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标题

光遗传和化学遗传在中医药脑科学研究中的应用

范文

汪涛　董钰婷　李熳　唐勇　张浩琳

摘要自人类脑科学研究计划开始以来，中医药以其獨特的优势逐渐与脑科学研究紧密结合。在此期间涌现了大量新理念、新技术及新成果，极大地促进了中医药新技术的开发，加快了中医药现代化的步伐。但是诸多的研究手段都有一定的局限性，导致中医药脑科学研究的进一步发展非常有限。近年来，光遗传学技术和化学遗传学技术具有细胞类型特异性、高精度时空分辨率、神经网络功能性解剖特性，在神经科学领域得到了广泛运用，为临床治疗脑部疾病提供了一种新的策略。因此，本文主要阐述光遗传学技术和化学遗传学技术的原理、应用以及助力中医药脑科学研究的进一步发展。

关键词光遗传学技术;化学遗传学技术;中医药;针灸;脑疾病

Abstract Since the beginning of human brain science research program，traditional Chinese medicine （TCM） has been closely integrated with brain science research due to its unique advantages.During this period，a large number of new concepts，new technologies and new achievements have emerged，which has greatly promoted the development of new technologies in TCM and accelerated the process of modernization of TCM.However，the further development of TCM in brain science research is hindered due to the certain limitations of research methods.In recent years，optogenetics and chemogenetics have been widely used in the field of neuroscience and provide a new strategy for clinical treatments because of specific cell-type，high-precision spatio-temporal resolution，and functional anatomical characteristics of neural networks.Therefore，this paper reviews the mechanism and application of optogenetics technique and chemogenetics and technique，aiming to promote the further development of TCM in brain science research.

Keywords Optogenetics technique; Chemogenetics technique; Traditional Chinese medicine; Acupuncture and moxibustion; Brain disease

中图分类号：R2-03文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.004

经过两千多年的发展，中医药因其独特的优势在医疗卫生系统中发挥着不可替代的作用。其治疗手段较多（比如中草药、针刺、艾灸及拔罐等），对多种疾病的疗效显著，而且不良反应较少。因此，对中医药的研究也成了广大科研人员工作的热点，特别是深入探讨中医药在脑科学领域的重要作用及内在机制，将有利于人类脑科学研究计划的进一步发展，凸显我国中医药事业在全球脑科学研究中的特色与优势，推动中医药走向世界。

传统的中医药脑科学研究手段如脑部核团损毁、功能性磁共振成像、经颅磁刺激及药物处理等在中医药脑科学的机制的研究中有一定的局限性，损毁脑部核团会引起脑组织不可逆的破坏，功能性磁共振成像不能区别不同亚型的神经细胞的生理功能，经颅磁刺激会引起不同程度的外周神经损害等，这些研究手段尚不能实时、动态地揭示中医药脑科学的机制。

光遗传学技术和化学遗传学技术是20世纪初新兴的生物工程技术，两者都可以精确地调控特定类型的神经细胞的活动。其中，光遗传学技术可以在毫秒级的时间尺度上调控靶细胞，化学遗传学技术可以在1 min到1 h不等的时间尺度上调控靶细胞，二者互为补充，改变了研究神经环路的传统思维，可以揭示某种特定行为的中枢机制，为中医药脑科学研究提供了一种全新的研究手段。

1 光遗传学技术和化学遗传学技术简介

1.1 光遗传学技术简介

光遗传学是将基因遗传学技术与光学技术结合起来的一种新型生物技术。早在20世纪70年代，Oesterhelt等[1]首次发现了微生物单成分光激活的离子泵细菌视紫红质，之后越来越多的微生物视蛋白被报道;2005年，斯坦福大学的Deisseroth等[2]在离体神经元上转染光敏蛋白，经光照刺激后该神经元活性可被精确调控;2006年，Deisseroth[3]将这一技术正式定义为“光遗传学技术”。2011年，Nature Methods将光遗传学技术誉为了21世纪神经生物学中最具影响力的技术。

光遗传学是利用细菌/绿藻视通道蛋白，使某一特定类型的神经元被激活或抑制，从而特异性地调节这些神经元的活动。这类对光敏感的蛋白根据不同的作用可以分为兴奋性光敏感蛋白和抑制性光敏感蛋白。视紫红质2（Channelrhodopsin-2，ChR2）是目前最常用的兴奋性光敏感蛋白，它能够被蓝光激活，阳离子内流使细胞去极化，产生动作电位，提高细胞的兴奋性[4];盐细菌视紫红质（Natronomonas-pharaonishalorhodopsins，NpHRs）是一种常见的抑制性光敏感蛋白，在被黄光激活后氯离子泵入细胞，引起细胞膜超极化，从而抑制细胞的兴奋[5]。见图1。

