| 标题 | 中青年高血压病痰湿壅盛证患者血清样品代谢组学分析 |
| 范文 | 吴天敏 陈金水 薛文娟 摘要：目的 研究中青年高血压病不同证型患者及健康对照者血清代谢产物谱差异，寻找相关生物标志物，揭示高血压病痰湿壅盛证的证候本质。方法 将34例高血压病患者辨证分为肝火亢盛证14例、痰湿壅盛证14例、阴虚阳亢证6例，以15例健康志愿者为对照组，通过1H-NMR技术分析高血压病3种证型患者及健康对照者的血液成分，使用PLS-DA方法进行模式识别、寻找标志物，同时采集尿酸（UA）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）数据。结果 高血压病痰湿壅盛证UA水平最高，与其他组比较差异有统计学意义（P<0.05）；阴虚阳亢证TC水平最高，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；痰湿壅盛证TG水平最高，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。基于1H-NMR的代谢组学研究方法可以区分高血压病痰湿壅盛组及对照组、肝火亢盛组、阴虚阳亢组。高血压病痰湿壅盛组与对照组比较，丙酮、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白含量增多，乳酸、丝氨酸、葡萄糖、蛋氨酸、丙氨酸含量减少；与肝火亢盛组比较，柠檬酸、丙氨酸、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白含量增多，葡萄糖、赖氨酸、谷氨酸、脯氨酸、乳酸含量减少；与阴虚阳亢组比较，肌酐含量增多。结论 中青年高血压病痰湿壅盛证患者体内存在脂蛋白代谢、氨基酸代谢和糖代谢异常。 关键词：高血压病；痰湿壅盛证；中青年；代谢组学 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.006 中图分类号：R259.441 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）10-0021-05 Abstract： Objective To analyze the serum samples of young and middle-aged patients with hypertension of different syndromes and healthy patients by means of metabonomics； To confirm its biomarker； To reveal the nature of phlegm dampness retention syndrome in essential hypertension. Methods The syndrome types of 34 hypertension patients were differentiated into 14 cases of liver-fire hyperactivity syndrome group， 14 cases of phlegm dampness retention syndrome group and 6 cases of yin deficiency and yang hyperactivity syndrome group. 15 healthy volunteers were selected as control group. 1H-NMR technique combined with partial least squares-discriminate analysis （PLS-DA） method was used to look for the biomarkers. And the levels of UA， TC and TG were recorded. Results The level of UA in phlegm dampness retention syndrome group was significantly higher than the other three groups （P<0.05）. The level of TC in yin deficiency and yang hyperactivity syndrome group was higher and had significantly difference with the control group （P<0.05）. The level of TG in phlegm dampness retention syndrome group was higher and had significantly difference with control group （P<0.05）. The metabonomics study based on the 1H-NMR method could distinguish the phlegm