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标题 高灵敏甲胎蛋白夹心免疫传感器的制备
范文 王雪+李鹏君+邱萍+王小磊



摘 要 构建了新型甲胎蛋白（AFP）夹心免疫传感器。采用金纳米粒子-氧化石墨烯-普鲁士蓝纳米立方体（AuNP-GO-PBNCs）纳米复合材料标记甲胎蛋白（AFP）二抗，将制備的金-聚多巴胺-四氧化三铁（Au-PDA-Fe3O4）磁性纳米复合物固定在自制的磁性电极表面，通过吸附作用固定AFP一抗，用牛血清白蛋白（BSA）封闭电极上的非特异性吸附位点。在37℃下与AFP抗原溶液孵育50 min，最后将电极放入AuNP-GO-PBNCs纳米复合材料标记的二抗溶液中孵育，基于此建立了采用普鲁士蓝（PB）标记的的夹心免疫传感器检测AFP的方法。在最佳实验条件下，PB催化H2O2氧化的响应电流与AFP的浓度表现出两段线性关系，线性范围分别为0.005～1.000 ng/mL和1～20 ng/mL， 检出限（LOD， S/N=3）为1.0 pg/mL。本方法具有灵敏度高、选择性好的特点。
关键词 金纳米粒子； 氧化石墨烯； 甲胎蛋白； 普鲁士蓝； 夹心免疫传感器
1 引 言
甲胎蛋白（AFP）是临床诊断中常用的特异性的肿瘤标志物，对原发性肝癌的早期诊断具有重要的临床意义。目前，检测血清中甲胎蛋白主要采用放射免疫法、电化学发光法、化学发光法和酶联免疫法等[1～5]。放射免疫法检测AFP能达到纳克水平，但存在放射性污染； 电化学发光法检测速度快，但检测成本比酶联免疫法高； 化学发光法技术较为成熟，但是检测时间较长； 酶联免疫法（ELISA）具有简单、灵敏、特异、快速及易于自动化操作等特点，在生物工程[6]、临床诊断[7～9]、药物及环境分析[10～12]等方面应用广泛。ELISA法通常采用酶标记抗体（或者抗原），标记酶通常是分子量小、易制备的辣根过氧化酶（HRP）[7，12～14]。然而，HRP的本质是蛋白质，使用过程中存在易失活的问题。
为了克服HRP等标记酶易失活的缺点，很多具有优良类过氧化酶催化活性的纳米材料被应用于ELISA检测方法中[8～10]，其中普鲁士蓝（PB）具有独特的三维网状结构，具备稳定性好且制备成本低的优点。另外，它还具有优良的电化学可逆性，作为电子转移媒介体，对过氧化氢表现出良好的电催化能力[15]。使用PB代替常规酶蛋白标记抗体或抗原，可以克服现有酶标记方法操作繁琐、成本高、酶容易失活等缺陷。石墨烯具有导电性强、比表面积大、成本低等优点[16～19]。将石墨烯做为PB的载体，可大大提高PB的负载量； 此外，它可以增加普鲁士蓝的稳定性[20]。Fe3O4磁性纳米材料具有良好的超顺磁性、低毒性和生物兼容性，在生物催化、生物标记等领域得到广泛应用[21～24]。磁性纳米材料具有大的表面Gibbs自由能，可以降低体系的能量，化学稳定性高。
本研究制备了氧化石墨烯/普鲁士蓝（GO-PBNCs）复合物，用聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）功能化的带正电的GO-PBNCs吸附带负电的金纳米粒子（AuNPs），制得AuNP-GO-PBNCs纳米复合材料，用此纳米复合材料标记AFP二抗（Ab2）。另外合成了磁性Fe3O4立方体，基于多巴胺（DA）与HAuCl4·4H2O反应可生成聚多巴胺（PDA） 及金纳米粒子，采用原位化学氧化聚合的方法制得Au-PDA-Fe3O4磁性纳米复合物。利用磁性将Au-PDA-Fe3O4磁性纳米复合物固定在自制的磁性电极表面后[25]，吸附固定anti-AFP，制备检测AFP的磁性传感电极。将此传感电极与含有AFP抗原的样品孵育； 再将已结合AFP抗原的电极与AuNP-GO-PBNCs纳米复合材料标记的二抗孵育，测定电极的电化学响应信号。制备的以普鲁士蓝为标记物的夹心免疫传感器具有灵敏度高、检出限低和稳定性好的特性，在生物医学、临床诊断等方面有潜在的应用价值。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Quanta 200扫描电子显微镜（SEM，，美国FEI公司）； UV-2450紫外可见分光光度计（日本Shimadzu公司）； X-射线衍射仪 （XRD， 英国Bede公司）； Autolab PGSTAT30/FRA2 电化学工作站（瑞士Metrohm公司）。采用三电极工作系统，修饰的磁性玻碳电极（MGCE）作为工作电极，饱和甘汞电极（SCE） 作为参比电极，铂丝电极作为对电极（CE）。
