| 标题 | 超高效液相色谱串联质谱法鉴定猪肉的特异性肽生物标志物 |
| 范文 | 周广运 王桂姬 任皓威 芦乾 杨艳 郭立海 刘宁 摘要以亲缘关系较近的猪、牛和羊3个物种的肌肉组织为研究对象，采用超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS），筛选并确认了猪物种肉特异性肽生物标志物。3种纯肉样品经蛋白质提取、胰蛋白酶消化和UPLCTripleTOFMS分离鉴定，得到的总离子流图谱（TIC）与Uniprot蛋白质数据库对比分析，筛选出3个物种肉的3种高丰度同源蛋白和8种潜在的肽生物标志物； 潜在的肽生物标志物经QTRAPMS质谱的多反应模式（MRM）分析，最终确认了猪物种肉的5种肽生物标志物，其中3种肽生物标志物未见文献报道。 关键词猪肉； 超高效液相色谱串联质谱； 多反应监控； 肽生物标志物 1引 言 肉品掺假已成为全世界普遍存在的问题，用低价的肉代替高价的肉是肉品掺假的主要方式，牛肉和羊肉作为价格高的肉类，常用猪肉掺假。这不仅侵犯了消费者的合法权益，而且还冲击了宗教信仰[1]，造成严重的社会问题。目前，基于核酸与蛋白质的检测方法已广泛应用于肉制品的掺假鉴定，包括PCR技术[2～4]和免疫学方法（如ELISA等）[5]。与PCR技术相比较，基于蛋白质的肉品掺假鉴定方法具有独特的优势。首先，蛋白质的一级结构在高度加工条件下相对稳定[6]，肉品经加工处理后，仍能观察到部分蛋白质的氨基酸序列[7]，而DNA在高度加工或者频繁处理的肉类样品中，很容易导致降解[8]。其次，蛋白质具有更高的组织特异性，而DNA在同一个体不同组织之间没有差别[9]。然而，以蛋白质为基础的ELISA方法也存在着自身的劣势，每个ELISA反应只能检测单一的物种，无法实现多个物种的同时检测。 采用质谱方法鉴定和分析不同物种的蛋白质来检测肉品掺假，方法简单、准确、可靠，近年来已成为肉品掺假鉴定的主要方法。Taylor等[10]最先将质谱方法应用于肉制品的掺假鉴定。随着蛋白质组学的发展，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）结合电泳或者高效液相色谱技术可用于研究肉品掺假鉴定[11，12]，但存在费时、费力和操作复杂等缺点。高通量和高分辨率质谱技术，结合蛋白质数据库分析的技术[13～15]，是目前检测肉品掺假的研究热点。在中国东北地区，牛羊肉火锅和烧烤较为常见，由于猪肉价格相对较低且容易获得，常用猪肉来掺假牛羊肉。三元杂交猪是中国东北地区最主要的猪肉品种，关于它的肌肉蛋白质组学研究较少； 另外，由于猪的种属和生长环境的不同，可能会导致不同地区或不同品种的猪肉，在蛋白质表达方面存在差异。本研究首先使用高分辨率、高扫描速度的飞行时间质谱（Triple TOFMS）对3种纯肉样品中的全蛋白和多肽进行了分离鉴定，通过检索Uniprot蛋白数据库，筛选出猪物种肉的潜在肽生物标志物； 采用三重四极杆质谱，在多反应监控（MRM）模式下进一步分析潜在的肽生物标志物，最终确认了猪物种肉的5种特异性肽生物标志物，其中3种肽生物标志物未见文献报道。 2实验部分 2.1仪器与试剂 ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）； TripleTOF 5600飞行时间质谱仪、ExionLC AD超高效液相色谱仪、QTRAP 4500三重四极杆质谱仪（美国Sciex公司）； TGL16台式高速冷冻离心机（湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司）； 恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司） 。 3[3（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、尿素、色谱纯的甲酸、甲醇和乙腈（美国Sigma公司）； 测序级胰蛋白酶（美国Promega公司）。其它试剂均为分析纯； 实验用水为超纯水。 2.2实验方法 2.2.1样品的采集本研究中的牛肉、羊肉和猪肉3种纯肉样品，均购买于哈尔滨市某大型超市和正规的商业屠宰场，剔除肉样品中的脂肪组织和结缔组织，剩余的瘦肉样品被分割成小块 2.2.2蛋白质的提取用研钵将各肉类组织在液氮中充分碾碎，称取约2 g的不同碎肉样品于离心管中，各加入1 mL蛋白质提取液（8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% （w/V） CHAPS）充分振荡， 12000 r/min离心20 min，取上清液备用。蛋白浓度采用Bradford法分析测定。 2.2.3蛋白质的消化取200 μg蛋白溶液于离心管中，加入DTT溶液，56 ℃反应1 h，冷却至室温，再加入IAA溶液，室温条件下避光反应30 min，完成还原烷基化过程； 将溶液转移至超滤管（截留分子量为10 K）中，离心除去过量的DTT、IAA和部分杂质，并用NH4HCO3溶液洗3次； 向超滤管中加入100 μL含有3 μg 测序级胰蛋白酶，37 ℃条件下振荡反应过夜，离心收集溶液。 