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拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基响应面优化

范文

周罗娜赵兴丽周玉锋刘辉罗林丽贺圣凌陈银翠

摘要：为优化对茶炭疽病菌有拮抗作用的木霉菌发酵培养基，以木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径为优化指标，在单因素实验的基础上，进行响应面优化，建立了发酵培养基优化模型，获得了最优发酵培养基配比如下：葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氢二钾0.86g/L、硫酸亚铁0.63g/L。在此条件下，木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径为3.01cm，比未优化前的菌落直径缩小了13%。

关键词：木霉菌;发酵液;茶炭疽菌;响应面法

中图分类号 S476.8;TQ920.1文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）18-0096-06

Optimization of the Fermentation Medium of Trichoderma Antagonistic to Colletotrichum Gloeosporioides

ZHOU Luona1 et al.

（1Institute of Biological Technology，Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang 550006，China）

Abstract：In order to optimize the fermentation medium of Trichoderma.which had antagonistic effect on tea anthrax，the optimal model of fermentation medium was established by using the colony diameter of Trichoderma. treated with fermentation broth.The optimum ratio of fermentation medium was glucose 18.34g/L、yeast extract 1.88g/L、potassium hydrogen phosphate 0.86g/L、ferrous sulfate 0.63g/L.At this condition，the diameter of Colletotrichum gloeosporioides colony was 3.01cm，which was 13% smaller than that before optimization.

Key words：Trichoderma;Fermentation broth;Colletotrichum gloeosporioides;Response surface method

茶炭疽病是一種由真菌引起的、茶树上常见的叶部病害[1]，在我国各个茶区均有发生，通常在贵州、浙江、福建等雨水多、湿度大的省份发生较多[2-4]。该病主要由炭疽菌（Collectotrichums spp）引起，病菌多从嫩叶侵入，在茶树成叶上发病，使得叶片焦枯、掉落，影响茶树光合作用[5]，导致茶叶减产。目前防治炭疽病主要是利用抗病品种，但当病害发生严重时，仍采用传统的化学农药防治方法为主[6]。然而，农药残留不仅对茶叶品质造成严重影响，而且还会导致生态系统恶化等严重问题。因此，研究开发和使用无毒、无污染、环境相容性好的生物农药是大势所趋，生物防治是实现农业可持续发展的重要途径。

木霉菌（Trichoderma spp）作为生防菌剂是近年来研究开发的热点。木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科的真菌，广泛存在于土壤、空气和植物体表面等生态环境中。目前，通过大量研究已经成功鉴定得到了21个种类[7-8]。国内外许多学者将木霉菌制剂用于防治植物病害，如纹枯病（Rhizoctonia solani）[9-11]、稻瘟病（Pyricularia grisea）[12-13]、水稻恶苗病（Fusarium moniliforme）[14-15]，并取得了较好的效果。笔者对1株具有拮抗茶炭疽病菌作用的木霉菌进行液体发酵培养基优化，以尽可能提高木霉菌发酵液中抑制茶炭疽病菌生长的物质含量，在一定程度上节约成本，提高发酵效率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种木霉菌（Trichoderma asperelloides）、茶炭疽病菌（Collectotrichum boninense）均由本实验室分离保存。

1.1.2 仪器与设备 GI100DP灭菌锅（致微（厦门）仪器有限公司）;BSD-YX3400恒温摇床（上海博讯医疗生物仪器有限公司）;SPX-250BⅢ生化培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）;SW-CJ-2D型净化工作台（苏州净化设备有限公司）;艾柯DZG-303A超纯水制备仪;BSA224S-CW电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）。

1.1.3 培养基 PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL。PDB培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL。

1.2 试验方法

1.2.1 木霉菌菌种培养平板活化：在PDA培养基上接种直径5mm木霉菌菌饼，28 ℃ 恒温培养，培养7d。种子液培养：在500mL锥形瓶中装100mL PDB培养基，从平板上挑取菌落接种于摇瓶中，培养温度28℃，摇床转速 120r/min，培养 3d后进行接种发酵。

1.2.2 茶炭疽菌菌种培养平板活化：在PDA培养基上接种直径5mm茶炭疽病菌菌饼，25℃黑暗培养5d。

1.2.3 单因素试验（1）木霉菌发酵液碳源的筛选及浓度确定。不同碳源对木霉菌菌丝生长和产孢的影响：基本培养基为PDA培养基，分别添加20g/L葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、乳糖替代PDA培养基中的碳源，并设置无糖作为对照。在制备好的平板中央接种直径5mm木霉菌菌饼（每组实验设3次生物学重复）28℃恒温培养。48h后采用“十”字交叉法测量菌落生长直径作为菌丝生长状况指标，培养7d后用10mL灭菌ddH2O洗脱菌落孢子制成孢子悬浮液，用血球计数板计数孢子产量，公式如下：

