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多壁碳纳米管净化-超高效液相色谱串联质谱法测定香蕉中8种新烟碱类杀虫剂

范文

乐渊邓正敏刘春华吴南村

摘要：建立基于多壁碳纳米管净化、超高效液相色谱串联质谱技术同时测定香蕉中呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂残留量的分析方法。香蕉样品中用含1%乙酸的乙腈提取后，经多壁碳纳米管净化后，用超高效液相色谱-串联质谱法测定。呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂的质量浓度在0.005～0.200 mg/L范围内线性良好，最低检出限在0.03～0.44 μg/kg 之间，相关系数均大于0.99，平均加标回收率在75.2%～114.9%之间，相对标准差在0.3%～9.5%之间。与N-丙基乙二胺和石墨化碳黑吸附剂相比，多壁碳纳米管具有净化效果好和效率高等優点。方法学考察及实际样品的测定证明该方法简便、快速、准确，可用于香蕉中呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂残留量的检测。

关键词：香蕉;新烟碱类杀虫剂;多壁碳纳米管;超高效液相色谱-串联质谱;加标回收率;残留量

中图分类号：S481+.8?文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）04-0181-05

收稿日期：2018-11-22

基金项目：现代农业产业技术体系建设专项（编号：CARS-31-13）;热带农产品质量安全科技创新团队项目（编号：1630082017002）。

作者简介：乐?渊（1985—），男，江西抚州人，硕士，助理研究员，主要从事农产品质量安全研究。E-mail：leyuan06@sina.com。

新烟碱类杀虫剂作用于昆虫神经系统突触后膜的烟碱乙酰胆碱受体及其周围的神经，使昆虫保持兴奋、麻痹而后死亡[1]，由于具有高效率、高选择性、高持效性和对哺乳动物低毒等特点而被广泛应用于农业生产中，在香蕉生产中也可用于防治蓟马、红蜘蛛、夜蛾、香蕉象甲等害虫[2-3]。近年来研究表明，新烟碱类杀虫剂对蜜蜂、家蚕和蚯蚓等非靶标生物存在较大毒性，且在香蕉生产过程中过量使用或滥用杀虫剂会造成果实中存在农药残留，易引发生态环境系统和农产品质量安全问题[4-6]。因此，开发香蕉中新烟碱类杀虫剂分析方法对于保障香蕉产品质量安全和消费者健康具有重要意义。

美国农业部Anastassiades等开发的QuEChERS方法是目前各实验室中常用的农药多残留分析的前处理方法，包含液液萃取和微型的固相分散萃取等2个步骤[7]。QuEChERS方法的优点是效率高、适用性好和有机溶剂使用量少，但也存在净化能力弱的缺点。为改善QuEChERS方法的净化能力，在常用的N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基键合硅胶（C18）和石墨化碳黑（GCB）等吸附材料之外，研究新吸附材料成为热点。多壁碳纳米管（MWCNTs）凭借比表面积大、吸附性能好等优点受到研究者的关注，并被应用于农药残留检测领域[8-10]。本研究采用多壁碳纳米管作为吸附材料，结合液相色谱-串联质谱仪的可分析农药范围广、灵敏度高和选择性好等特点，探讨建立测定香蕉中呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂的改进型QuEChERS方法。

1?材料与方法

1.1?仪器与试剂

主要的试验仪器有TripleQuad 4500超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪配有电喷雾离子源（ESI）和Analyst 1.6.3工作站（美国应用生物系统公司）、ACQUITY_ UPLCTM BEH C18 1.7 μm×2.1 mm×50 mm 色谱柱[沃世特科技（上海）有限公司]、AL204型电子分析天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]、VS-24SMTi型离心机（美国VISION公司）。

主要的试剂有呋虫胺、烯啶虫胺、噻虫嗪、吡虫啉、噻虫胺、啶虫脒、氟啶虫胺腈、噻虫啉等8种农药标准品（农业农村部环境保护科研监测所，纯度≥99%）;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸（美国Fisher公司，色谱纯）;多壁碳纳米管（天津博纳艾杰尔科技有限公司）外径为10～20 nm，内径为5 nm，长度为5～15 μm，使用前在120 ℃下加热3 h去除残留的水份;石墨化碳黑吸附剂（GCB）、N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）（美国安捷伦科技公司）;乙酸铵、乙酸钠、氯化钠（广州化学试剂厂）;无水硫酸镁[西格玛-奥德里奇（上海）贸易有限公司];柠檬酸钠和柠檬酸二钠盐倍半水合物（上海阿拉丁生物科技股份有限公司）;试验用水为经Milli-Q净化系统0.22 μm过滤膜过滤的纯化水;香蕉样品购自本地超市和水果批发市场。

