| 标题 | 四神丸对脾肾阳虚泄泻大鼠胃窦组织Ghrelin—CaM—MLCK信号通路的影响 |
| 范文 | 蔺晓源+邓娜+蔡莹+刘芳 摘要：目的 观察四神丸对脾肾阳虚型泄泻模型大鼠胃窦组织Ghrelin-CaM-MLCK信号通路的影响，探讨其作用机制。方法 采用灌服腺嘌呤和番泻叶水煎剂制作脾肾阳虚型泄泻大鼠模型。将72只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组和四神丸高、中、低剂量组，每组12只。各给药组给予相应药物灌胃，连续14 d，免疫组化和Western blot分别检测胃窦组织脑肠肽胃促生长素（Ghrelin）及其受体（GHSR）、钙调素（CaM）、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的蛋白表达。结果 模型组大鼠胃窦组织Ghrelin、GHSR、CaM和MLCK蛋白表达均较正常组明显升高（P<0.01）；各给药组上述指标蛋白表达均明显低于模型组（P<0.05，P<0.01），且以四神丸高剂量组最为明显。结论 四神丸对脾肾阳虚泄泻模型大鼠的作用可能与调节Ghrelin-CaM-MLCK信号通路指标的蛋白表达有关。 关键词：四神丸；泄泻；胃促生长素；胃促生长素受体；钙调素；肌球蛋白轻链激酶；大鼠 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.009 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）12-0034-04 Effects of Sishen Pills on Ghrelin-CaM-MLCK Signaling Pathway in Sinuses Ventriculi of Rats with Diarrhea of Yang Deficieney of Spleen and Kidney LIN Xiao-yuan1， DENG Na2， CAI Ying2， LIU Fang1 （1. First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China； 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China） Abstract： Objective To explore the effects of Sishen Pills on Ghrelin-CaM-MLCK signaling pathway with sinuses ventriculi in diarrhea rats of yang deficieney of spleen and kidney； To discuss its mechanism of action. Methods A model rats with diarrhea model of yang deficieney of spleen and kidney was established by treated with intragastric administration of adenine and Senna water decoction to replicate. 72 SD rats were randomly divided into normal group， model group， positive medicine group， Sishen Pills high-， medium- and low-dose groups， with 12 rats in each group. Each medication group was given relevant medicine for gavage， for 14 days. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expressions of Ghrelin and GHSR， CaM， and MLCK protein in the sinuses ventriculi. Results In the model group， Ghrelin， GHSR， CaM and MLCK protein expressions of the sinuses ventriculi significantly increased （P<0.01）. In each medication group， protein expression of the indexes was lower than the model group （P<0.05， P<0.01）. The Sishen Pills high-dose group was particularly obvious. Conclusion The effect of Sishen Pills on diarrhea model rats of yang deficieney of spleen and kidney may be associated with regulation of index protein expression in Ghrelin-CaM-MLCK signaling pathway. Key words： Sishen Pills； diarrhea； Ghrelin； GHSR； CaM； MLCK； rats 基金項目：国家自然科学基金（81403380）；湖南省教育厅科研项目（15B178、17C1636） 通讯作者：刘芳，E-mail：2289797960@qq.com 泄泻可见于肠易激综合征等多种消化道疾病导致的腹泻，其发病率和复发率高，治愈难度大，严重影响人们的身心健康。