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补肾活血汤治疗股骨头坏死的作用机制研究

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施乐张超季文辉

摘要目的：探討补肾活血汤对股骨头坏死的疗效，同时观察其对Wnt-βcatenin信号通路的影响。方法：将45只SD大鼠随机分为空白组、模型组及中药组，每组15只。利用甲泼尼龙琥珀酸钠制备激素性股骨头坏死动物模型，成模后中药组大鼠接受补肾活血汤灌胃，1次/d，空白组及模型组大鼠接受生理盐水灌胃，均连续灌胃6周，比较各组大鼠股骨形态学、骨密度、股骨头病理学、血清钙、磷、股骨头组织Wnt10b、β-Catenin水平变化。结果：1）模型组大鼠股骨头密度高低不同，股骨头毛糙，骨小梁模糊，中药组大鼠股骨头骨小梁数目较模型组增多，且相对清晰，股骨头面较模型组光滑。2）模型组及中药组大鼠骨密度、血清钙、磷水平、股骨头组织Wnt10b、β-Catenin蛋白均明显下降（P<0.05），中药组高于模型组（P<0.05）。3）模型组大鼠股骨头软骨出现明显病理改变;中药组大鼠股骨头结构尚完整，空骨陷窝较模型组减少，软骨细胞排列欠规则。结论：补肾活血汤对股骨头坏死有保护效应，其作用机制与Wnt-βcatenin信号通路有关。

关键词股骨头坏死;大鼠;补肾活血汤;Wnt-βcatenin信号通路

Abstract Objective：To explore the therapeutic effect of Bushen Huoxue decoction on osteonecrosis of the femoral head and its effect on Wnt-β catenin signal pathway. Methods：A total of 45 SD rats were randomly divided into blank group （n=15）， model group （n=15） and traditional Chinese medicine group （n=15）. The animal model of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head was made by methylprednisolone sodium succinate. the rats in the traditional Chinese medicine group were fed with Bushen Huoxue decoction once a day， and the rats in the blank group and model group were fed with normal saline for 6 weeks. The changes of femoral morphology， bone mineral density， pathology of femoral head， serum calcium， phosphorus， Wnt10b and β-Catenin in each group were compared. Results：1） the density of the femoral head of the model group was different， the femoral head was rough and the trabeculae were blurred. The number of trabeculae of the femoral head in the traditional Chinese medicine group was more than that in the model group， and it was relatively clear， and the femoral head in the traditional Chinese medicine group was smoother than that in the model group. 2） the bone mineral density （BMD）， serum calcium and phosphorus levels， Wnt10b and β-Catenin protein in femoral head tissue of rats in model group and traditional Chinese medicine group were all decreased significantly （P<0. 05）. It was higher in the traditional Chinese medicine group than that in the model group （P<0. 05）. 3） there were obvious pathological changes in the cartilage of the femoral head in the model group， the structure of the femoral head in the traditional Chinese medicine group was still intact， the empty lacunae was less than that in the model group， and the arrangement of chondrocytes was irregular. Conclusion：Bushen Huoxue decoction has protective effect on osteonecrosis of femoral head， and its mechanism is related to Wnt-β catenin signal pathway.

Keywords Necrosis of the femoral head; Rat; Bushen Huoxue Decoction; Wnt-β catenin signaling pathway

中图分类号：R242;R274 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.16.005

近年来随着激素在临床使用的逐渐广泛，激素性股骨头坏死的已然成为非创伤性股骨头坏死的主要发病类型[1]，西医多采用外科手术对其进行治疗，但昂贵的手术费用、假体寿命有限、创伤大等影响了治疗依从性。因此，寻求新的临床方案具有重要意义。股骨头坏死属于中医“骨痹”“骨痿”“骨蚀”“骨虚”等范畴，不同辨证思想均认为“肾虚”“血瘀”是贯穿该病发生发展的全过程[2-4]，故“补肾活血”成为治疗股骨头坏死的主要原则。基于此，本团队拟用补肾活血汤对激素性股骨头坏死模型大鼠进行治疗，观察其疗效的同时对其可能相关机制进行研究，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 45只SD大鼠均购自购买自济南金丰实验动物有限公司（许可证号：SCXX（沪）2011-00241），所有动物饲养于本院SPF级动物房内，饲养条件：温度（22.37±0.42）℃，湿度（50±2.5）%，以12/12 h为光暗周期。本课题方案经本院医学伦理会审批通过。

