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标题 超高效液相色谱—串联质谱法同时检测人血浆中6种芥子气染毒标识物
范文 梁龙辉 刘石磊 刘昌财 黄桂兰 向宇 李欣海 于惠兰



摘要 针对芥子气（HD）染毒血浆的溯源性分析需求，采用超高效液相色谱串联质谱技术（UHPLCMS/MS），建立了人血漿中6种HD生物标识物（TDG，TDGO，SMO，SBMSE，MSMTESE，SBSNAE）的高灵敏度和专属性检测方法。应用甲醇和乙腈混合有机溶剂沉淀HD染毒血浆中的蛋白，然后用HLB柱固相萃取（SPE）纯化，经超高效液相色谱梯度洗脱分离，在三重四极杆串联质谱正离子多反应监测（MRM）模式下进行定性与定量检测。结果表明，6种目标物的线性范围为0.05～500ng/mL（R2=0.9840～0.9955），检测限在0.01～1.0ng/mL之间，各分析物的精密度（n=5）≤5.5%，加标回收率在86.5%～110.8%之间。本方法通过SPE的引入和UHPLC程序的优化，有效地解决了基质背景对分析可靠性的影响问题，并成功应用于国际禁止化学武器组织（OPCW）第5次生物医学样品分析演练HD染毒血浆样品的鉴定。
关键词超高效液相色谱串联质谱；芥子气；生物标识物；血浆
1引言
芥子气（HD）是一种糜烂性化学毒剂，化学名为2，2′二氯二乙硫醚，可通过吸入、皮肤和眼睛暴露等方式中毒，造成皮肤、眼睛、呼吸道等出现不同程度的损伤[1，2＼]。两次世界大战以及80年代爆发的两伊战争中都使用了大量HD，造成了大量军民伤亡[3～5＼]。侵华日军战败后在中国境内遗弃了大量包括芥子气在内的化学毒剂，长期以来对环境以及附近平民都造成了严重危害[6，7＼]。1997年OPCW发布并生效的《化学武器公约》（CWC）严格禁止了HD的生产、储存和使用，但至今其销毁工作还未完成；同时由于HD容易生产、性质稳定，一旦被不法分子利用，还会极大地威胁公共安全。因此，有必要发展并建立灵敏、可靠的分析方法对HD染毒样品进行准确鉴定，对违约使用的调查取证、染毒人员的诊断救治都具有重要意义[8＼]。
HD含有两个亲电中心，进入生物体后迅速分布于各组织中，发生代谢反应可能生成水解氧化产物、β裂解产物和大分子加合物等一系列化合物[9，10＼]。这些代谢物按照其来源及特点分为两类：小分子游离代谢物和大分子加合代谢物[11～13＼]。小分子游离代谢物包括硫二甘醇（TDG）、硫二甘醇亚砜（TDGO）及芥子气亚砜（SMO）等水解、氧化产物，以及与谷胱甘肽加合后经β裂解酶作用产生的1，1′磺酰基双＼[2（甲基亚磺酰基）乙烷＼]（SBMSE），1甲基亚磺酰基2＼[2（甲硫基）乙基磺酰基＼]乙烷（MSMTESE），1，1′磺酰基双＼[2S（N乙酰半胱氨酰基）乙烷＼]（SBSNAE）等β裂解产物（如图1所示）。在小分子代谢物中，虽然文献＼[5＼]报道了在生物体内检测出痕量的内源性TDG和TDGO，但在HD染毒的生物医学样品中，TDG与TDGO的浓度显著升高，而且这些化合物均具有HD的结构特征，因此，这些小分子代谢物均可作为HD生物标识物[11＼]。与大分子加合物相比，小分子标识物在芥子气暴露后很快出现在体液中，能够在体内存在数日至两周，并且具有检测快速的优点，是染毒早期快速诊断的理想标识物。
对于HD小分子标识物的分析，大多采用GCMS/MS或LCMS/MS等技术分析其衍生产物或原体[14～17＼]，但由于不同标识物的性质差异，这些报道大都只针对单个或两个标识物进行分析。但HD染毒剂量、方式以及染毒时间的不同所产生的生物标识物也不尽相同[16＼]，因此，所建立的方法应能更广泛用于标识物和样品的分析。直到2013年，Li等[18＼]报道了将血浆蛋白沉淀后直接进行LCMS/MS的分析方法，可同时检测7种HD游离代谢物。方法制备简单、耗时短，取得了较好的结果。但该方法中血浆经蛋白经沉淀直接分析，基质依然复杂，背景中存在大量干扰峰，分析大量样品后会造成色谱柱压升高、响应降低、仪器稳定性变差等问题。
针对以上情况，本研究引入SPE制备方法，并优化了UHPLC的梯度洗脱程序，建立了血浆中6种HD标识物（TDGO，SBMSE，SBSNAE，TDG，MSMTESE和SMO）的UHPLCMS/MS定量分析方法。实验结果表明，本方灵敏度高、选择性好、样品基质纯净，大批量样品分析响应稳定、重复性好。JP
2实验部分
2.1仪器、材料及试剂
