOV could significantly increase the levels of V and Se and decrease the levels of Fe， Zn， Hg， Pb， Bi and Ni in AD brains， implying that vanadium might synergize with selenium to regulate the levels of metal ions in AD mice. Summarily， BEOV could mediate the homeostasis of multiple metal ions in AD brain and protect cortical neurons and thus to interfere with the pathological process of AD.

Keywords?Alzheimer's disease; Bis（ethylmaltolato） oxidovanadium IV; In?vivo fluorescence imaging; Dendritic spines; Inductively coupled plasma mass spectrometry

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