1.1.2 药物补肾活血汤由本院中药研究院提供，中药组成：鹿角胶12 g、土鳖虫12 g、三七6 g、黄芪20 g、牛膝12 g、丹参12 g、当归9 g、菟丝子12 g、女贞子12 g、甘草6 g。

1.1.3 试剂与仪器血清钙试剂盒（上海玉兰生物技术有限公司，货号：2400451），血清磷试剂盒（上海玉兰生物技术有限公司，货号：24283721），Wnt10b一抗（爱必信上海科技有限公司，货号：abs131412），β-catenin一抗抗体（爱必信上海科技有限公司，货号：abs13800），βactin一抗抗体（爱必信上海科技有限公司，货号：abs118937），全自动生化仪（贝克曼库尔特公司，美国，型号：AU5800）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 45只SD大鼠随机分为空白组、模型组及中药组，每组15只，各组大鼠鼠龄、体质量等一般情况比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。参照参考文献[5-6]，对模型组及中药组大鼠进行腹腔注射大肠杆菌，剂量为97.92 μg/kg，24 h注射1次，共注射2次，每次之间间隔24 h。第2次腹腔注射大肠杆菌后24 h肌肉注射甲泼尼松龙琥珀酸钠24.5 mg/kg，1次/周，连续注射6周以建立激素性股骨头坏死模型。与此同时注射青霉素8万单位/只以预防感染。空白组组大鼠接受等剂量生理盐水灌胃，注射频次同模型组及中药组。随机选取3只大鼠取股骨头组织进行HE染色，股骨头组织出现空骨陷窝办周围骨髓细胞坏死，至少出现1处坏死灶提示造模成功。

1.2.2 给药方法中药组大鼠接受补肾活血汤灌胃，按照0.66 g/mL剂量，灌胃1次/d，连续灌胃6周;空白组及模型组大鼠接受等剂量生理盐水灌胃，1次/d，连续灌胃6周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 大鼠股骨头X线情况变化 3组动物干预结束后随机选择3只/组，利用水合氯醛腹腔注射麻醉后将大鼠固定于X线数据采集板上，行X线扫描，扫描参数设置如下：40 KV，50 mAs，照射时间为50 ms，观察股骨头的外形、骨小梁数目变。同时检测左侧股骨干、股骨头的密度

1.2.3.2 股骨头HE染色 3组动物干预结束后随机选择3只/组大鼠，利用水合氯醛腹腔注射麻醉断头处死，冰上取出股骨头组织置于多聚甲醛溶液中进行固定，随后进行脱水透明、浸蜡包埋、切片與贴片、脱蜡，再将标本置于苏木精水溶液中染色数分钟，再进行脱水透明，将已透明的切片用树胶封固后光镜下观察股骨组织病理变化。

1.2.3.3 血清钙磷水平变化干预后取随机选择3只/组大鼠，利用水合氯醛腹腔注射麻醉后取腹主动脉血，充分离心后分离出上清液，采用ELISA检测法进行钙、磷浓度测定，用碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至适量浓度后加至反应孔中加0.1 mL，4 ℃孵育过夜，随后用PBS冲洗3次，2 min/次，随后加入待测样品，室温下反应1 h，随后用PBS冲洗3次，2 min/次，加入新鲜稀释的酶标抗体，室温下孵育1 h后洗涤。随后与每个反应孔中加入TMB底物溶液0.1 mL，充分反应后加入2 mol/L硫酸0.05 mL显色，在酶标仪中进行显色测定，计算出OD值，操作过程严格按照说明书进行。

1.2.3.4 Western Blotting检测各组大鼠股骨组织的Wnt10b、β-Catenin蛋白变化干预结束后各组随机抓取3只大鼠，利用水合氯醛腹腔注射麻醉后断头处死，后冰上快速取出股骨组织，用EDTA脱钙液对股骨标本进行脱钙，按照100 mg∶ 0.5 mL裂解液的比例对样本进行蛋白提取，充分匀浆后室温下静置15 min，测定样本总蛋白浓度后计算上样量，进行电泳跑胶，转膜，加入Wnt10b、β-catenin及β-actin一抗，比例均按照1∶ 1 000稀释，再进行生物辣根过氧化酶HRP标记的二抗孵育，最后显影、拍摄，用Image（BIO-RAD公司）的图像处理软件进行处理，测定各样本灰度值。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件进行研究数据的统计分析。所得数据都用（均数±标准差）（±s）来描述，组间比较采用两样本t检验，组内比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组股骨X光线变化空白组大鼠股骨头形态正常，股骨头呈现圆球形，骨密度均匀，模型组大鼠股骨头密度高低不同，股骨头毛糙，骨小梁模糊，中药组大鼠股骨骨小梁数目较模型组增多，且相对清晰，股骨头面较模型组光滑。见图1。