四神丸临床治疗脾肾阳虚型泄泻疗效显著[1-2]，但其作用机制目前尚未明了。随着生物-心理-社会医学模式的提出，以及神经胃肠病学研究的发展，脑肠轴调控下的胃肠运动变化与泄泻的发病机制相关[3-4]。本研究观察四神丸对脾肾阳虚泄泻模型大鼠胃窦组织脑肠肽胃促生长素（Ghrelin）及其受体（GHSR）、钙调素（CaM）、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的影响，为揭示四神丸治疗脾肾阳虚泄泻的作用靶点提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 动物 雄性SPF级SD大鼠72只，6～7周龄，体质量（200±20）g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2013-0004。饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF级实验动物房。 1.2 药物及制备 四神丸，北京同仁堂天然药物（唐山）有限公司，批号14080012，研碎后过筛，用蒸馏水配制，浓缩成0.732、0.366、0.183 g/mL的混悬液，置于4 ℃冰箱备用；匹维溴铵片，法国苏威制药公司，批号637882，研碎后过筛，配制成1.523 mg/mL的药液备用；腺嘌呤（Solarbio，Lot.No.617D051），配制成0.02 g/mL的悬浊液；番泻叶，购于长沙老百姓大药房，冷水浸1 h后加水煮沸约10 min，过滤浓缩成1.0 g/mL的药液。 1.3 主要试剂与仪器 Ghrelin兔抗多克隆抗体（LSBIO，72557），GHSR兔抗多克隆抗体（Abcam，GR80260-1），CaM兔抗多克隆抗体（Abcam，GR56360-17），MLCK兔抗多克隆抗体（Abcam，GR125269-7），BCA蛋白浓度测定试剂盒（Bioswamp），蛋白质Marker（Thermo），PV-6001免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。CheemiDoc XRS+Imager化学发光系统（美国Bio-rad），BX51显微镜和Image-Pro Express图像分析系统（日本Olympus公司），RM2235切片机（德国Laica公司），Lynx6000落地式高速离心机（美国Thermo Fisher），Pureloab Classic UVF超纯水仪（法国ELGA Labwater）。 1.4 造模 参考文献[5]方法造模。每只大鼠予0.2 g/kg腺嘌呤灌胃4周，并单、双日交替喂养甘蓝（10 g/只）和精炼猪油（2 mL/只），第3周起再灌服冰番泻叶水浸剂2周。 1.5 分组和给药 所有大鼠适应性喂养1周后，先根据体质量采用随机数字法取12只作为正常组，不予造模，其余60只造模后再随机分为模型組、阳性药组和四神丸高、中、低剂量组，每组12只。四神丸高、中、低剂量组大鼠分别给予7.32、3.66、1.83 mg/（kg·d）灌胃（相当于成人等效剂量的4、2、1倍），阳性药组给予匹维溴铵15.23 mg/（kg·d）灌胃，模型组给予等量蒸馏水，正常组常规喂养。各组给药体积均为10 mL/kg，每日1次，连续14 d。 1.6 取材 各组大鼠末次给药后10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，置于冰盒上迅速取出胃窦，剪取小段置于冻存管放入液氮中保存，另取小段用4%多聚甲醛固定保存。 1.7 观察指标 1.7.1 免疫组化检测胃窦组织胃促生长素的蛋白表达 将胃窦组织从多聚甲醛中取出，石蜡包埋，连续切片粘贴于载玻片上；然后二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶；一抗用兔抗大鼠Ghrelin多克隆抗体（1∶8000），PBS替代一抗为阴性对照，4 ℃孵育过夜，DAB显色3～5 min。脱水、透明、封片后用图像分析系统拍摄200倍图像，每张切片置400倍镜下随机选取阳性表达不重复的5个视野，采用图像分析系统测定OD值。其值越大，反映蛋白表达量越高。 1.7.2 Western blot检测胃窦组织胃促生长素受体、钙调素和肌球蛋白轻链激酶的蛋白表达 将冻存胃窦组织取出，进行蛋白提取、定量，每孔上样量为10 μg蛋白，行电泳、湿转膜，分别加入一抗GHSR（1∶500）、CaM（1∶2000）、MLCK（1∶8000）和二抗，显色后将膜置于化学发光系统中检测，以目的条带和GAPDH条带的灰度比值作为蛋白表达水平。 1.8 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 四神丸对胃窦组织胃促生长素蛋白表达的影响 Ghrelin免疫阳性表达在胃窦组织呈棕黄色染色。与正常组比较，模型组胃窦组织Ghrelin蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，各给药组均可下调胃窦组织Ghrelin蛋白表达，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），且以四神丸高剂量组效果最为明显，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1、图1。 