甲胎蛋白（AFP）、anti-AFP（博赛生物有限公司）； 天然石墨片（99.8%，325目）、多巴胺（DA，99%）（Alfa Aesar公司）； 氯金酸（HAuCl4·4H2O，99.8% ）、牛血清白蛋白（BSA，≥98%） （Sigma公司）。以0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4磷酸盐缓冲液（PBS， pH 5.91）为支持电解质溶液。其它试剂均为国产分析纯，使用前未经进一步处理。实验用水为超纯水（≥18 MΩ cm）。
2.2 实验方法2.2.1 Au-PDA-Fe3O4磁性纳米复合材料的制备
根据文献[26]制备磁性Fe3O4纳米立方体。将Fe3O4纳米立方体加入到1.0 mL PBS缓冲溶液中，浓度为0.5 mg/mL，在4℃剧烈搅拌条件下，加入500 μL 60 mmol/L （过量）多巴胺，再逐滴加入300 μL 2%（m/V） HAuCl4溶液，继续搅拌30 min，得到Au-PDA-Fe3O4磁性纳米复合材料。
2.2.2 Ab2-AuNP-GO-PBNCs生物复合材料的制备 采用Hummers方法合成氧化石墨烯（GO） [27，28]。在超声条件下，用水将GO稀释成1 mg/mL的悬浮液。取5 mL加入圆底烧瓶中，再加入0.2 mL 5 mmol/L FeCl3-K3[Fe（CN）6]（pH 1.6），置于30℃水浴中搅拌反应2 h，溶液颜色由黄棕色变为深蓝绿色，即得GO-PBNCs复合物。离心，用水清洗沉淀，再离心，至上清液为无色。如图 1A 所示，在超声条件下，将制得的GO-PBNCs复合材料加入到含0.625 mol/L KCl和1.25 mg/mL PDDA溶液中，继续超声处理3 h，离心清洗后，得到PDDA@GO-PB NCs复合材料，然后将其分散到5 mL 水中。根据文献[29]方法制得AuNPs，在超声条件下向10 mL AuNPs溶液中加入0.5 mL制得的PDDA@GO-PB NCs复合材料，放置过夜，次日离心，清洗后，将其分散在1 mL PBS缓冲溶液中，加入150 μL 2.0 μg/mL Ab2，在4℃下反应12 h后，离心，用100 μL 1%（w/w） BSA封闭，得到Ab2-AuNP-GO-PBNCs复合材料。离心，沉淀分散在1 mL PBS溶液中，待用。
2.2.3 制备修饰电极及检测AFP 依据文献[30]制备磁性玻碳电极（MGCE）。将10 mg石墨粉和1.2 mL石蜡油混合均匀，调成碳糊，然后将适量碳糊填入长50 mm、直徑3 mm聚四氟乙烯管中，将铜丝插在聚四氟乙烯管的一端，将一个厚2 mm、直径3 mm的圆形磁铁（其表面可产生0.2 T的非均匀磁场）放在距离管口约2 mm处的另一端，再在管口处放进一个厚2 mm、直径3 mm的玻碳，将磁铁与玻碳紧紧连在一起，并将玻碳的边沿用胶密封起来，即得到磁性玻碳电极。
将制备好的MGCE依次用1.0、0.3 和0.05 μm的Al2O3在麂皮上抛光至镜面后，再依次用超纯水、无水乙醇、0.1 mol/L HNO3、超纯水超声清洗，氮气吹干。吸取6 μL Au-PDA-Fe3O4磁性纳米复合材料悬浮液，小心滴涂在MGCE表面，在磁场的作用下，电极表面紧紧固定一层Au-PDA-Fe3O4磁性纳米复合材料，室温下自然干燥，制得Au-PDA-Fe3O4修饰的MGCE。将已修饰好的MGCE浸入AFP一抗溶液中，在4℃条件下过夜。在室温下，将电极浸入1% BSA溶液中约1 h，封闭电极上的非特异性吸附位点，即制得免疫传感器。将制备好的传感器分别浸入到不同浓度的AFP溶液中孵育50 min，吸取10 μL Ab2-AuNP-GO-PBNCs溶液，小心滴涂到修饰好的电极上，放置约1 h后，再用PBS缓冲液漂洗。将修饰好的电极浸入在含有1 mmol/L H2O2的PBS溶液（pH 5.91）中，采用差分脉冲伏安法（DPV）进行检测，免疫传感器的制备以及检测过程如图1B所示。