dampness retention syndrome group from the normal control group， liver-fire hyperactivity syndrome group and yin deficiency and yang hyperactivity syndrome group. Compared with the control group， the levels of acetone， VLDL， and LDL were significantly higher and the levels of lactate， serine， glucose， methionine， alanine were significantly lower in phlegm dampness retention syndrome group； compared with the liver-fire hyperactivity syndrome group， levels of citrate， alanine， VLDL， and LDL were significantly higher and the levels of glucose， lysine， glutamate， proline lactate were significantly lower； compared with yin deficiency and yanghyperactivity syndrome group， the level of creatinine was significantly higher. Conclusion There are lipoprotein metabolism， amino acid metabolism and glucose metabolism disorder in the young and middle-age hypertensive patients with phlegm dampness retention syndrome. Key words： hypertension； phlegm dampness retention syndrome； young and middle-age adults； metabonomics 高血压是多种心、脑血管疾病的重要原因和危险因素，是心血管疾病死亡的主要原因。世界卫生组织在2010年的报告中指出，包括心血管疾病在内的非传染性疾病，目前已占全球总死亡人数的2/3[1]。《中国心血管病报告2013》指出，心血管病是中国居民的首位死亡原因，目前高血压的知晓率和控制率并不理想[2]。中青年人因其体质及生活方式的原因，发生高血压时易表现为肝阳上亢证或痰湿壅盛证[3-4]。 代谢组学是通过考察生物体系受到外源性或内源性的刺激或扰动后其代谢产物的变化情况来研究生物体系的一门学科[5]。近年来，随着代谢组学技术的不断发展，越来越多的学者在高血压病证型研究中采用了代谢组学的方法[6-8]，且在对高血压病痰湿壅盛证患者血清代谢组学进行的研究采用的均为液质联用或气质联用技术，1H-NMR较以上2种技术来说具有无损伤性、更接近生理条件[9]及操作简单的优势。本研究运用该技术对中青年高血压病痰湿壅盛证患者、非痰湿壅盛证患者及健康志愿者血清进行代谢组学分析，为中医防治高血压提供依据。 1 资料与方法 1.1 诊断标准 1.1.1 西医诊断标准 参照2010年《中国高血压防治指南》[10]。①受试者坐位安静休息5 min后测量坐位时的上臂血压。首诊时测量双上臂血压，以后通常测量较高读数一侧的上臂血压。②≥3次非同日、非药物干预下安静时收缩压≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）和/或舒张压≥90 mm Hg。③排除继发性高血压。分级：收缩压140～159 mm Hg和/或舒张压90～99 mm Hg为1级，收缩压160～179 mm Hg和/或舒张压100～109 mm Hg为2级，收缩压≥180 mm Hg和/或舒张压≥110 mm Hg为3级。 1.1.2 中医辨证标准 参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》[11]中“中药新药治疗高血压病的临床研究指导原则”，由2位以上具有主治医师以上资格的医师分别独立判定主证型及次证型，取2位以上共同判定的结果。①痰湿壅盛证：主症包括眩晕、头痛、头如裹、胸闷、呕吐痰涎；次症包括心悸、失眠、口淡、食少、舌胖苔腻、脉滑。②肝火亢盛证：主症包括眩晕、头痛、急躁易怒；次症包括面红、目赤、口干、口苦、便秘、溲赤、舌红苔黄、脉弦数。③阴虚阳亢证：主症包括眩晕、头痛、腰酸、膝软、五心烦热；次症包括心悸、失眠、耳鸣、健忘、舌红少苔、脉弦细而数。 1.2 纳入标准 ①符合高血压病西医诊断标准和中医证候诊断标准；②年龄18～59岁；③1级和2级原发性高血压，140 mm Hg<收缩压<180 mm Hg且90 mm Hg<舒张压<110 mm Hg；④未用药或已服用降压药但经2周洗脱期后血压达到上述标准；⑤签署知情同意书。 