| 标题 | 基于石墨烯信号放大策略的胆固醇分子印迹电化学传感器研究 |
| 范文 | 白慧萍+王春琼+曹秋娥 摘 要 利用石墨烯的信号放大作用，结合分子印迹技术和电聚合技术，以苯酚为功能单体，胆固醇（ChO）为模板分子，在石墨烯修饰的玻碳电极表面电聚合能识别胆固醇分子的敏感膜，构建胆固醇分子印迹电化学传感器。采用扫描电镜、循环伏安法、差分脉冲伏安法研究了印迹膜的结构、性能和分子印迹效应。结果表明，此传感器对胆固醇有良好的选择性和较高的灵敏度。胆固醇浓度在8.0×108 mol/L。将其用于人体血清样品的检测，结果满意。 1 引 言 胆固醇（Cholesterol， ChO）也称胆甾醇，是多种疾病诊断的重要生物指标[1]。血清中高胆固醇的存在是引发多种疾病（如冠心病、心肌梗塞、动脉硬化高血压等）的主要因素，而胆固醇低也可能会导致低脂蛋白血症、贫血、败血症、营养不良、甲亢和肝病[2]。因此，准确、灵敏、快速地监测胆固醇水平对临床分析和诊断非常重要。常用的胆固醇检测方法有光谱法[3，4]、比色法[5，6]、高效液相色谱法[7，8]、高效液相色谱质谱法[9]和电化学法[10，11]。其中，电化学生物传感器由于具有高灵敏度、高选择性和实时检测等优点，在胆固醇的检测中被广泛应用。目前关于胆固醇电化学生物传感器的研究更多地集中于电极和固定化胆固醇氧化酶之间的电子转移[12，13]。然而在电极表面固定化酶是有局限性的，因为在固定化过程中酶很容易变性，而且，空间位阻效应和支撑材料的存在也会影响酶的活性。此外，酶的固定化过程成本高，酶的活性还常常受到pH值、温度、湿度和有毒化学物的影响[14]。这些因素都将制约基于酶修饰的传感器的进一步发展。与生物传感器相比，以分子印迹聚合物作为传感介质修饰得到的分子印迹电化学传感器在保持高选择性和高灵敏度的同时，具有制备简单、成本低、使用条件受pH值和温度等影响小的优点，并能实现一些原来不能或者需要前处理之后才能测定的样品的直接测定[15，16]。近年的研究表明，许多新型功能纳米材料，如石墨烯、碳纳米管、量子点、金属纳米颗粒等的引入不仅可以克服印迹聚合物的缺陷，而且可以显著提高传感器的灵敏度和选择性[17]。本研究以胆固醇为研究对象，针对生物样品的复杂性和现场检测所需的快速性，利用石墨烯信号放大策略，采用循环伏安法将分子印迹膜聚合在石墨烯修饰的玻碳电极表面，获得胆固醇分子印迹电化学传感器。基于差示脉冲伏安法，建立了测定胆固醇的电化学分析方法，实现了人血清中胆固醇的快速灵敏测定。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 CHI660D电化学工作站（上海辰华仪器公司）； 797伏安极谱仪（瑞士万通公司）； Agilent 1200高效液相色谱仪、ZORBAXC18柱（250 mm × 4.6 mm， 5 μm）（美国Agilent公司）； TG16WS离心机（常州高科仪器公司）。 苯酚、抗坏血酸（天津光复化工研究院）； 石墨粉（2～15 μm，99.9995%）、尿酸（UA）、胆固醇（ChO）和血清白蛋白（ALB），均购自美国Alpha公司，上述试剂均直接使用。实验室用水为18.25 MΩ·cm的超纯水。 2.2 石墨烯及修饰电极的制备 实验采用改进的Hummer和Offerman法制备氧化石墨烯[18]。将1 g石墨粉与50 g NaCl混合研磨，用水溶解，过滤。取上层固状石墨加入23 mL浓H2SO4中，室温下搅拌12 h。冰浴中缓慢加入6 g KMnO4后，于105℃搅拌4 h至溶液颜色呈棕黄色，加入100 mL超純水和10 mL 30% H2O2继续反应2 h。向反应物中加入150 mL超纯水，装入透析带，用5% HCl和水洗至pH中性。将所得氧化石墨用水分散后超声8 h，静置过夜，取上层液离心分离，40℃真空干燥，得到氧化石墨烯（GO）。取50 mg氧化石墨烯，加入20 mL水混合后，再加入0.5 mL肼。超声处理1 h后，50℃搅拌24 h，过滤，真空干燥得到石墨烯（RGO）。 将石墨烯分散于超纯水，超声1 h得到均一的悬浮液（1 mg/mL）。取10 μL悬浮液滴涂于预处理好的电极表面，置于红外灯下15 min，得到石墨烯修饰电极（RGO/GCE）。 2.3 分子印迹膜和非印迹膜修饰电极的制备 将RGO/GCE置于含0.016 mol/L苯酚、1.0 mmol/L ChO的硼砂缓冲溶液（0.05 mol/L硼砂+0.2 mol/L NaOH，pH 9.2）中，在0.2～0.8 V范围内进行电聚合，扫速50 mV/s，扫描40圈，得到苯酚聚合膜修饰电极。