光敏感蛋白在神经细胞上成功表达后，通过不同强度的光照刺激即可特异性地操控神经元的放电。光刺激既可以在毫秒级的时间尺度上精确控制光脉冲的宽度、频率及潜伏期，又可以长时间操控神经元。然后观察光刺激后的动物行为并记录信号，进行效应评估。近年来，光遗传学技术还可以与双光子[6]、膜片钳等[7]技术结合，更加精确地解析环路结构，为科研工作者提供更好的平台;同时，新型光敏蛋白，新的光导入方法，光敏感蛋白靶向表达，转基因动物品系的发展都为光遗传提供更大的灵活性，为实验研究提供更大的操作空间[8]。

1.2 化学遗传学技术简介

化学遗传学是20世纪90年代开始兴起的交叉学科，是利用遗传学原理，通过生物活性小分子与蛋白相互作用来研究生物学系统功能的一种方法[9]。1998年，哈佛大学的Stuart Schreiber教授[10]发表名为《Chemical Genetics Resulting from a Passion for Synthetic Organic Chemistry》的綜述，把利用小分子活性化合物为探针、以多种方法影响靶蛋白的功能的方法定义为化学遗传学。与经典遗传学类似，分为正向的化学遗传和反向的化学遗传，前者用动物细胞、微生物以及它们的裂解产物来寻找对生物过程产生影响的小分子，并确定相应的蛋白靶;后者则先高表达某种蛋白，寻找与蛋白结合或影响纯蛋白功能的小分子，从而确定小分子在体内对此蛋白的功能影响。化学遗传学具有高效、可逆、特异性地干扰靶标蛋白的功能，从而实现对生物学系统功能定量时空可控。

在神经科学领域，2007年，Roth观察组报道了基于人类毒蕈碱型乙酰胆碱受体改造的G蛋白偶联受体（G-protein Coupled Receptors，GPCRs）只能被特定的设计药物激活，而不能被内源性配体激活，这些受体被称作DREADDs（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs），即由特定药物激活的受体。GPCRs是由800多个基因编码的跨膜蛋白，主要分为Gq、Gi、Gs以及G12 4个家族，在中枢神经系统内参与了多个生理过程，常用的化学遗传受体为Gq与Gi。Gq主要通过偶联人毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3，其激活导致细胞去极化，细胞兴奋性增强，细胞放电增加;Gi主要通过偶联人毒蕈碱型乙酰胆碱受体M4，其激活将导致细胞超极化，抑制细胞的放电活动[11]。见图1。根据启动子的不同类别，化学遗传受体可以靶向不同种类的神经元，如谷氨酸能、GABA能、胆碱能、多巴胺能等神经元[12-13]，还可以调节胶质细胞的电活动[14-15]。

通过病毒转导（例如启动子特异性相关病毒）、转基因动物或者结合两者将化学遗传受体递送至目标区域并表达，然后经腹腔注射或者经饮用水给予化学遗传配体CNO（Clozapine N-oxide）即可激活受体[16]。化学遗传配体CNO一直以来被认为是一种惰性药物[17-18]，只与化学遗传受体DREADDs结合而不会与内源性受体结合。腹腔注射1 mg/kg CNO 15 min后即可达到血浆浓度峰值并且持续2 h左右[19]，因此可以有效地长时程控制神经元的活动。而近年来，有研究表明，CNO与DREADDs的亲和率低，而CNO的代谢产物氯氮平与DREADDs却有很高的结合率[20]。

2 光遗传学技术和化学遗传学技术在中医药脑科学研究中的应用

光遗传学技术和化学遗传学技术具有高度时间、空间特异性及细胞类型特异性等优点，在脑科学领域的研究中发挥着重要作用。目前，这两项技术在中医药脑科学的研究逐渐增多，并且取得了许多重要的进展，这些研究提示着光遗传学技术和化学遗传学技术在中医药脑科学研究中的运用是可行的，并且具有广阔的运用前景。