1.3 排除标准 ①继发性高血压及严重心、脑、肝、肾、肺疾患者；②急慢性感染性疾病、糖尿病、恶性肿瘤、严重营养不良者；③合并精神病者及妊娠、哺乳期妇女。 1.4 一般资料 研究对象来源于2014年9月-2015年2月就诊于福建医科大学附属第一医院的原发性高血压患者及体检的健康志愿者，共49例。肝火亢盛组14例，平均年龄（53.64±5.57）岁；痰湿壅盛组14例，平均年龄（49.00±8.20）岁；阴虚阳亢组6例，平均年龄（56.00±3.35）岁；对照组15例，平均年龄（47.07±9.22）岁。各组性别构成比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。 1.5 主要试剂与仪器 重水，美国MREDA科技有限公司；AVANCE Ⅲ 500MHz型超导傅立叶变换NMR谱仪，瑞士BRUKER公司。 1.6 血清样品预处理 清晨取受试者空腹静脉血（空腹12 h），黄头促凝管促凝，静置1 h后3000 r/min离心10 min，取上清液，置-80 ℃冰箱保存。预处理时常温下解冻，取血清400 ?L加重水100 ?L及缓冲液（pH 7.4）100 ?L，12 000 r/min离心5 min后，取上清液500 ?L置于直径5 mm的核磁管中，送至福州大学测试中心行NMR代谢图谱检测。同时采集尿酸（UA）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）数据。 1.7 NMR数据采集和处理 将1H NMR自由感应衰减信号导入Chenomx NMR suit（version 8.0， Chenomx， Edmonton， Canada）软件，自动进行傅立叶转换，调整相位，校正基线，血清以甲酸盐峰（8.46 ppm）作为全部谱图化学位移的标准。对0.1～10.0 ppm范围内的谱峰进行分析，以0.04 ppm单位的化学位移为分段积分单元。为防止水的残留峰干扰，血清样本除去4.50～5.10 ppm（水峰）处的分段积分值。然后将所有积分值的面积进行归一化处理，导出到Excel表格，得到每个分段和对应的积分面积值的矩阵。再将数据文件导入SMICAP软件中进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。 1.8 数据分析 通过上述分析所获得各样本的主成分得分作图可判别组间差异，进一步用PLS-DA方法进行主成分因子负荷矩阵分析、作变量散点图，从图中可发现具有区分2组间代谢差异的变量，即“差异代谢物”。此时获得的仅为相关差异代谢物的化学位移，进一步根据这些信息进行结构推测，从而明确其化学结构及名称，并运用t检验进行差异代谢物的筛选。 1.9 统计学方法 计量资料用—x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，计数资料组间比较采用χ2检验。代谢组学分析数据采用SIMCAP11.5软件进行PLS-DA，并通过SPSS19.0统计软件进行分析，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 各组生化指标比较 痰湿壅盛组UA与其他3组比较差异有统计学意义（P<0.05），阴虚阳亢组TC与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表2。提示血脂异常以痰湿壅盛组和阴虚阳亢组为主，UA水平升高以痰湿壅盛组为主。 2.2 PLS-DA分析 得分图上显示的散点代表每个血清样本的相对位置及相对关系，散点越靠近说明样本差异越小，反之，距离越远，差异越大。荷载图上每一个上的数值均代表其化学位移，离中心越远，提示其对区分样本所做的贡献越大，其重要程度可表现为VIP分值。VIP值>1表示“重要的”变量，VIP值<0.5表示“不重要的”变量。 图1显示，对照组（A组）位于PLS-DA得分图的上方区域，痰湿壅盛组（C组）位于得分图的下方区域，2组能较明显地区分出来，可见痰湿壅盛组和对照组代谢轮廓存在明显差异。 图2显示，肝火亢盛组（B组）样本分布于PLS-DA得分图的右上方区域，痰湿壅盛组（C组）样本分布于得分图的左下方，2组能较明显地区分出来，提示痰湿壅盛组和对照组的代谢轮廓存在差异。但图中C13混杂在B组中，且2组交界处有成分混杂，考虑2组的代谢情况有部分共性。 图3显示，阴虚阳亢组（D组）位于PLS-DA得分图的上方区域，痰湿壅盛组（C组）位于得分图的下方区域，2组能较明显地区分出来，提示阴虚阳亢组和痰湿壅盛组的代谢轮廓存在差异。但图中D1混杂在C组中，且2组交界处有少数成分混杂，考虑2组的代谢情况有部分共性。 2.3 差异代谢物 对VIP值>1的化学位移，运用t检验对其对应的积分面积进行统计分析，得出痰湿壅盛组和其他3组之间的差异性血清代谢物。其中“↓”表示痰湿壅盛组与其他3组相比，差异代谢物水平呈下降趋势；“↑”表示痰湿壅盛组与其他3组相比，差异代谢物水平呈上升趋势。结果见表3、表4。 