2.2 四神丸对胃窦组织胃促生长素受体、钙调素和肌球蛋白轻链激酶蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组胃窦组织GHSR、CaM、MLCK蛋白表达均明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，各给药组均可下调胃窦组织GHSR、CaM、MLCK的蛋白表达，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），且以四神丸高剂量组效果最为明显，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2、图2。 表1 各组大鼠胃窦组织Ghrelin蛋白表达比较（—x±s） 组别 只数 剂量/（mg/kg） Ghrelin 正常组 5 0.38±0.07 模型组 5 0.79±0.14## 阳性药组 5 15.23 0.58±0.11△* 四神丸高剂量组 5 7.32 0.47±0.08△△ 四神丸中剂量组 5 3.66 0.54±0.10△ 四神丸低剂量组 5 1.83 0.65±0.11△* 注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01； 与四神丸高剂量组比较，*P<0.05 正常组 模型组 阳性药组 四神丸高剂量组 四神丸中剂量组 四神丸低剂量组 图1 各组大鼠胃窦组织Ghrelin阳性表达（免疫组化染色，×200） 表2 各组大鼠胃窦组织GHSR、CaM、MLCK蛋白表达比较（—x±s） 组别 只数 剂量/（mg/kg） GHSR CaM MLCK 正常组 5 0.18±0.04 0.16±0.03 0.17±0.04 模型组 5 0.62±0.11## 0.59±0.09## 0.57±0.08## 阳性药组 5 15.23 0.33±0.07△△* 0.27±0.05△△ 0.32±0.07△* 四神丸高剂量组 5 7.32 0.24±0.05△△ 0.20±0.04△△ 0.22±0.04△△ 四神丸中剂量组 5 3.66 0.35±0.08△△* 0.31±0.06△△* 0.33±0.05△* 四神丸低剂量组 5 1.83 0.51±0.10△* 0.46±0.08△* 0.41±0.07△* 注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与四神丸高剂量组比较，*P<0.05 A B C D E F GHSR 41 kD CaM 16 kD MLCK 210 kD GAPDH 36 kD 注：A.正常组；B.模型组；C.阳性药组；D.四神丸高剂量组； E.四神丸中剂量组；F.四神丸低剂量组 图2 各组大鼠胃窦组织GHSR、CaM、MLCK蛋白表达免疫印迹电泳图 3 讨论 脑肠轴异常机制在泄泻的发病中起重要作用，胃肠活动可通过脑肠轴的影响而引起不同脑肠肽的反应来改变[6]。Ghrelin是日本科学家Kojima等首先在大鼠胃黏膜及下丘脑中发现的一种脑肠肽，Ghrelin及其受体GHSR主要分布于胃肠道，其具有调节胃肠运动、促进胃酸分泌、增进食欲、保护消化系统黏膜等重要功能[7]。研究发现，Ghrelin能促进大鼠胃排空、小肠推进及改善胃肠动力[8]；小鼠胃排空的延迟与GHSR缺乏有关[9]。我们前期研究发现，慢性应激所致胃肠运动功能障碍小鼠血清Ghrelin水平降低[10]。现代细胞生物学研究发现，兴奋性脑肠肽Ghrelin对胃肠运动的调节作用与GHSR-G蛋白偶联-Ca2+转导密切相关[11]。胞内三磷酸肌醇受体（IP3R）钙通道的开放有赖于胞外脑肠肽等激动剂与其G蛋白偶联受体结合后激活磷脂酶C（PLC），PLC使磷脂酰肌醇二磷酸水解产生IP3。IP3促使胞内钙库打开，胃肠平滑肌细胞胞浆Ca2+浓度升高，Ca2+与CaM结合后形成Ca2+-CaM复合物激活MLCK，激活的MLCK催化肌球蛋白轻链上的丝氨酸-19磷酸化，导致肌球蛋白头部的ATP酶活性增加，进而引起平滑肌收缩[12]。反之，一旦细胞内Ca2+浓度降低，Ca2+与CaM分离，MLCK活性降低，则引起平滑肌舒张。 泄泻病位在肠，脾失健运是其关键，同时亦与肾脏密切相关。如《灵枢·邪气脏腑病形》认为肾脉“小甚为洞泄”。在此认识的基础上，后世明确提出了脾肾阳虚的五更泄泻。基于“脾肾相关”理论，治当益火补土。《医贯》指出：“命门之火旺，火能生土，而脾亦强。”《内科摘要》之四神丸，君以补骨脂温肾助阳、壮火益土、暖脾止泻；臣以肉豆蔻温中涩肠，佐以吴茱萸助阳止泻，五味子收敛固涩。该方配伍精、药力专，是治疗脾肾阳虚型泄泻的经典名方。我们前期通过成功制作脾肾阳虚泄泻大鼠模型[13]，进行了四神丸治疗泄泻的免疫学机制研究，证实了通过“以方（四神丸）测证（脾肾阳虚）”的效应机制来探讨“脾肾相关”理论的科学内涵这一思路的可行性。研究发现，四神丸对脾肾阳虚泄泻大鼠的作用可能与调节肿瘤坏死因子、白细胞介素（IL）-2、IL-4和外周血T细胞亚群水平有关[14-15]。 本研究结果显示，脾肾阳虚泄泻模型大鼠胃窦组织Ghrelin、GHSR、CaM和MLCK蛋白表达均明显升高，表明模型大鼠胃排空出现亢进状态。给药后发现，四神丸高、中、低劑量均可不同程度下调Ghrelin、GHSR、CaM、MLCK的蛋白表达，且以四神丸高剂量组最为明显，表明四神丸对胃窦的调节作用具有剂量依赖性。四神丸中剂量组上述指标改变与阳性药组比较无明显差异，提示四神丸对该模型大鼠的作用在中剂量上与西药匹维溴铵片效果相当。基于以上研究我们推测，四神丸可能通过调节Ghrelin-CaM-MLCK信号通路指标的表达而抑制胃肠蠕动，达到止泻的目的。同时，本研究可为揭示四神丸治疗脾肾阳虚泄泻的脑肠肽作用机制提供借鉴。 参考文献： [1] 刘弼，陈萍，肖鹏，等.四神丸加味治疗腹泻型肠易激综合征临床观察[J].辽宁中医杂志，2014，41（3）：503-505. 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