2.2.4猪潜在肽生物标志物的找寻采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱对消化后的多肽样品进行分析鉴定。采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm， Waters公司），ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪，流动相A为0.1%甲酸，流动相B为0.1%甲酸乙腈，流速为0.3 mL/min， 梯度洗脱条件为：0～40 min，5%～35% B； 40～55 min，35%～100% B； 55～55.1 min，100%～5% B； 55.1～60 min，5% B。 質谱分析采用TripleTOF 5600飞行时间质谱仪，离子源为ESI源，离子源的电离电压和温度分别设定为5500 V和550 ℃。所有多肽样品均在正离子模式状态下扫描，质量扫描范围m/z 100～1500之间。每个样品重复扫描两次。 使用ProteinPilot （Version 5.0，SCIEX）软件，进行数据分析和猪潜在肽生物标志物的找寻。 2.2.5质谱多反应监控（MRM）确认猪的肽生物标志物采用Exion LC AD超高效液相色谱串联QTRAP 4500质谱建立多反应监控检测方法。液相色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm， Waters公司）柱，柱温为40 ℃，流动相A为0.1%甲酸，流动相相为0.1%甲酸乙腈，流速为0.4 mL/min，梯度洗脱条件为：0～1 min， 5%～10% B； 1～15 min，10%～35% B； 15～16 min，35%～90% B； 16～18 min，90% B； 18～18.1 min，90%～5% B； 18.1～22 min，5% B。质谱系统使用Turbo V的电喷雾离子源（ESI），离子源温度为550 ℃，喷雾电压为5500 V。 使用Skyline工具构建所有潜在肽生物标志物的MRM 离子对，采用Analyst软件（Version 1.6.2，SCIEX）进行数据分析。 3结果与讨论 3.1同源蛋白分析 同源蛋白是指氨基酸序列具有明显的相似性，在不同生物体或同一机体内行使相同或相似功能的一类蛋白质。同源蛋白的发现是鉴定特异性肽生物标志物的基础，肽生物标志物的稳定性与同源蛋白丰度有关。在本研究中，猪肉、牛肉和羊肉的3种多肽样品经LCTripleTOFMS质谱鉴定，得到每个物种的总离子流（TIC）图谱，经ProteinPilot软件与UniProt 蛋白数据库对比分析，最终得到猪、牛和羊3个物种肉的高丰度同源蛋白质信息见表1。 采用本研究开发的检测方法，每种肉可以检测到500～700種蛋白质，这与von Bargen等[14]的报道结果一致，但与Sarah等[19]的研究结果相比，本研究鉴定到的蛋白质数量明显增加。通过详细比较和筛选3种动物物种肉的所有蛋白质，最终筛选出3种动物物种肉的同源蛋白。同时，为了提高实验的可靠性，排除了同源蛋白质中的低丰度蛋白（按照蛋白质丰度排序，序列号60以后的蛋白质）。由于不是所有的同源蛋白质中都含有特异性的肽生物标志物，为了减少数据的复杂性，提前排除了不含有潜在肽生物标志物的同源蛋白。最终，确定了3个动物物种中的3种高丰度同源蛋白质（按照蛋白质丰度排序，序列号60之前的蛋白质），详细信息见表1。在高丰度同源蛋白信息中，肌红蛋白（Myoglobin） 和3磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase）已被报道用于肉品掺假的鉴别[16～18]。但未有线粒体三功能酶α亚基（Trifunctional enzyme subunit alpha， mitochondrial）用于肉类掺假的报道，为本研究新发现的高丰度同源蛋白，此酶在线粒体中主要参与脂肪酸的β氧化和脂质代谢，在猪肉组织中有较高的丰度，这可能与该蛋白在三元杂交猪中的高表达有关。 3.2猪物种肉潜在肽生物标志物的找寻 猪物种肉潜在肽生物标志物是指该多肽序列仅特异性的存在于猪物种肉中，而在本研究中的其它物种（牛和羊）中不存在，并且这些特异性的肽段所对应的蛋白质是3个动物物种中的高丰度同源蛋白。同时，为了进一步确认肽段的特异性，将筛选到的猪物种肉特异性肽段在NCBI网站进行Blast分析，即这些特异性肽段的氨基酸序列不能与牛和羊物种的氨基酸序列完全匹配[7，19]。详细的猪潜在肽生物标志物信息见表2。 由表2可见，利用本方法最终筛选出猪物种肉的8个潜在肽生物标志物，其中包括文献已经报道过的多肽序列GHHEAELTPLAQSHATK[16，20]和WGDAGATYVVESTGVFTTMEK[18]。而线粒体三功能酶α亚基（Trifunctional enzyme subunit alpha， mitochondrial）蛋白，作为新发现的同源蛋白，包含6种潜在肽生物标志物，未见报道。在筛选猪物种肉潜在肽生物标志物时，及时排除了高丰度同源蛋白质中可信度（ProteinPilot软件自动给出）小于95%的肽段，增加了潜在肽生物标志物的可靠性。