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赣南脐橙致腐菌的分离鉴定及其对2-苯乙醇敏感性分析

范文

熊大维顾斌涛刘兰黄筱萍

摘要?从采摘后贮存自然发病的赣南脐橙中分离出4种病原真菌，根据菌株形态学观察和rDNA-ITS序列分析进行鉴定，这4种病原真菌分别为意大利青霉（Penicillium?italicum）、指状青霉（Penicillium?digitatum）、柑橘链格孢（Alternaria?citri）和芽枝状枝孢（Cladosporium?cladosporioides）。生物保鲜剂2-苯乙醇（2-PE）可有效地抑制这4种病原真菌的孢子萌发和菌丝生长，但对不同致腐菌抑菌效果差异显著（P<0.05）。2-PE对芽枝状枝孢霉、指状青霉菌、柑橘链格孢和意大利青霉菌菌丝生长的最小抑菌浓度分别为1.4、1.8、2.2和2.4?g/L。

关键词?脐橙病原菌;形态学观察;分子鉴定;2-苯乙醇;抑菌

中图分类号?TS255.3文献标识码?A文章编号?0517-6611（2020）07-0186-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.053

Isolation?and?Identification?of?Citrus?Pathogens?from?Navel?Orange?in?Southern?Jiangxi?Province?and?Sensitivity?Analysis?to?2Phenylethanol?Alcohol

XIONG?Dawei，?GU?Bintao，?LIU?Lan?et?al

（Institution?of?Microbiology，?Jiangxi?Academy?of?Sciences，?Nanchang，?Jiangxi?330096）

Abstract?Four?citrus?pathogens?were?isolated?from?rotten?orange?of?Southern?Jiangxi?Province?after?harvesting.?According?to?the?observation?of?the?morphological?characteristics?of?fungi?and?the?analysis?of?rDNAITS?sequence，?the?four?citrus?pathogens?were?identified?as?Penicillium?italicum，?Penicillium?digitatum，?Alternaria?citri?and?Cladosporium?cladosporioides.?The?biopreservative?2phenylethyl?alcohol?can?effectively?inhibit?the?spore?germination?and?hyphae?growth?of?the?four?citrus?pathogens，?but?the?antibacterial?effects?of?different?saprophytic?fungi?were?significantly?different?（P<0.05）.?The?minimum?inhibitory?concentrations?for?the?hyphae?growth?of?C.?cladosporioides，?P.?digitatum，?A.?citri?and?P.?italicum?were?1.4，?1.8，?2.2?and?2.4?g/L，?respectively.

Key?words?Citrus?pathogens;Morphological?observation;Molecular?identification;2Phenylethanol?alcohol;Antibacterial

基金项目?江西省重点研发项目（S2018ZPYFE1016）;江西省科學院重大研究专项（2018-YZD1-03）。

作者简介?熊大维（1975—），男，江西靖安人，助理研究员，从事微生物学研究。通信作者，研究员，硕士，从事生物工程及生物活性产物的制备和应用研究。

收稿日期?2019-10-09;修回日期?2019-10-28

近年来，我国柑橘产业发展迅猛，年产量超过2?900万t，由于成熟度相对集中，其贮藏加工业的发展远远滞后于种植业，每年鲜果在采摘后贮藏、运输和销售环节的损失巨大，果品腐烂率为10%～40%[1-2]，造成重大的经济损失。引起柑橘腐烂的病害有20多种，其中约90%的柑橘采后腐烂是由意大利青霉引起的青霉病，指状青霉引起的绿霉病和链格孢霉引起的黑腐病[3-7]。目前主要采用化学防腐剂进行防腐保鲜，由于存在病原菌对化学制剂易产生抗药性，且对人体健康具有一定危害和造成环境污染，已被陆续禁止使用[8-9]。