2.2 各组大鼠骨密度比较与空白组比较，模型组及中药组大鼠股骨干、股骨头骨密度均明显下降（P<0.05），其中中药组股骨干、股骨头骨密度高于模型组（P<0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠血清钙、磷水平变化 ELISA显示，与空白组比较，模型组及中药组大鼠血清钙、磷水平均明显下降（P<0.05），其中中药组血清钙、磷水平高于模型组（P<0.05）。

2.3 各组大鼠股骨头HE病理学改变 HE染色显示模型组大鼠股骨头软骨出现软骨细胞出现明显坏死现象，并出现聚缩现象，排列紊乱，骨小梁数目明显减少，空骨陷窝增多;中药组大鼠股骨头结构尚完整，空骨陷窝较模型组减少，软骨细胞排列欠规则。见图2。

2.4 各组大鼠股骨组织Wnt10b、β-Catenin蛋白变化 Western Blotting显示模型组与中药组大鼠股骨头组织Wnt10b、β-Catenin蛋白较空白组下降（P<0.05），其中中药组股骨头组织Wnt3a、β-Catenin蛋白较模型组上调（P<0.05）。见图3，表3。

3 讨论

《医学真传·气血》书中描述：“气为血之帅，血为气之母”，气行血行，气滞血瘀，气血瘀久于骨，则髋部疼痛，关节不利”;《黄帝内经》亦认为：“肾为先天之本，……主骨生髓，……则新不生”，不同辨证思想均认为“肾虚”“血瘀”是贯穿该病发生发展的全过程，故“补肾活血”成为治疗股骨头坏死的主要原则。本团队及国内其他学者[8-10]认为均在临床上证实补肾活血汤确对股骨头坏死有理想疗效。方中鹿角胶为君药，是温补肝肾，益精养血之良品，三七、丹参、当归共奏行气活血化瘀之功，共为臣药，牛膝菟丝子、女贞子共为佐药，增强君药的滋补肝肾之功，黄芪益气，气为血帅，气足则血畅，土鳖虫破血逐瘀，续筋接骨之功效，甘草益气和中，为使药。整方共奏补肾活血化瘀之功。在研究中我们发现补肾活血汤可明显增加成模大鼠股骨骨小梁数目，修复受损的股骨头面。病理学研究亦显示补肾活血汤可修复股骨头结构，减少空骨陷窝现象，促进软骨细胞排列规则。这充分证实了补肾活血汤确可明显改善坏死股骨组织周围的供血环境，促使新生骨的生成[11-12]。

信号转导通路是调控细胞生命活动的关键，外界对细胞的刺激信号通过转导通路进行传递，以进一步调控机体的生物学行为，确保生命活动的顺利进行[13]。Wnt/β-Catenin是经典的Wnt信号通路，广泛参与机体生长发育、细胞稳态、组织内环境维持等环节[14]。Wnt家族有诸多成员，其中Wnt10b0b与骨密度和骨强度维持关系密切，Wnt10b0b的表达强弱可直接调控Wnt/β-catenin信号通路对骨髓间充质干细胞活性的能力，从而维持成人骨骼中成骨祖细胞的数量，刺激成骨细胞矿化活性增强[15-17]。本研究中我们发现模型组与中药组大鼠股骨头组织Wnt10b、β-Catenin蛋白较空白组下降，经过补肾活血汤干预后大鼠股骨头组织Wnt10b、β-Catenin蛋白表达上调，这说明了补肾活血汤介导股骨头坏死的治疗与Wnt-βcatenin信号通路。

总之，补肾活血汤对股骨头坏死大鼠股骨头有保护效应，其作用机制与Wnt-βcatenin信号通路有关。

参考文献

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（2019-08-30收稿责任编辑：徐颖）

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