1290超高效液相色谱系统（美国Agilent公司）；6460型三重四极杆串联质谱系统（美国Agilent公司）；Centrifuge5424型高速离心机（德国Eppendorf公司）；NEVAP111型氮气吹干仪（美国OrganomationAssociates公司）。
HD、TDG、TDGO、SMO、SBMSE、MSMTESE及SBSNAE（均由本单位合成，NMR分析纯度>95%）；HLB固相萃取柱（500mg/6mL，美国Waters公司）；水、甲醇、乙腈（色谱纯，美国Honeywell公司）；甲酸铵（美国RoeScientific公司）；健康人血浆部分由北京红十字中心提供，部分来自于本实验室的自愿者。JP
2.2安全措施
所有涉及到芥子气的操作，如取用、配制和染毒过程均需要佩戴相应的防护器材，并在通风良好的状况下进行；以NaOH乙醇（1KG-3∶KG-510～1KG-3∶KG-511，V/V）混合溶液作为洗消剂，各种直接接触芥子气的实验器材在使用后立即洗消。
2.3染毒及加标血浆的制备
用乙腈配制1.0mg/mLHD标准工作液，吸取4.0μL标准工作液，加入4.0mL空白血浆，混匀、37℃振荡反应12h，得到1.0μg/mLHD染毒血浆储备液。用纯水配制6种HD标识物的混合标准液，各标识物浓度均为100μg/mL，用空白血浆稀释为0.01～500ng/mL的加标血浆。以上储备液均于
20℃保存。
2.4样品制备
参照文献＼[18＼]方法对血浆样品进行蛋白沉淀。0.5mL血浆中加入2.0mL乙腈甲醇（4KG-3∶KG-51，V/V），涡旋混匀，6100r/min离心5min，移取上清液。向沉淀中继续加入1.0mL乙腈甲醇（4KG-3∶KG-51，V/V），涡旋混匀、12200r/min离心5min，将两次的上清液合并，氮气吹干，1.0mL纯水复溶，离心收集上清液，加入60μL1.4%氨水准备进行SPE。
先后用5mL甲醇、12mL水和5mL1.4%氨水平衡HLB柱；上样，分别用3mL1.4%氨水和2mL2%甲醇1.4%氨水淋洗；最后用4mL含2%甲酸甲醇进行洗脱；浓缩洗脱液至近干，加入0.15mL纯水复溶，离心后取上清液进行LCMS分析。
2.5液相色谱质谱分析条件
色谱条件：ZorbaxEclipsePlusC18色谱柱（100mm×2.1mm，1.8μm，美国Agilent公司）；流动相A为5mmol/L甲酸铵溶液，B为含5mmol/L甲酸铵的甲醇溶液；洗脱梯度：0～2.5min，5%～10%B；2.5～5.0min，10%～100%B；5.0～8.0min，100%B；8.0～8.1min，100%～5%B，运行3min；流速0.3mL/min；柱温40℃；进样体积10μL。
质谱条件：在ESI+模式下采用MRM方式扫描，应用4个时间段扫描6个目标物的定量及定性离子对，0～1.75min扫描SBSME和TDGO；1.75～3.60min扫描SBSNAE和TDG；3.60～4.65min内扫描MSMTESE；4.65min后扫描SMO。毛细管电压4.0kV，离子源温度350℃；雾化气压力35psi；碰撞加速电压3V，权重为1/x。其它参数见表1。
3结果与讨论
3.1固相萃取条件的选择
与文献＼[18＼]相比，针对血浆基质的复杂性，增加了固相萃取步骤，目标是进一步除去基质中的背景干扰物，使制备后的样品更加纯净，提高检测灵敏度和定量稳定性。6种化合物的极性顺序为TDGO>SBMSE>SBSNAE>TDG>MSMTESE>SMO，其中TDGO与SBMSE，SBSNAE与TDG，MSMTESE与SMO的极性相近，因此，选择3种化合物SBMSE、TDG和MSMTESE进行血浆加标（浓度均为10ng/mL），考察了BondElutePlexa（60mg，3mL），SampliQPSDVB（500mg，6mL），HLB（500mg，6mL），以及HLB（60mg，3mL）JP4种SPE柱的富集效果，结果见图2。
BondElutePlexa柱的填料为疏水性的二乙烯及苯基聚合物，主要用于富集弱极性化合物，而SBMSE及TDG等目标物的极性相对较强，因此回收率低。而PSDVB柱的填料为聚苯乙烯二乙烯基苯共聚物，适用于从水溶液中提取极性芳香化合物，如苯酚等，不适于本文目标物的富集。HLB采用二乙烯苯和N乙烯基吡咯烷酮的亲水亲脂两性填料，可富集的化合物极性范围更宽。此外，还考察了60mg小柱床的HLB柱，以期在不损失回收率的情况下，减少背景干扰，但实验结果表明60mg的SPE柱的容量有限，回收率偏低，不适于0.5mL血浆样品的富集。因此，经比较，本实验最终选择回收率最高的HLB（500mg/6mL）柱对6种HD标识物的加标样品进行SPE纯化。