2-苯乙醇（2-PE）是一种具有玫瑰气味的芳香醇，广泛存在于自然界中，具有广泛的抗菌活性，可抑制大肠杆菌等G-菌和枯草芽孢、金黄色酿脓葡萄球菌等G+菌的生长，对酵母菌、青霉菌等真菌亦具有显著的抑制作用[10-12]。其在食品防腐保鲜上的研究也已经开展，刘普[13]研究表明生防菌柠檬形克勒克酵母菌对柑橘采后青、绿霉菌具有很好的防治效果，分离获得对抑制真菌的有效成分为该菌产生的2-PE。方静凡[14]发现2-PE对导致水果（如柑橘、苹果、葡萄等）腐败的许多真菌具有良好的防治效果，并对其最低抑菌浓度和抑菌机理进行了初步研究;采用产2-PE的酵母菌液涂抹，在果品上形成菌膜以达到生防效果。陈利军等[15]发现2-PE对植物病原真菌如草莓灰霉病菌、白菜黑斑病菌等具有显著的抑菌效果。

该研究从自然腐烂的脐橙中分离获得4种致腐真菌，通过形态学观察和分子学鉴定，确定了其种、属。针对这些致腐真菌，采用生物法转化合成的2-PE进行了抑菌试验，确定了2-PE对不同真菌的孢子萌发最小抑菌浓度（MIC）和菌丝生长最小抑菌浓度。由于2-PE具有较好的水溶性和稳定性，安全无毒，对真菌有较好的抑制作用，可开发为一种新型的生物防腐剂用于果蔬、食品的保鲜，为今后的植物病原菌的抑菌试验和抑菌机制研究提供基础。

1?材料与方法

1.1?材料与仪器

脐橙摘自赣州（信丰县和安远县）不同果园，置通风处保存。2-PE粗提液，是由本实验室生物转化液经乙醇抽提浓缩而成的质量分数为80%～90%粗制品[16];马铃薯葡萄糖琼脂（potato?dextrose?agar，PDA）培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司。

BX53型显微镜（日本Olympus公司）;Prachfum?224-1CN分析天平（德国Sartorius公司）;L204电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）股份有限公司）;MJX-250B-Z霉菌培养箱（上海博迅医疗生物仪器有限公司）;CD-AX数显式游标卡尺（世达工具（中国）有限公司）;SW-CJ-ID型双人净化工作台（苏州净化设备有限公司）;LDZX-50KBS手轮型立式蒸汽灭菌锅（上海申安仪表有限公司）。

1.2?方法

1.2.1?菌种分离纯化与鉴定。选择具有典型发病症状的脐橙，用75%乙醇清洗患处表面，再用无菌刀片切取病患交界处5?mm×5?mm的组织，用2%NaClO溶液表面消毒，无菌水冲洗3次，接入PDA平板培养基上，于（28±0.5）℃倒置培养，待菌丝长出后，用无菌接种针挑取前缘菌丝植入另一培养基内培养，重复上述操作3次即可获得纯化菌株。

1.2.2?真菌种属鉴定。

1.2.2.1?病原真菌形态学鉴定。通过观察病原体菌落特征和培养特佂，包括菌落大小、颜色、边缘、渗出物等，在显微镜下观察菌丝生长情况、孢子形态、产孢结构及有无横隔的特征，进而进行显微形态分类鉴定。参照真菌鉴定手册进行病原菌的初步鉴定[17]。

1.2.2.2?病原真菌的rDNA-ITS序列分析。

采用rDNA-ITS分子鉴定法对病原菌株进行分析。以不同病原菌的DNA作为模板，用通用引物扩增出约550?bp的rDNA-ITS序列，PCR反应条件：预变性94?℃?3?min;变性95?℃?1?min，退火54?℃?40?s，延伸72?℃?40?s，35个循环;终延伸72?℃?10?min，保温4?℃?60?min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，于上海生物工程有限公司完成测序。将测序获得rDNA-ITS序列在GenBank核酸数据库中进行Blast搜索比对。