1mL孢子悬浮中的总孢子数=A/5×25×104×B （1）

式中，A：5个中格的总孢子数;B：稀释倍数。

木霉菌发酵液最佳碳源添加量对茶炭疽病菌菌落生长的影响：基本发酵培养基为PDB培养基，最佳碳源添加量分别为0、5、10、15、20、25、30、35g/L，配置完成的培养基115℃灭菌30min。在500mL锥形瓶中装100mL发酵培养基，向培养基中接种2mL种子液，培养温度28℃，摇床转速120r/min，培养5d。

将上述发酵液经抽滤、微滤后取滤液。将滤液与灭菌好的PDA培养基1∶9混合均匀，不添加滤液的PDA培养基作为对照实验。在平板中央接种直径5mm茶炭疽菌菌饼（每组实验设3次生物学重复），25℃黑暗培养5d。采用“十”字交叉法测量并记录茶炭疽病菌菌落生长直径。

（2）木霉菌发酵液氮源的筛选及浓度确定。不同氮源对木霉菌菌丝生长和产孢的影响：在基本培养基PDA中采用最佳碳源添加及其最佳添加量，分别添加硝酸钠，蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、丙氨酸、尿素、硫酸铵，设无氮源为对照，添加量为2g/L，方法同上。木霉菌发酵液最佳氮源添加量对茶炭疽病菌菌落生长的影响：在基本发酵培养基中添加最佳碳源添加量，最佳氮源添加量分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5g/L，方法同上。

（3）木霉菌发酵液磷源的筛选及浓度确定。不同磷源对木霉菌菌丝生长和产孢的影响：在基本培养基PDA中采用最佳碳源添加及其最佳添加量，分别添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，设置无磷源为对照，添加量为1g/L，方法同上。木霉菌发酵液最佳磷源添加量对茶炭疽病菌菌落生长的影响：在基本发酵培养基中添加最佳碳源添加量，最佳磷源添加量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4g/L，方法同上。

（4）木霉菌发酵液微量元素的筛选及浓度确定。不同微量元素对菌丝生长和产孢的影响：在基本培养基PDA中采用最佳碳源及其最佳添加量，分別添加硫酸钠、硫酸亚铁、硫酸钙、硫酸镁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰，并设无微量元素作对照，添加量为0.5g/L，方法同上。木霉菌发酵液最佳微量元素添加量对茶炭疽病菌菌落生长的影响：在基本发酵培养基中添加最佳碳源添加量，最佳微量元素添加量分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7g/L，方法同上。

1.2.4 响应面优化试验根据单因素试验结果和Box-Behnken试验设计原理，以最佳碳源、氮源、磷源、微量元素添加量为响应面考察因素，每个因素设计3个水平，用（-1，0，1）作为编码，以木霉菌发酵液处理后的茶炭疽病菌菌落生长直径作为响应值（Y），使用Design-Expert 10软件进行4因素3水平试验优化，每个处理3次重复。培养基因素水平如表1所示。

2 结果与分析

2.1 木霉菌发酵液的碳源及浓度碳源为菌体的生长代谢提供细胞的基本骨架，也是细胞生命活动的能量来源，会影响次级代谢产物的产量。由图1可知，5种碳源中，添加葡萄糖，木霉菌菌丝生长较快，产孢量较多。

由图2可知，选择葡萄糖为最佳碳源，随着木霉菌发酵液葡萄糖添加量的增大，发酵液抑制茶炭疽菌菌落的直径先减小后增大。葡萄糖添加量为20g/L时，经木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径最小，仅为4.11cm，抑菌效果最好。后续单因素试验中，选择葡萄糖添加量为20g/L。

2.2 木霉菌发酵液的氮源及浓度菌体的生长和各种初级、次级代谢产物等含氮物质的合成都需要氮源，氮源在发酵过程中还起着调节菌体生长及生物量的作用。由图3可知，木霉菌对有机氮源利用效果比无机氮源好，其中酵母浸膏效果最好。