另外，不同的胰蛋白酶酶切效率不同，常会出现误切和漏切等现象[21]，在筛选肽生物标志物时，应及时排除出现天冬酰胺脱酰胺、谷氨酸N末端环化、甲基化和磷酸化等不稳定存在的肽段。 3.3多反应监控模式下对猪潜在肽生物标志物的确认 通过数据库检索的方式筛选到的猪物种肉潜在肽生物标志物，须经过质谱多反应监控（MRM）的进一步验证，以确认肽生物标志物的特异性。Skyline工具会自动生成目标肽段的母离子和可能的子离子，在众多的母离子和子离子对中，选择转换最为激烈的6对母离子和子离子，作为MRM的特异性验证离子[14～16]。根据同一肽的MRM离子对具有相同的保留时间，判断潜在肽生物标志物的特异性。图1显示了多肽序列WGDAGATYVVESTGVFTTMEK在3个物种前15 min的提取离子流色谱图（XIC），图1中的峰是由一个或者多个具有相同的母离子转换得到的子离子形成的峰簇（见图2、图3）。由图1可见，在猪物种肉的提取离子流色谱图中，7.62和9.87 min出现两个峰，结合牛和羊物种的提取离子流色谱图，可以确认7.62 min的低强度峰为猪物种肉的非特异性峰，而9.87 min的峰为猪物种肉的特异性峰。为了进一步证明9.87 min的峰为猪物种肉的特异性峰，分析了7.62 min和9.87 min的峰。 本研究最终筛选并确认了猪物种肉的5种肽生物标志物。其中肽生物标志物TVLGAPEVLLGILPGAGGTQR、ADMVIEAVFEELSLK和FAGGNLDVLK未见报道。本研究中未针对特定蛋白质进行分析，而是采用了高分辨率、高扫描速度的质谱对3个物种肉中的全蛋白进行了分析鉴定，极大丰富了分析结果中的蛋白质和多肽的信息。同时，也增加了质谱测定结果中的同源蛋白质和肽生物标志物的数量。另外，由于三元杂交猪的种属和生长环境的不同，可能导致了某些蛋白质在肌肉中的含量有所差异，也影响到了肽生物标志物的数量。新发现的肽生物标志物可能与三元杂交猪的品种特异性有关，这需要后续的研究进行验证。表3给出了猪物种肉肽生物标志物的母离子、子离子和肽生物标志物在MRM实验中具体的保留时间。 4結 论 本研究采用TripleTOFMS系统筛选出3个物种肉的3种高丰度同源蛋白和8种潜在的肽生物标志物； 利用QTRAPMS系统建立的MRM方法，最终确认了猪物种肉的5种肽生物标志物，其中2种肽生物标志物与之前的报道相符，而肽生物标志物TVLGAPEVLLGILPGAGGTQR、ADMVIEAVFEELSLK和FAGGNLDVLK未见文献报道。液相色谱质谱联用（LCMS）技术作为肉品掺假鉴定新方法，具有广阔的发展空间。本方法可为后续混合肉中猪肉成分的定量分析以及猪物种肉检测的商业ELISA试剂盒的开发提供了实验基础。 AbstractThe samples of muscular tissue from pork， beef and lamb which were closely related in the genetic relationship were analyzed by ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometric （UPLCMS） technique. The specific peptide biomarkers of pig meat species were found and confirmed. Proteins from three pure meat samples were extracted and digested using trypsin， the digested proteins were identified by UPLCtriple timeofflight （TOF）MS， and the total ion chromatogram （TIC） was searched and analyzed against the UniProt database. Three high abundant homologous proteins of three species and 8 potential peptide biomarkers of pork were found. A multiple reaction monitoring （MRM） QTRAPMS method was established to confirm the specificity of potential peptide biomarkers. As a result， five peptide biomarkers of pig species meat were confirmed， three of which were not reported. KeywordsPork； Ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Multiple reaction monitoring； Peptide biomarkers |
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