1.2.3?2-PE对病原真菌孢子萌发率的影响。将4种病原菌株分别于PDA斜面培养基中28?℃培养6?d，分别加入10?mL无菌水，用玻璃棒洗下孢子，菌液再分别倒入20?mL注射器中，经4层无菌纱布过滤，收集孢子液，于4?℃冰箱贮存备用。用血球计数器计数孢子浓度，稀释孢子液为10-4和10-5，涂布于含2-PE分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2?g/L的培养基中，以不加2-PE的平皿为对照，每个梯度涂布3皿，于28?℃培养3～6?d，计算孢子萌发率。

孢子萌发率（%）=处理平皿中菌落数对照平皿中菌落数×100（1）

1.2.4?菌丝生长抑制率的测定（采用菌丝生长速率测定法）。将4种病原菌孢子液分别涂布于PDA平皿中，于28?℃培养6～7?d，用打孔器在培养基上打孔，取生长一致的菌苔，备用。配制含2-PE浓度为0.4、0.8、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4?g/L的培养基，用量杯量取等量体积倒入平皿中，用￠5?mm打孔器切取生长一致的病原菌菌块，移植于含药剂的平皿中，每块平皿植入3块菌苔做平行试验，另设加无菌水的PDA培养基平板作为对照。置于28?℃生化培养箱中培养，用游标卡尺测量菌落直径，取?120?h的菌落平均值計算菌丝生长抑制率，测定2-PE对病原菌的抑菌率[18]。

菌丝生长抑制率（%）=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径-菌饼直径×100（2）

2?结果与分析

2.1?病原真菌的形态学鉴定

在真菌识别中，有形态学识别，如菌落形态、颜色、在不同时间的生长状态、菌丝及孢子的形态及大小等。从自然腐烂的脐橙中分离出4种真菌，分别编号为FZ-1、FZ-2、FZ-3和FZ-4，菌落形态及孢子生长描述如下。

2.1.1?FZ-1菌株。菌株在PDA培养基培养2?d后，菌落表面平整呈白色，少许菌落中间略微凸起并附有青绿色孢子，菌落稀疏蓬松;培养3?d后，菌落表面仍平整，表面呈青绿色，边缘呈白色，表面附有青绿色孢子，菌落稀疏蓬松。菌丝体由分枝的、分隔的、光滑的、透明至半透明的菌丝构成，菌丝2.7～6.0?μm宽。分生孢子梗与菌丝异形或同形，单菌丝构成，透明至半透明，光滑，薄壁，有分隔，分枝或不分枝，圆柱形，3.3～9.0?μm宽。产孢细胞单点芽植型产孢，（14.0～26.0）?μm×（3.0～4.2）μm，轮生，每轮2～4个倒棒状或近圆柱形的产孢细胞，顶部变细，中间略膨大，基部平截，透明，顶生或侧生，光滑。分生孢子全壁芽植型，单生，孢子呈链状向上生长，质地干，未成熟时透明，成熟后半透明至淡灰黑褐色，光滑，壁薄，基部平截，顶部圆滑，无隔膜，部分近球形至球形，椭球形或倒卵形（5.0～12.5）μm×（4.2～10.1）μm（=7.8?μm×6.0?μm，n=45）;部分近圆柱形（8.4～24.0）?μm×?（2.8～5.5）μm（=15.0?μm×4.3?μm，n=35）;分生孢子裂解式脱落。还有一部分非常小的分生孢子，近球形或椭球形至球形（3.2～6.0）μm×（2.8～4.3）μm（=?4.2?μm×3.3?μm，n=45）。图1为FZ-1的菌落形态及菌丝和孢子生长状态。