3 结果与讨论
3.1 GO-PBNCs与AuNP-GO-PBNCs复合材料的表征
由GO-PBNCs的扫描电镜图（图2A）可见，大小均一的PBNCs附着在片状的石墨烯表面； 用带正电的PDDA功能化并吸附带负电的AuNPs，其表面附着了一层均匀的Au NPs（图2B）。UV-vis表征结果如图2C所示，曲线a是GO的吸收光谱， 230 nm处的吸收对应C=C双键的π-π*跃迁[29]； 曲线b是GO-PBNCs复合物的吸收光谱，由于催化还原Fe3+，GO表面的电子密度发生了转移，所以在230 nm处没有明显的吸收。而由于PB中的Fe2+与Fe3+的电荷转移[28]，GO-PBNCs复合物约在740 nm处出现了一个宽峰，说明在GO上成功生成PB[31]。曲线c在530 nm处有一吸收峰，为AuNPs的特征峰[32]，这是由于用PDDA功能化后的GO-PBNCs复合物带正电，并吸附了带负电的AuNPs后，这进一步证实已成功合成AuNP-GO-PBNCs复合材料，上述结果与电镜表征结果相一致。
3.2 Fe3O4与Au-PDA-Fe3O4磁性纳米复合材料的表征
扫描电子显微镜（SEM）表征结果（图3A）显示，制备的Fe3O4的平均粒径为30 nm，颗粒大小均匀。图3B是Au-PDA-Fe3O4复合纳米粒子的SEM图像，未观察到Fe3O4立方体粒子，这可能是由于利用多巴胺原位合成金纳米粒子时， Fe3O4纳米立方体被包裹在内部。图3C是Fe3O4纳米立方体和Au-PDA-Fe3O4的UV-Vis图谱，Fe3O4纳米立方体没有明显的紫外吸收（曲线a）； 曲线b是PDA的紫外吸收图谱，在280 nm出现了多巴胺的特征吸收[33]； 曲线c在530 nm处出现了金纳米颗粒的特征吸收峰，表明在Fe3O4纳米立方体表面确实形成了金纳米层[34]，与电镜的表征结果（图3B）一致。
图4为Fe3O4纳米立方体和Au-PDA-Fe3O4的XRD图谱。在图4a上可见2θ=30.2°（220）、35.5°（311）、43.2°（400）、53.6°（422）、57.08°（511）和62.9°（440）等处的衍射峰，与ASTM标准数据卡片中Fe3O4图相吻合，表明合成的物质是立方尖晶石结构的Fe3O4[35]。图4b显示，Au-PDA-Fe3O4复合物产物在2θ=38.1°、44.4°、64.6°和77.6°等处出现了清晰的特征衍射峰，分别对应于Au （111）、（200）、（220）和（311）晶面，表明产物表面已经覆盖了一层金纳米粒子[36]。另外，因为Au是重金属元素，且前文提到Fe3O4的外表面覆盖了一层金，而Fe3O4的衍射峰相对Au的衍射峰太弱，因此很难观测到。插图是在外磁场条件下拍摄的，Fe3O4悬浮液呈黑色，且均匀分散，若将一块磁铁放置在该悬浮液的一侧，施加磁场，所有的Fe3O4立即聚沉，上清液则澄清透明。以上结果充分表明，Fe3O4纳米立方体具有良好的超顺磁性，在外加磁场的作用下，可以将其固定在磁性玻碳电极（MGCE）表面[37，38]。
3.3 修饰电极的电化学行为
图5A是在含有探针分子[Fe（CN）6]3/4 （5.0 mmol/L）的电解质溶液中，不同的修饰电极的交流阻抗复平面图。曲线a为裸电极阻抗图，在所有频率范围内几乎呈一条直线，表明探针分子非常容易到达MGCE电极表面发生氧化还原反应，这一电化学过程是受扩散控制的。当在MGCE电极表面固定Fe3O4-PDA-Au时， Fe3O4-PDA-Au阻碍了探针分子向电极表面的扩散，曲线在高频区出现一个显著的半圆，半圆直径对应于电极的电子传递阻抗（Rct），约145 Ω（曲线b）。Fe3O4-PDA-Au修饰电极吸附anti-AFP后（曲线c）， Rct增大，表明anti-AFP已成功吸附在电极MGCE/Fe3O4-PDA-Au上。