1.2?标准溶液的配制

1.2.1?储备液的配制?将呋虫胺等8种农药用乙腈配制成浓度为10 mg/L的混合标准储备液，在-18 ℃下避光保存，有效期为1个月。

1.2.2?标准溶液的配制?将上述标准储备液用乙腈稀释成浓度为0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200 mg/L的系列混合标准溶液，现配现用。取空白香蕉样品按1.3方法进行前处理，得到空白香蕉基质溶液。氮吹至近干后，用1 mL相应浓度乙腈配制的标准溶液定容，得到基质匹配标准溶液。

1.3?样品前处理

香蕉样品（分为全蕉和蕉肉2份）用组织捣碎机捣碎，装入洁净容器内，作为试样密封并于-18 ℃ 下保存。

准确称取10.00 g均质试样于50 mL具塞离心管中，加入10.0 mL乙腈（含1%乙酸）、1.0 g乙酸钠、4.0 g无水硫酸镁和1颗陶瓷均质子，剧烈振荡1 min。然后以5 000 r/min的转速离心5 min。取上清液1.00 mL于预先称有5 mg多壁碳纳米管和150 mg无水硫酸镁的15 mL离心管中，涡旋1 min，再以5 000 r/min的转速离心5 min。上清液经0.22 μm 聚四氟乙烯微孔膜过滤，待超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪（UPLC-MS/MS）分析。

1.4?仪器工作条件

超高效液相色谱工作条件：流动相A为水，流动相B为甲醇;柱温为35 ℃;样品室温度为15 ℃;进样体积为3 μL;流速为0.25 mL/min。梯度洗脱程序见表1。

质谱工作条件：离子源电喷雾;离子化电压为5 500 V;温度为500 ℃;气帘气压力为207 kPa;喷雾气压力为379 kPa;辅助加热气压力为379 kPa;碰撞气压力为55 kPa。多反应监测模式下的质谱参数见表2。

2?结果与分析

2.1?UPLC-MS/MS工作條件的优化

在电喷雾离子源电离模式下，以流动注射方式分别对呋虫胺等8种杀虫剂的单标溶液进行母离子全扫描，再对各自的子离子进行全扫描，每个化合物选择2对响应值高的特征离子对作为定量及定性离子对，并进行质谱多反应监测（MRM）参数的优化，优化结果见表2。

在上述质谱条件下，测试甲醇-0.02%甲酸水溶液、甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液、乙腈-5 mmol/L 乙酸铵水溶液、甲醇-2 mmol/L 氨水溶液、甲醇-水等5种流动相体系。结果表明，当使用乙腈作为有机相时，大部分化合物色谱分离度不理想，集中在2～3 min时间段内出峰。当使用甲醇-水流动相体系时各化合物的分离度较好且响应值最高，其中吡虫啉、呋虫胺、烯啶虫胺和噻虫啉较甲醇-甲酸水溶液和甲醇-乙酸铵水溶液体系提高约3倍。因此，本试验采用甲醇-水作为流动相。图1为MRM模式下0.05 mg/L 标准溶液的提取离子流色谱。

2.2?提取条件的选择

由于乙腈的通用性强，对农药的溶解度大，试验选择乙腈作为提取溶剂。为改善一些对pH值较为敏感的农药的检测，QuEChERS方法中常加入醋酸盐缓冲体系或柠檬酸盐缓冲体系[11-12]。试验尝试了在提取过程中加入上述2种缓冲盐体系，与纯乙腈溶液作为参照，对提取效率进行比较。试验在香蕉空白样品中添加适量标准溶液（添加量为50 μg/kg），提取后不经净化直接用UPLC-MS/MS测定。条件1：提取溶剂为纯乙腈，后加入4.0 g无水硫酸镁和1.0 g氯化钠;条件2：提取溶剂为含1%乙酸的乙腈溶液，后加入4.0 g无水硫酸镁和1.0 g 乙酸钠;条件3：提取溶剂为乙腈，后加入4.0 g 无水硫酸镁、1.0 g氯化钠、1.0 g二水柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸二钠盐倍半水合物。结果表明，条件2的8种杀虫剂的提取效率最高，呋虫胺和烯啶虫胺比条件1高约50%，比条件3高20%;其他6种杀虫剂比条件2、3高约10%。因此，本试验选择添加醋酸盐缓冲体系的乙腈作为提取条件。

2.3?净化条件的选择

为考察MWCNTs、PSA和GCB对香蕉提取液的净化效果，分别取1 mL香蕉提取液，用3种条件进行净化：（1）5 mg MWCNTs+150 mg无水硫酸镁;（2）50 mg PSA+150 mg无水硫酸镁;（3）10 mg GCB+150 mg无水硫酸镁。参照文献[13]对色素净化效果进行考察，结果如图2所示。PSA对色素几乎无净化效果，10 mg GCB净化了96%的叶黄素和全部的叶绿素，5 mg MWCNTs净化了99%的叶黄素和全部的叶绿素。与GCB相比，MWCNTs比表面积更大，还具有中空结构，净化效率更高。因此，本试验选择5 mg MWCNTs+150 mg无水硫酸镁作为净化条件。