2.1.2?FZ-2菌株。菌株在PDA培养基上培养2?d后，菌落表面凸起呈灰色，边缘菌丝呈白色，表面附有灰色的孢子，菌落浓密紧凑;培养3?d后，菌落表面仍凸起且颜色加深，边缘菌丝呈白色，表面附着大量的孢子，菌落浓密紧凑。菌丝体由分枝的、分隔的、光滑的、透明至淡灰褐色的菌丝构成，菌丝2～4?μm宽。分生孢子梗与菌丝异形或同形，单菌丝构成，半透明或浅褐色至中褐色，光滑，薄壁，有分隔，分枝或不分枝，圆柱形至近杯状，3～4?μm宽。产孢细胞多点芽植型产孢，半透明至浅褐色，与分生孢子梗整合，光滑，（9.0～28.0）?μm×（2.5～5.0）μm（=?12.7?μm×?3.7?μm，n=20），内部有细小油滴。分生孢子全壁芽植型，多生，孢子呈链状向上生长，质地干，透明至浅褐色，近球形至球形，椭球状到近纺锤形或倒卵形，部分近圆柱形，基部和顶部平截，最顶端孢子基部平截，顶部圆滑，0-1（-2）隔，光滑，壁薄，（3.8～11.0）×（2.6～4.5）μm（=?6.8?μm×3.4?μm，n=50）;分生孢子裂解式脱落（图2）。

2.1.3?FZ-3菌株。菌株在PDA培养基上培养2?d后，菌落浓密不紧凑，表面灰白色至浅褐色，表面菌丝清晰可见，菌丝较分散，菌落中央无凸起，边缘菌丝呈白色;培养3?d后，菌落浓密不紧凑，颜色呈灰白色至深褐色，培养基反面深褐色至黑色。菌丝体堆在一起褐色;菌丝分枝，具隔膜，半透明至深褐色，表面光滑，壁薄，宽2.5～6.4?μm（3.8?μm，n=40）。分生孢子梗宽2.2～5.3?μm（3.9?μm，n=25），顶端产孢，表面光滑，褐色至中褐色。产孢细胞圆柱形，浅褐色至褐色，在分生孢子梗的顶端。分生孢子单生，顶生，（15.0～36.0）?μm×（8.0～15.2）μm（23.6?μm×11.3?μm，n=40），基部平截2.4～4.5?μm（3.5?μm，n=40），隔膜网格状，具横隔膜和纵隔膜，横膈膜较多1～6个隔膜，纵隔膜一般1个，分孢子呈卵形、纺锤形，棍棒状、球形至椭球形，浅褐色至中褐色，表面光滑，壁薄（图3）。

2.1.4

FZ-4?菌株。菌株在PDA培养基上培养2?d后，菌落浓密紧凑，表面灰白色，菌落中央凸起呈灰白色，边缘菌丝呈白色;培养3?d后，菌落表面呈灰白色至浅青色，菌落浓密，表面可见灰白色孢子，培养基反面棕黄色。菌丝分枝，具隔膜，透明至浅色，表面光滑，壁薄。分生孢子梗宽2.6～4.5?μm（3.5?μm，n=20），表面光滑，透明至浅色，产孢细胞顶端集中呈扫帚状。产孢细胞顶生，烧瓶形瓶梗，（8.0～25.0）μm×（2.0～3.0）μm（16.1?μm×?2.6?μm，n=20），透明，壁薄，基部寬顶部窄。分生孢子顶生，数量非常多，散射状，（2.8～7.6）μm×（2.05～4.8）μm（4.55?μm×?2.88?μm，n=70），无隔膜，球形、椭球形至长椭球形，浅褐色至透明，表面光滑，壁薄（图4）。

2.2?病原真菌的分子学鉴定

利用18S和28S的上下游引物序列，得到以上4种病原菌菌株的序列结果（表1），与NCBI?Blast?上的已知序列进行比对，以确定病原真菌种或亚种。

由表1可知，利用rDNA-ITS鉴定4种脐橙病原真菌分别如下：FZ-1为指状青霉（Penicillium?digitatum），FZ-2为芽枝状枝孢霉（Cladosporium?cladosporioides），FZ-3为柑橘链格孢（Alternaria?citri），FZ-4为意大利青霉（Penicillium?italicum），与各自源物种的同源性均达100%。