在选择酵母浸膏为最佳氮源的条件下，在木霉菌发酵培养基中加入不同浓度的酵母浸膏进行发酵，结果如图4所示。由图4可知，木霉菌发酵液的抑菌活性在酵母浸膏浓度为1.5g/L时最强，抑菌效果最好，经木霉菌发酵液处理后的茶炭疽病菌菌落直径为3.89cm，之后随着酵母浸膏浓度的进一步增加，抑菌效果反而降低。因此，选择最佳酵母浸膏浓度为1.5g/L。

2.3 木霉菌发酵液的磷源及浓度磷主要作用是维持菌体细胞结构的稳定性。由图5可知，添加磷酸氢二钾对木霉菌菌丝生长和产孢有促进作用，添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾对菌丝生长及产孢略有抑制作用。

由图6可知，选择磷酸氢二钾为最佳发酵磷源，木霉菌发酵液的抑菌活性在磷酸氢二钾浓度为1g/L时最高，经木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径最小，仅为4.02cm，抑菌效果最好。因此，选择最佳磷酸氢二钾浓度为1g/L。

2.4 木霉菌发酵液的微量元素及浓度菌体的生长和发酵产物的形成需要一些微量元素作为酶的辅基或激活剂。由图7可知，微量元素的添加对木霉菌菌丝生长及产孢影响不大，其中，添加硫酸亚铁对菌丝生长和产孢略有促进作用，而添加硫酸锌、硫酸锰、硫酸钙、硫酸铜、硫酸钠、硫酸镁略有抑制作用。

由图8可知，选择硫酸亚铁为最佳发酵微量元素，木霉菌发酵液的抑菌活性在硫酸亚铁浓度为0.6g/L时最高，经木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径最小，为3.52cm，抑菌效果最好，因此选择最佳硫酸亚铁浓度为0.6g/L。

2.5 响应面优化试验

2.5.1 响应面试验结果根据单因素试验结果和Box-Behnken试验设计原理，选择葡萄糖、酵母浸膏、磷酸氢二钾、硫酸亚铁作为自变量，以经木霉菌发酵液处理后茶炭疽病菌菌落生长直径作为响应值，进行4因素3水平响应面优化试验。试验设计方案及结果如表2所示。

2.5.2 模型及显著性根据表2的实验结果，运用Design expert 10.0软件对结果进行回归拟合，得到如下回归方程：

Y=3.37+0.85A-0.42B+0.087C+0.29D-0.058AB-0.087AC-0.29AD+1.15BC-0.43BD+0.79CD+0.98A2+1.01B2+0.64C2+0.32D2

由表3可知，该模型P<0.0001，说明模型是极显著的;模型相关系数R2=0.9508，表明模型拟合较好;模型失拟项的P值为0.7556，差异不显著，表明该模型符合实际情况。试验结果表明，4个因素对木霉菌发酵液抑菌效果的影响大小依次为：葡萄糖>酵母浸膏>硫酸亚铁>磷酸氢二钾。由回归方程系数显著性检验可知：A、B、BC、CD、A2、B2、C2差异极显著（P<0.01），D、BD、D2差异显著（P<0.05），其他不显著。

2.5.3 木霉菌发酵的最佳培养基通过Design-expert软件绘制响应面图对试验结果进行可视化分析。从响应面三维图（图9）可看出，该方程的抛物线图形开口均向上，说明方程存在最小值。由软件分析得到木霉菌发酵培养基中添加葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氢二钾0.86g/L、硫酸亚铁0.63g/L时，木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径为2.98cm。

为验证响应面法所得结果的可靠性，按照响应面确定的各因素最优浓度配制木霉菌发酵培养基进行3次试实验验证。在试验条件下，木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径为3.01cm，与预测值接近，说明响应面可运用于实际预测。

3 结论与讨论

以木霉菌为研究对象，对其发酵液抑制茶炭疽菌的活性进行研究，并利用响应面优化其液体发酵培养基。结果表明：木霉菌液体发酵培养基的最优配比为葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氢二钾0.86g/L、硫酸亚铁0.63g/L;在此条件下，木霉菌发酵液处理后茶炭疽菌菌落直径为3.01cm，与未优化的发酵培养基处理后的茶炭疽菌菌落直径（约为3.46cm）相比，茶炭疽菌菌落直径缩小了13%。后续将对发酵液中的小分子物质、脂溶性物质、水溶性物质分离、纯化后进行下一步的研究，以期得到更稳定、高效的木霉菌抑制茶炭疽菌制剂。

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（責编：徐世红）

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