电聚合液在使用前通氮气15 min。取出电极，用超纯水冲洗吸附不紧密的分子后，置于无水乙醇中洗脱15 min，去除模板分子，制得分子印迹膜修饰电极（MIP/RGO/GCE）。非印迹传感器（NIM/RGO/GCE）的制备除不加ChO外，其余步骤与印迹传感器的制备完全相同。 2.4 电化学检测 将三电极系统放入待测溶液（以5.0 mmol/L K3Fe（CN）6为探针，0.1 mol/L KCl为支持电解质）中，待背景电流稳定后，进行循环伏安（CV）和差示脉冲（DPV）的测定。其中，CV测定条件：扫描范围为 0.2～0.6 V，扫描速率为100 mV/s；DPV测定条件：扫描范围和速率同CV，电位增量为0.004 V，振幅为0.05 V，脉冲宽度为0.05 s，采样宽度为0.016 s。 裸玻碳电极直接进行测定；印迹和非印迹传感器先在被测液中孵化5 min后再进行测定，测定结束后，置于10 mL乙醇溶液中，搅拌洗脱5 min后取出，于4℃保存待用。 3 结果与讨论 3.1 分子印迹聚合膜的伏安行为 苯酚及其衍生物被常用于制备绝缘聚合物薄膜。本研究以苯酚为电聚合功能单体，胆固醇为模板分子，在0.05 mol/L硼砂溶液（pH 9.2）中采用循环伏安电聚合法制备分子印迹电化学传感器。 图1A为石墨烯修饰电极在扫速为50 mV/s下得到的循环伏安图。由图1A可知，扫描第一圈时的阳极峰电位为0.62 V，阳极峰电流为280 μA，随着扫描圈数的增加，峰电流越来越小，峰电位负移，直至消失。表明随着电沉积过程的进行，印迹聚苯酚膜不断覆盖到电极表面，其绝缘性导致电流逐渐减少。图1B为裸玻碳电极的电聚合图，比较图1A和1B可知，石墨烯的引入，增加了电极的电子传递能力和比表面积，从而使峰电流增强，回路明显变宽。因此，与裸玻碳电极相比，修饰了石墨烯纳米材料的电极需要更多的扫描次数，才可以使电极表面完全被不导电的印迹聚合膜所覆盖。 3.2 分子印迹膜的形貌表征 采用扫描电镜对不同修饰电极的形貌进行了表征。由图2可见，修饰在电极表面的石墨烯（A）呈现二维空间结构，其形貌似褶皱的薄纱；当在石墨烯表面电聚合分子印迹膜后（B），褶皱明显减少，表面相对平整，说明石墨烯表面被印迹膜所覆盖；分子印迹膜经洗脱去除模板分子后（C），表面由平滑变得粗糙，产生大量的印迹聚合物纳米颗粒。表面粗糙度的增加和纳米颗粒的生成增大了印迹聚合膜的比表面积，增强了电极对印迹分子的吸附量，从而有利于提高传感器的灵敏度和选择性。经过洗脱后的非印迹膜（D）表面仍以石墨烯的层状结构为主，未出现大量的印迹聚合物纳米颗粒。 0.2～0.6 V）内，胆固醇没有电活性。 考察了不同修饰电极在含有5.0 mmol/L K3Fe（CN）6和0.1 mol/L KCl的缓冲溶液（pH 6.0）中的循环伏安行为（图3）。由图3A可见，裸玻碳电极上有一对明显的氧化还原峰（a）。修饰石墨烯后，电极的氧化还原峰电流显著增大，达到100 μA（b），说明石墨烯的存在增加了电极的导电性能。石墨烯被印迹聚合膜覆盖后，电极上的氧化还原峰消失（c），表明电极表面完全被致密的不导电印迹膜覆盖，这层膜阻碍了K3Fe（CN）6探针在电极表面的氧化还原反应。当印迹膜中的模板分子ChO被洗脱后，电极上的再次出现氧化还原峰（d），说明洗脱后的膜中形成了印迹孔穴，因此电子可以到达传感器。当印迹孔穴再次结合模板分子后，膜中的传质通道被堵塞，导致电极上的峰电流降低（e）。对于非印迹传感器（图3B），由于洗脱前后的膜中都不存在可供离子传递的通道，因此都无电流响应。 3.4 印迹电极制备及应用条件优化 3.4.1 电聚合扫描圈数的优化 电聚合过程中不同扫描圈数（20、30、40、50、60）对电极响应性能的影响如图4所示。 6 mol/L cholesterol （ChO） in 0.1 mol/L KCl containing 5.0 mmol/L K3Fe（CN）6. The error bars represent the standard deviation of results for n=2.5当扫描圈数达到40圈时，传感器对模板分子的响应电流值ΔI（ΔI=I0-Ic， I0为不含ChO时的峰电流，Ic为测定体系中加入ChO后DPV的峰电流）达到了最大；此后，随着扫描圈数增加，响应电流反而下降。原因可能是，当印迹聚合膜太厚时，位于聚合膜内部的模板分子不能被完全洗脱[19]，从而降低了电极的响应灵敏度。因此，本实验选择电聚合扫描圈数为40。 