用BSA封闭MGCE/Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP 上的非特异性吸附位点即得MGCE/Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP/BSA （曲线d），再与AFP孵育发生免疫反应后得到MGCE/Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP/BSA /AFP （曲线e），Rct逐渐增大，这证明AFP与anti-AFP发生了免疫反应后，成功组装在A修饰电极表面上，也证明了Fe3O4-PDA-Au可以保持anti-AFP的生物活性。然而，当MGCE/Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP/BSA /AFP进一步与GO-PB-Au NPs-Ab2孵育后（曲线f），Rct相对发生免疫反应后减小，这是由于GO和Au NPs具有很好的导电性，从而使得探针分子能够较容易的到达电极表面。
電压在0.2～0.5 V范围内，扫描速度为50 mV/s，对不同修饰电极进行循环伏安扫描（图5B）。PDA-Au/anti-AFP/BSA/AFP修饰电极未出现明显的循环伏安峰，当电极修饰Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP/BSA/AFP后，背景电流显著增大，说明Fe3O4具有很强的导电性，起到增加电流的响应信号的作用； 当进一步孵育GO-PB-Au NPs-Ab2后，出现了一对对称的氧化还原峰，这是因为PB是很好的氧化还原活性分子，当在支持电解质溶液中加入1 mmol/L H2O2后，还原峰电流明显增大。因此，PB不仅起到了电子介体的作用，而且可作为一种“人工过氧化酶”，起到了电催化的作用。
3.4 孵化时间和温度的影响
对免疫孵育时间进行了优化。随着孵育时间的延长，响应电流也随之增大，当孵育时间超过50 min后，响应电流信号基本保持不变，这表明当孵育时间大于50 min时，电极上结合的AFP达到饱和，因此选择50 min为最佳孵育时间。
温度也是影响免疫反应和抗原抗体稳定性的重要因素。在15～50℃范围内，免疫传感器的电流响应信号随着温度的升高而先增大后降低，在37℃时达到最大，这是因为温度的升高有利于提高抗原与抗体的反应。而温度过高时，可能会导致抗原与抗体的蛋白分子变性，结合活性降低，使得组装上的GO-PB-AuNPs-Ab2减少，从而相应的PB及催化H2O2的响应电流减小。因此选择37℃为最佳测定温度。
3.5 免疫传感器的安培响应
在最佳实验条件下，采用DPV检测不同浓度AFP的结果如图6所示。在不同浓度的AFP存在下，传感器的电流响应信号表现出两段线性关系，线性范围分别为 0.005～1.000 ng/mL和1～20 ng/mL，检出限为1.0 pg/mL（S/N=3）。本方法与文献报道方法的分析性能的比较见表1。
3.6 免疫传感器的重现性和稳定性
用同一根免疫电极对5 ng/mL AFP标准溶液进行重复测定6次，测量电化学响应信号的RSD为2.7%。取6支同样条件下制备的的免疫电极，对5 ng/mL AFP样品进行检测，测定结果的RSD为4.3%，表明此传感器具有良好的重现性。将制备好的免疫传感器在4℃下放置30天后重新检测，测得的电流值是初始电流响应的93%，表明此传感器具有良好的长期稳定性。
3.7 免疫传感器的选择性
为了进一步研究传感器测定AFP的选择性，在最佳条件下，测定了免疫传感器对5 ng/mL AFP及其它干扰物包括癌胚抗原（CEA，5 ng/mL）、牛血清白蛋白（BSA，5 ng/mL）、乙肝表面抗原（HBsAg， 5 ng/mL）的响应，结果如图7所示，免疫传感器对AFP的响应远大于其它干扰物，表明制备的免疫传感器的抗干扰能力强，选择性好。
4 结 论
以MGCE作为电极，基于AuNP-GO-PBNCs复合材料成功构建了一种新型的甲胎蛋白夹心免疫传感器，实现了对AFP的灵敏检测。此传感器灵敏度高，稳定性好，线性范围宽且成本低。所制备的AuNP-GO-PBNCs复合材料具有良好的导电性和大的比表面积，又可以作为电子介体催化过氧化氢，起到放大信号的作用。此免疫传感器制作简单，使用方便，成本低，在生物医学、临床诊断、健康检测等方面具有潜在的应用价值。
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