2.1 药物成瘾

近年来，由于中医药在治疗药物成瘾方面具有不良反应小、效果好及可防止复吸等优势[21]，其机制研究也得以迅速发展。先前的研究表明，在毒品成瘾动物模型中，中脑边缘的多巴胺释放增加，针刺“神门”穴、“太冲”穴及“筑宾”穴等能够缓解毒品诱导的成瘾行为，减少伏隔核多巴胺的释放[22-23]，逆转毒品诱导的多巴胺能神经元放电频率降低[24]，提示针刺治疗药物成瘾与中脑边缘系统的多巴胺信号有关。2020年，Kim团队运用光遗传学技术具体地阐述了杏仁核的多巴胺信号系统在针刺治疗冰毒成瘾的具体作用[25]。该研究先将携带有eNpHR3.0的腺相关病毒表达在小鼠的杏仁核脑区，在针刺“神门”穴的同时使用黄光抑制杏仁核区的神经元，发现针刺缓解成瘾症状的作用被逆转，停止黄光刺激后，针刺激活杏仁核的神经元，抑制多巴胺的释放，缓解冰毒诱导的成瘾行为;随后，研究者探究激活杏仁核区的神经元的能否模拟出针刺的疗效，于是将携带有ChR2的腺相关病毒注射到杏仁核相同部位，发现使用绿光激活神经元后能模拟针刺的效应，即抑制了冰毒诱导的活动增强;另外，针刺能抑制成瘾小鼠的伏隔核释放多巴胺，而电损毁杏仁核后，针刺的该作用被逆转。这些结果表明，杏仁核区的神经元在针刺缓解成瘾症状时发挥着重要的作用。

2.2 疼痛

针刺镇痛是中医治疗疼痛的重要组成部分，针刺镇痛的中枢神经环路是该领域的主要研究方向。先前关于中枢神经环路的研究大多是基于神经电生理方法等开展的。和传统电生理技术相比，光遗传学技术和化学遗传技术可以更直观、精确地反映大脑不同类型的神经元之间的相互作用。2019年，华中科技大学李熳团队运用化学遗传技术研究针刺镇痛的中枢机制[26]。研究发现，在慢性坐骨神经损伤模型和膝骨关节炎模型中，用化学遗传学技术抑制小鼠腹外侧中脑导水管灰质（vlPAG）中的GABA能神经元，模拟了电针“环跳”穴、“阳陵泉”穴的镇痛作用，即都能减轻2种模型的机械痛阈值和热痛阈值;随后，他们又发现激活vlPAG中的GABA能神经元只能部分减弱电针的镇痛效应，同时激活vlPAG中的GABA能神经元及抑制vlPAG中的谷氨酸能神经元则可以有效地拮抗电针的镇痛效应，该研究提示了vlPAG中的不同类型的神经元在针刺镇痛中的作用不同。

另外，光遗传学技术在疼痛的研究中也取得了很大的进展。有研究表明，用光遗传学技术特异性地激活臂旁核投射至中央杏仁核的兴奋性通路，小鼠的痛敏感性显著降低[27];在神经病理痛模型中，用光遗传学技术抑制脊髓投射至前扣带皮层的谷氨酸能神经元，能显著抑制小鼠的机械痛阈值[28];Zhou等[29]运用光遗传学技术证明前额叶皮层投射至伏隔核的兴奋性通路参与慢性病理性疼痛的调节，通过在前额叶皮层的兴奋性神经元上表达NpHR，在光刺激时即可选择性地抑制这些神经元向伏隔核的投射，结果显示大鼠的痛感觉加重。再结合目前针刺镇痛的研究逐渐涉及到中枢层面[30-31]，以及局部核团损毁术不具有特异性，故何俏颖等[32]具体阐述了光遗传学技术在针刺镇痛的研究中的可行性及研究范式，并且主张将光遗传学技术运用到针刺镇痛的研究中，以推动针刺镇痛的研究水平进入新的阶段。

2.3 应用展望

除了在药物成瘾和疼痛方面的研究，光遗传学技术和化学遗传学技术在其他疾病模型中的应用也非常广泛。例如，在癫痫的研究中，Krook等[33]发现，无论用NpHR抑制海马兴奋性神经元或用ChR2激活GABA能神经元，用光激活时都会迅速抑制颞叶癫痫的发作，而用化学遗传学技术激活内侧隔-海马之间的胆碱能回路也能减轻癫痫发作[34];在阿尔兹海默症的研究中，Etter等[35]利用光遗传学技术激活内侧隔小白蛋白神经元，可以明显改善阿尔兹海默症模型小鼠的记忆功能，Cordella等[36]将兴奋性DREADDs受体表达在阿尔兹海默症模型小鼠的海马中，利用CNO激活后发现小鼠的记忆和认知功能得到了很大的改善;另外，在抑郁症的研究中也取得了很大的进展，Son等[37]证明，用光遗传学技术选择性激活前额叶皮质（Prefrontal Cortex，PFC）中的谷氨酸能神经元能显著改善抑郁样症状，而用化学遗传学技术激活成年小鼠PFC中5-羟色胺（5-HT）阳性的神经元，能缓解小鼠在出生早期暴露于5-HT再摄取抑制剂引起的抑郁症状[38]。这些研究表明，将光遗传学技术和化学遗传学技术应用于中医药脑科学研究的前景是十分客观的。