2.3?不同质量浓度的2-PE对4种病原真菌孢子萌发率的影响

2-PE对细胞具有一定的毒性，其抑菌作用主要是通过增加细胞膜的通透性而扰乱跨膜质子电势，以及作为大分子合成的抑制剂抑制细胞内蛋白质和RNA的合成。不同的微生物对2-PE的耐受性不同，通常质量浓度为0～2?g/L的2-PE可抑制大部分微生物生长，当质量浓度达4?g/L可完全抑制酵母菌生长[19]。由表2可知，2-PE对4种病原菌孢子萌发均有显著（P<0.05）的抑制效果，在浓度为0.6?g/L时可全部抑制柑橘链格孢和芽枝状枝孢霉的孢子萌发，对指状青霉和意大利青霉的最低孢子萌发抑制浓度分别为0.8和1.2?g/L，2-PE对意大利青霉的孢子萌发率抑制效果较弱。

2.4?不同质量浓度的2-PE对4种病原真菌的抑菌效果

2-PE对柑橘致腐菌均有很好的抑菌作用（表3）。在一定质量浓度下，2-PE对芽枝状枝孢霉的抑制效果最好，其次为指状青霉和柑橘链格孢，对意大利青霉的抑制效果相对较弱。其最小抑菌浓度（MIC）分别为1.4、1.8、2.2、2.4?g/L，即2-PE浓度达2.4?g/L时，可完全抑制4种病原菌菌丝的生长。方静凡[14]采用2-PE对多种果实病原真菌的抑菌谱进行检测，2-PE浓度为0.2%～0.4%（V/V）时可完全抑制柑橘绿霉菌、黑腐菌、炭疽菌，苹果青霉菌和灰霉菌等多种致腐真菌的生长，对意大利青霉菌B3的最小抑菌浓度MIC为0.25%（V/V）。

3?结论

从不同地区自然腐烂的脐橙中分离纯化出4种病原真菌，通过观察菌落形态，菌丝生长，分生孢子形状、大小及分生孢子梗形态等对其进行鉴定，由于真菌生长条件改变，菌丝的生长形态会有改变、厚垣孢子难形成和观察，分生孢子在形态学上差异小，对菌丝、孢子的描述困难，较难区分多种菌株之间的差异。随着分子生物学技术的发展，rDNA-ITS被广泛应用于果蔬类采后病原菌的分离和鉴定[20-22]。通过18S?rDNA测序以及在GenBank核酸数据库中进行Blast比对，结果表明这4种柑橘致腐菌分别为意大利青霉、指状青霉、柑橘链格孢和芽枝状枝孢霉。其中意大利青霉、指状青霉和柑橘连格孢为引起柑橘采后腐烂的主要病原真菌。利用分子学技术进行辅助鉴定，可以鉴定出亲缘关系较近的种、属。

2-苯乙醇对柑橘致腐菌的孢子萌发和菌丝生长均有较强的抑制效果，2-PE可在较低的质量浓度下完全抑制真菌孢子萌发，相较于酵母菌和真菌菌丝，真菌孢子对2-PE具有更高的敏感性，可能是孢子在萌发过程中蛋白质和RNA的合成更易受到2-PE的抑制。在相同的质量浓度下，2-PE抑制4种病原真菌孢子萌发的强弱顺序依次为芽枝状枝孢、柑橘链格孢、指状青霉、意大利青霉，浓度为1.2?g/L时可完全抑制病原菌孢子的萌发。而在相同的质量浓度下，2-PE对芽枝状枝孢霉菌生长的抑菌效果最强，其次为指状青霉、柑橘链格孢，对意大利青霉抑菌较弱，在浓度为2.4?g/L时可完全抑制4种病原真菌的生长。该研究从采后腐烂的赣南脐橙中分离出主要的致腐真菌，并采用生物转化的2-PE进行了抑菌效果评价，为进一步开发新型果蔬保鲜生物保鲜剂2-PE奠定了基础。

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