目标化合物都显弱碱性，加入60μL1.4%氨水，目的是降低目标化合物的极性，增强与HLB柱填料疏水基团的结合。经过比较考察，最终选择先用3.0mL1.4%氨水淋洗残留在柱上的杂质，再用2.0mL含1.4%氨水的2%甲醇淋洗柱子上非特异性结合的极性干扰物。此外，向洗脱液中添加2%甲酸是为了降低目标物在HLB柱上的结合力，使其更容易被洗脱。实验结果表明，SPE在有效富集目标物的同时，除去了血浆基质中的大量背景干扰，色谱图基线干净（图3），延长了色谱柱的使用寿命。
3.2UHPLCMS/MS方法的优化
根据6种化合物的理化性质及三重四极杆质谱的特点，在ESI+模式下应用Masshunteroptimizer軟件对每一个目标化合物的分析参数进行优化，结果见表1。为了在较短时间内获得良好的分离效果，对洗脱程序进行优化。由于TDGO和SBMSE这两种化合物极性很强，所以在前2.5min内没有采用等度平衡程序，目的是将目标物与基质中的强极性背景化合物进行分离，减少干扰；MSMTESE和SMO在色谱柱上保留较好，为了缩短分析时间，采用快速梯度洗脱程序对目标物进行洗脱。在优化的洗脱条件下，6种HD标识物在6min内均有较好的分离（图3），TDG和SBSNAE的保留时间重合，可通过MRM离子对m/z的差异进行区分。此外，本研究采用4个时间段同时分析6个HD代谢物的12个MRM离子对，使每个峰能获得定量分析所需的足够扫描点数，改善峰形和灵敏度。
3.3方法学考察
3.3.1专属性在最佳色谱质谱条件下，测试溶剂空白（纯水）、空白血浆、加标血浆（6种标识物浓度均为50ng/mL）和HD染毒血浆（100ng/mL）样品。溶剂空白中未检出任何相关化合物（图4A），表明仪器系统中没有相关背景干扰。空白血浆中仅检测到少量内源性TDGO和TDG（图4B），浓度分别为2～8ng/mL和0～5ng/mL，与文献[5]报道一致。50ng/mL加标血浆样品中6种化合物的响应良好（图5A）。在100ng/mLHD染毒血浆中发现了显著高于空白血浆的TDGO和TDG，可以作为HD染毒依据（图5B）。在体外染毒血浆样品中没有检测到SMO的原因是在低浓度染毒时HD主要发生水解反应，自身氧化反应很少[8＼]。β裂解产物是由HD与谷胱甘肽的加合物在β裂解酶的作用下而生成，但谷胱甘肽主要存在于血细胞中，离心后的血浆中谷胱甘肽含量极少，所以未检测到。但是，在真实染毒患者体内，HD既可能发生水解、氧化反应，还可能与血液中的谷胱甘肽充分反应后释放出β裂解产物，染毒人员血液经离心得到的血浆中可能存在水解氧化及β裂解标识物[18＼]。因此，本方法依然可应用于真实HD染毒患者体内代谢后的血浆样品分析。4种样品的MRM色谱图比较结果显示，空白血浆中除低水平的TDGO和TDG内源性本底外，无其它干扰物，表明本方法专属性较好。
3.3.2线性范围、方法检出限及定量限为了降低基质效应对检测准确度的影响，本研究采用基质标准曲线外标法进行定量分析。将浓度为0.01～500ng/mL的加标血浆按照2.4和2.5节进行处理分析。以目标物的浓度和峰面积进行线性回归，权重为1/x，绘制定量标准曲线。以响应显著高于空白血浆且信噪比为3对应的浓度作为方法的检出限（LOD），信噪比为5且相对标准偏差（RSD）低于20%所对应的浓度作为方法的定量限（LOQ）[18＼]，结果见表2。6种目标物均有较宽的线性范围，SBMSE、SBSNAE和MSMTESE的检出限与文献＼[18＼]报道一致，而SMO、TDG与TDGO的灵敏度比文献值提高了5～10倍（表3）。
3.3.3加标回收率与精密度对5，150和450ng/mL的加标血浆质量控制样品（LQC，MQC和HQC）进行平行处理并分析，每个样品重复测定5次。计算各目标化合物的精密度和回收率，结果见表4。6种化合物的回收率在86.5%以上，RSD<5.5%，均符合方法学要求。
3.4HD染毒样品分析
CM（42OPCW在2015年第5次生物医学样品分析演练中提供了6份怀疑HD中毒人员的血浆样品CM）LM
（A～F），和1份空白血浆（M）。采用所建方法对所ZH（有