目前，关于中药、针灸作用的神经环路和信号通路的研究成为了一大焦点。例如，王浩等人认为针刺调节胃功能可能与迷走背核复合体、蓝斑、小脑顶核及下丘脑视旁核等有关，但是这些核团之间是否具有某种联系尚不清楚，如果将光遗传学技术和化学遗传学技术运用于该神经环路的研究中，将更有利于明确针刺在调节胃功能中的作用机制[39]。通过光遗传学技术和化学遗传学技术特异性地操控神经环路，再检测实验动物的行为学变化，可以更加直观地反应大脑不同核团、不同神经元群体及不同的环路在中药、针刺信号中的作用，使中医药脑科学研究进入一个新的高度。见图2。

近年来，有学者开始运用光遗传技术和化学遗传技术进行中医药脑科学研究并且逐渐与神经电生理技术、系统生物学技术等多种研究方法的联合运用[6-7]，在更深入地揭示中医药的脑科学理论机制的同时，与应用研究紧密相连，探析脑内小分子化合物、神经元及其生物学效应，揭示了生命的基本活动规律，为候选药物和治疗仪器的开发提供了科学的依据。

3 小结

光遗传学技术在神经细胞中表达光敏感蛋白，通过光刺激来激活光敏感蛋白，可以在毫秒级的时间尺度上特异性地操控靶细胞;化学遗传学技术在神经细胞中表达改造后的G-蛋白偶联受体，通过腹腔注射或饮用水给予外源性配体来激活G蛋白偶联受体，可以长时间调控靶细胞的放电活动。目前，这两项技术在针灸治疗药物成瘾及电针镇痛等方面已经取得了重要的进展。比如，针刺通过激活杏仁核的神经元，抑制多巴胺的释放，从而缓解冰毒诱导的成瘾行为;中脑导水管灰质的GABA能神经元和谷氨酸能神经元在针刺镇痛中扮演着重要的角色。这些研究在清醒的动物实验中将神经细胞与针刺效应联系起来，开阔了传统中医药脑科学研究的思路，为光遗传学技术和化学遗传学技术在中医药脑科学研究的应用奠定了基础。

4 讨论

传统的中医药脑科学研究常运用药理学、分子生物学及蛋白组学等技术，虽取得了一定的进展，但是无法实现在活体动物内进行研究，不能对神经细胞进行实时动态的调控，不能精确直观地揭示中医药信号在中枢的传递过程。光遗传学技术和化学遗传学技术的出现扭转了这一局面，通过这两项技术可以观察中医药干预在活体动物内对细胞信号的调控，实现对神经环路的“开关”;通过比较“开关”前后的行为学变化，明确中医药的中枢机制;光刺激或配体激活都有可逆性，对神经环路的“开关”操作具有可重复操作的特点，使实验结果可双向验证，进而提高实验数据的科学性、精确性和稳定性。另外，光遗传学技术和化学遗传学技术与神经电生理、有机合成技术的联合应用，可以更精确地将行为学与神经细胞的电活动联系起来，更深入地解析神经环路的功能。因此，光遗传学技术和化学遗传学技术在中医药脑科学研究中具有无可替代的优势与前景。

但是，这两項技术在使用过程中也存在以下问题，例如：光遗传学技术中使用的视蛋白和化学遗传学技术中使用的改造后的GPCRs都是外源性蛋白，在没有激光刺激或配体激活的情况下仍具有一定的生物活性及细胞毒性[40-41];光遗传学技术在使用激光刺激组织时会产生热量，对细胞造成影响[42];化学遗传学技术在使用配体去激活GPCRs时，配体的代谢产物会产生不同的不良反应[43-44]。针对这些问题，研究者会在实验过程中设置荧光标记组来观察手术及外源性蛋白对实验结果是否有影响，缩短光照刺激的时间以减少热量的产生，尽可能地使用小剂量的化学遗传配体以减少不良反应的产生。明确这两项技术存在的问题及相关的解决方案，将更有利于这两项技术在中医药脑科学研究中的应用。

综上所述，中医药治疗脑部疾病具有良好的临床疗效，但是传统的研究手段尚不能在活体动物模型中精确、直观地揭示其内在的机制;光遗传学技术和化学遗传学技术在神经科学领域具有靶向性、高时空精确性和可重复操作等优势，为中医药脑科学研究提供了一种新的思路，为今后的研究提供借鉴，从而推动中医药脑科学研究的进一步发展。

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（2020-05-10收稿责任编辑：徐颖）

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