3.4.2 单体用量的优化 聚合过程中加入的模板与单体的比例对传感器的性能至关重要，实验在固定聚合体系中模板分子的浓度为1.0 mmol/L的条件下，改变模板与功能单体的摩尔比（1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、 1∶24），研究了功能单体用量对制备的印迹传感器的影响（图5）。结果表明，随着功能单体用量的增加，传感器对5.0×10mol/L ChO的电流响应值先增加后减少，模板与功能单体的摩尔比达到 1∶16时有最大值。因此，本实验选择模板与功能单体的加入摩尔比为1∶16。 3.4.3 洗脱时间的优化 为了获得令人满意的灵敏度和选择性，完全洗脱印迹膜中的模板分子是非常重要的。考虑到胆固醇较易溶于乙醇，本实验选择乙醇来去除印迹膜中的模板。 采用DPV记录不同洗脱时间后的传感器在缓冲溶液中的峰电流变化， 结果表明，随洗脱时间延长，峰电流先增加，在洗脱时间达到10 min后逐渐趋于稳定。为了获得最高的印迹效率和检测灵敏度，选择洗脱时间为15 min。 3.4.4 测定过程中平衡时间的优化 将洗脱好的修饰电极浸泡在5.0×10mol/L ChO溶液中孵化1、3、5、10和15 min，然后置于缓冲溶液中进行DPV扫描，记录相应峰电流值。结果表明，随着孵化时间延长，峰电流不断下降，5 min后，峰电流达到最小值并趋于平稳，说明此时电极对胆固醇的吸附基本趋于饱和。因此，本实验的平衡时间选择5 min。 3.5 MIM/RGO/GCE的线性范围与检出限 为探讨MIM/RGO/GCE的实用性，采用差示脉冲法DPV绘制了此传感器测定胆固醇的工作曲线。mol/L。此传感器测定ChO的校正曲线是由两部分组成，说明在传感器的印迹膜中存在两类结合位点，即对ChO有高亲和力和低亲和力的结合位点，这是非共价印迹聚合物/膜对模板分子产生吸附的普遍特性[20]。 采用相同的聚合方法和条件在裸玻碳电极表面制备了ChO印迹膜电极（MIM/GCE），并研究了此电极测定ChO的线性范围和检出限。响应电流 4 mol/L范围内具有良好的线性关系，线性回归方程为ΔI=2.676+0.425C （μmol/L） （r=0.9969）和ΔI=4.012+0.238C （μmol/L） （r=0.9987）。检出限（S/N=3）为8.0×107 mol/L。可见，MIM/RGO/GCE的检出限远低于MIM/GCE，表明石墨烯的引入显著增加了传感器的灵敏度。与其它测定ChO的文献方法相比（表1）， 此MIM/RGO/GCE传感器测定胆固醇具有相对较低的检出限、高的灵敏度和令人满意的线性范围。 3.6 电极的选择性、重现性与稳定性 实验测定了传感器在缓冲溶液中对5.0 μmol/L ChO的DPV响应，以及含有可能会对人血清中ChO测定产生影响的血清白蛋白（ALB）、尿酸（UA）、葡萄糖（Glc）和抗坏血酸（Vc）时的DPV响应。由图7可见，10倍浓度于ChO的ALB、UA、Glc和Vc并没有明显干扰到ChO的测定结果，表明印迹膜的结合位点能够有效地选择胆固醇，可能的干扰物并不会对胆固醇的测定产生影响。 用同一支电极平行测定5.0 μmol/L ChO 5次，相对标准偏差RSD=2.4%；用相同方法制备的5支电极对相同浓度的ChO进行测定，RSD=3.0%； 电极于4℃保存，2周后测定ChO的响应值基本没有变化，使用60次后响应值降至初始响应值的89%左右，表明此电极具有较长的使用寿命和良好的重现性与稳定性。 3.7 实际样品分析 将制备的传感器用于人血清（云南大学校医院提供，3000 r/min离心15 min，取10 μL上清液稀释至10 mL）中ChO的测定。由表2可知，人血清样品测定结果的RSD<2.9%，加标回收率在99.8%～102.0%之间，初步说明测定结果是准确可靠的。为进一步验证此传感器的测定结果，采用高效液相色谱法[8]测定出未经稀释的该人血清样品中ChO的浓度为4.60 mmol/L（健康人的正常血浆总胆固醇通常不超过5.72 mmol/L）。高效液相色谱的测定结果与传感器的检测结果基本一致。 4 結 论 采用胆固醇作为模板分子，石墨烯纳米材料为基底，利用电聚合技术将苯酚印迹聚合膜修饰到玻碳电极表面，制得新型胆固醇印迹电化学传感器。结果表明，石墨烯的引入不仅可以增加电子传递速率，且与分子印迹膜结合后，使印迹材料的比表面积增加，电流响应信号增强，提高了传感器的灵敏度，选择性好，并成功用于血清样品中胆固醇的直接检测。 |
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