样品进行定性及定量分析，检测结果见图6。在C样品中检测到的TDG及TDGO与血浆基质M一致，所以确定C样品为空白血浆；在A，B，D，E和F样品中都检测到高于内源水平的TDG与TDGO，根据检测得到TDG与TDGO的含量大小，得出样品染毒浓度顺序为F>A>E>D>B。OPCW发布的结果中C为空白血浆，A，B，D，E和F分别为100，10，40，50和150ng/mLHD染毒血浆，说明本方法的CM（21*3/4检测结果与OPCW官方提供的染毒信息一致。空CM）ZH）
白血浆中内源TDG与TDGO的分析结果表明，HD对血浆的染毒浓度在10ng/mL以上时，可利用TDG和TDGO作为标识物进行HD的溯源性分析，而之前未有此方面报道。另外有意义的是，本方法检测到的TDG与TDGO的浓度和与HD染毒浓度（10～150ng/mL，OPCW提供）呈良好的线性关系，这使得依据检测染毒血浆样品中标识物的浓度检测实际HD染毒浓度成为可能，但由于代谢物的浓度还与染毒时间密切相关，特别是在体内染毒情况下，因此，代谢标识物与染毒浓度之间的关系还需要进行深入探讨。
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、
AbstractAsensitivemethodwasdevelopedforthesimulationdeterminationofsixkindsofsulfurmustards（HD）biomarkers（TDGO，SBMSE，SBSNAE，TDG，MSMTESEandSMO）inhumanplasmabyultrahighperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry（UHPLCMS/MS）.HDexposedplasmasampleswerepretreatedwithamixedsolventofmethanolandacetonitriletoprecipitateproteins.Asolidphaseextraction（SPE）methodwithHLBcartridgewasusedtopurifythetargetbiomarkersfromthematrix.AcompleteseparationwasachievedonanUHPLCsystemwithagradientelution.Thequalitativeandquantitativeanalyseswerecarriedoutbytriplequadrupoletandemmassspectrometryinmultiplereactionmonitoring（MRM）mode.Theresultsshowedthatthecalibrationcurvesforthe6biomarkerswerelinear（R2=0.9840-0.9955）overtherangefrom0.05to500ng/mL，withthelimitsofdetection（LODs）of0.01-1.0ng/mL.Therelativestandarddeviation（RSD，n=5）was≤5.5%，andtherecoveryoftheanalytesrangedfrom86.5%to110.8%.Theinfluenceofthematrixbackgroundsonthemethod'srobustnesswaseffectivelydiminishedbyintroducingSPEprocedureandbyoptimizingtheUHPLCelutionprogram.ThemethodwassuccessfullyappliedtothefifthbiomedicalsampleanalysisexerciseorganizedbytheOrganizationfortheProhibitionofChemicalWeapons（OPCW）.
KeywordsUltrahighperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry；Sulfurmustard；Biomarkers；Plasma
HQWT6JY（Received8May2016；accepted23August2016）
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更新时间：2025/2/11 9:00:15