对照组和痰湿壅盛组中有显著差异的代谢物为：乳酸、丝氨酸、葡萄糖、丙酮、蛋氨酸、丙氨酸、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白。其中痰湿壅盛组的丙酮、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平较对照组升高，乳酸、丝氨酸、葡萄糖、蛋氨酸、丙氨酸水平较对照组下降。 肝火亢盛组和痰湿壅盛组中有显著差异的代谢物为：葡萄糖、赖氨酸、柠檬酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、乳酸、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白。其中痰湿壅盛组的柠檬酸、丙氨酸、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平较肝火亢盛组升高，葡萄糖、赖氨酸、谷氨酸、脯氨酸、乳酸水平较肝火亢盛组下降。 阴虚阳亢组和痰湿壅盛组中有显著差异的代谢物为肌酐，其水平在痰湿壅盛组中高于阴虚阳亢组。 3 讨论 本研究结果显示，对照组和痰湿壅盛组血清代谢物存在显著差异，分别为乳酸、丝氨酸、葡萄糖、丙酮、蛋氨酸、丙氨酸、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白；肝火亢盛组和痰湿壅盛组中存在显著差异的代谢物有葡萄糖、赖氨酸、柠檬酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、乳酸、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白；痰湿壅盛组中肌酐水平高于阴虚阳亢组。上述代谢物中低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白参与了脂蛋白代谢，葡萄糖、乳酸、丙酮、柠檬酸参与了糖代谢，蛋氨酸、丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸参与了氨基酸代谢，痰湿壅盛组上述物质与对照组及肝火亢盛组相比具有显著差异，提示痰湿壅盛组患者体内出现了脂蛋白、糖、氨基酸三大代谢的异常。 研究表明，高脂饮食可引起模型动物血清/血浆中能量代谢以及氨基酸代谢的异常。如Zha等[12]运用气相色谱飞行时间-质谱联用技术对高胆固醇饮食仓鼠的代谢情况进行研究，结果发现食用高胆固醇饲料的仓鼠血浆中脂肪酸、碳水化合物以及氨基酸的水平发生显著变化，并且饲料中胆固醇含量越高，这些代谢物与对照组的差异越大，尤以氨基酸的差异更为显著。Shearer等[13]运用核磁共振技术进行相关研究发现，高脂饮食会导致小鼠血清中各种氨基酸，如赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸以及能量代谢中间产物柠檬酸盐等小分子代谢物的代谢水平发生了显著变化。结合以上研究成果推测，痰湿壅盛组血脂水平较肝火亢盛者高，饮食构成中高脂成分较对照组和肝火亢盛组多，考虑高脂饮食进一步加重了痰湿壅盛证患者体内的氨基酸代谢紊乱，使其出现了脂蛋白代谢、糖代谢和氨基酸代谢的异常。张氏[14]研究发现，血清牛磺酸、含硫氨基酸总和（蛋氨酸+牛磺酸+胱硫醚）、赖氨酸、丝氨酸、胱氨酸、1-甲基组氨酸和门冬酰胺等和血压显著负关联。Lovenberg[15]通过相关研究提出含硫氨基酸可使高血压大鼠血压降低而预防脑卒中。本研究中高血压病痰湿壅盛证患者的血清丝氨酸、蛋氨酸含量均较对照组降低，与上述研究结果一致。同型半胱氨酸（HCY）为蛋氨酸代谢过程中重要的中间产物，目前认为高HCY血症是心血管疾病的独立危险因素，高血压病痰湿壅盛证患者血清中蛋氨酸含量降低，不排除其消耗增多致使半胱氨酸产生增多，进而可能引起高血压的发生。痰湿壅盛证患者与肝火亢盛证患者血清代谢物相比，赖氨酸、谷氨酸、脯氨酸含量均降低。赖氨酸属于生酮氨基酸，是人体必需氨基酸之一，其可降低血中TG水平，预防心脑血管疾病，其在痰湿壅盛证患者中含量减少，可能是痰湿壅盛之人TG水平升高的原因之一。 本研究显示肌酐水平在痰湿壅盛组中高于阴虚阳亢组。外源性肌酐是肉类食物在体内代谢后的产物，内源性肌酐是体内肌肉组织代谢的产物，其排泄主要通过肾脏。痰湿壅盛证患者的UA水平较其他3组明显升高，考虑UA升高影响了肾脏的排泄功能，且痰湿壅盛证患者多食肉类食物，外源性肌酐摄入增多。肌酐来源增多、去路减少，因此痰湿壅盛证患者的肌酐水平较阴虚阳亢证患者升高。根据本研究的生化指标统计分析结果，可见痰湿壅盛证患者和阴虚阳亢证患者的血脂水平均较对照组和肝火亢盛组高，考虑不同原因引起的血脂增高情况均引起了氨基酸代谢和糖代谢紊乱的情况；由于两证型组患者体内氨基酸代谢和糖代谢紊乱情况相当，所以，两证型组的血清代谢物分析中未发现游离氨基酸、血糖、乳酸、丙氨酸、柠檬酸、脂蛋白等氨基酸代谢、糖代谢及脂蛋白代谢相关物质的含量存在明显差异。 参考文献： [1] WHO. 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