2.4?方法的线性范围和检出限

按“1.2.2”节配制一系列浓度的呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂香蕉基质匹配标准溶液，采用“1.4”节中的方法进行测定，以仪器响应值峰面积对各目标物的质量浓度进行线性回归。结果表明，呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂的质量浓度在0.005～0.200 mg/L范围内线性良好，相关系数和回归方程见表3。

以满足方法学要求的最低添加回收水平作为定量限，呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂在全蕉和蕉肉中的定量限均为5 μg/kg。检出限采用样品加标方式测定并计算，加标样品经“1.3”节处理后测定，以8种杀虫剂检测信号为3倍基线噪音时的添加浓度为方法检出限，呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂的检出限见表3。

2.5?方法的精密度和回收率

取空白香蕉样品，按5、10、50 μg/kg 3个水平进行加标试验，按“1.3”节进行前处理，平行测定6次，作回收率和精密度试验。结果（表4）表明，呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂在全蕉中平均回收率在80.2%～114.9%之间，相对标准差在0.3%～3.5% 之间;在蕉肉中平均回收率在75.2%～102.0% 之间，相对标准差在0.5%～9.5%之间;均满足NY/T 788—2004《农药残留试验准则》中农药残留分析方法要求[14]。

2.6?基质效应

基质效应是指样品分析液中除分析物以外的共流出组分改变了分析物的响应值，从而影响定量分析的准确度和重现性，其机制可能是共流出组分影响了电喷雾接口的离子化效率[15]。通过测定呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂在香蕉基质匹配标准溶液中校正曲线的斜率（A）及其在纯溶剂标准溶液中校正曲线的斜率（B），得到基质效应（matrix effect，简称ME）=（A-B）/B×100%。若ME>0，则表示基质对分析物的响应产生增强效应;若ME<0，则表示基质对分析物的响应产生抑制效应;若ME=0，则表示不存在基质效应。当-20%≤ME≤20%时，基质干扰程度较低;当-50%≤ME<-20% 或20%50%，表示基质干扰程度强烈[16]。表5为香蕉基质中呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂的基质效应。

結果表明，呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂均表现为基质抑制效应。在全蕉中，噻虫啉干扰程度较低，啶虫脒、噻虫嗪、呋虫胺、烯啶虫胺和氟啶虫胺腈等5种杀虫剂表现为中等程度的基质干扰效应，吡虫啉、噻虫啉基质效应干扰强烈。在蕉肉中，8种新烟碱类杀虫剂基质干扰程度均较低。

为消除基质效应所带来的干扰，提高分析结果的准确度，常采用标准加入法、基质匹配标准溶液、使用分析保护试剂和同位素内标法等[17-18]。在农药残留分析中，最常见的是用基质匹配标准溶液进行消除。从分析结果可知，当只须要测定全蕉中噻虫啉和蕉肉中8种新烟碱类杀虫剂时，由于基质效应较弱可直接使用溶剂标准溶液进行定量;当须要测定全蕉中其他7种新烟碱类杀虫剂时，就须要使用基质匹配标准溶液，才能定量准确。

2.7?实际样品的测定

采用本试验建立的方法测定采集于本地4个超市和1个水果批发市场的15份香蕉样品。其中2份全蕉样品检出啶虫脒，含量分别为0.040、0.012 mg/kg，均低于《GB 2763—2016?食品安全国家标准?食品中农药残留最大限量》中规定的最大残留限量值2 mg/kg[19]。相应的蕉肉样品中啶虫脒为未检出，表明啶虫脒主要残留于香蕉果皮中。其他样品均未检出呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂。

3?结论

本研究建立一种基于多壁碳纳米管的净化方法，结合UPLC-MS/MS的高分辨能力来快速检测香蕉中呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂残留量。与N- 丙基乙二胺和石墨化碳黑等吸附剂相比，多壁碳纳米管具有色素净化效果好、效率高等优点。本试验优化了超高效液相色谱与质谱的采集参数并考察了基质效应，方法学考察及实际样品测定证明该方法具有简便、快速、准确度高等优点，可用于香蕉中呋虫胺等8种新烟碱类杀虫剂残留量的检测，具有一定的推广价值。在香蕉生产过程中使用的农药，除新烟碱类杀虫剂外还包括有机磷类、菊酯类杀虫剂、杀菌剂和植物生长调节剂等，将该方法延伸至更多目标物，能有效提高食品安全检测效率，将会是未来研究的一个关注点。

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