| 标题 | 核磁共振代谢组学研究狼毒大戟对大鼠粪便代谢物的影响 |
| 范文 | 王霞 徐灿 吴秀园 孙雯婷 王英锋 李中峰 摘?要?应用核磁共振（NMR）代谢组学方法研究狼毒大戟根部毒性导致大鼠粪便代谢物的变化。将36 只SPF级雄性SD大鼠随机分为3组，给药组大鼠腹腔注射高低两个剂量的狼毒大戟根部醇提物，对照组给予同体积含有3% 吐温80的生理盐水。每天给药一次，连续给药15天后停药恢复15天，收集各组大鼠的粪便样品。利用NMR技术检测大鼠粪便中代谢物，对得到的1H-NMR数据进行多元统计分析，获取大鼠粪便中内源性代谢产物的变化规律。通过Student t检验进一步确定具有统计学意义的生物标志物。大鼠粪便中鉴定出35种代谢物，狼毒大戟导致12种代谢物变化显著，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、二甲胺、三甲胺、尿嘧啶含量下降，葡萄糖、丁酸含量升高。这些与肠道菌群有关的代谢物变化表明，狼毒大戟毒性导致大鼠的肠道菌群紊乱，进而造成了大鼠体内氨基酸、短链脂肪酸和葡萄糖代谢异常，为进一步揭示狼毒大戟的毒性提供了实验依据。 关键词?狼毒大戟; 代谢组学; 粪便; 核磁共振 1?引 言 据《中药大辞典》记载，狼毒大戟（Euphorbia fischeriana Steud）为大戟科大戟属草本植物，主要分布在我国的河北、黑龙江、辽宁、内蒙古、吉林等地。狼毒大戟以根入药，具有抗癌、抗白血病、抗菌、抗病毒和抗痛风、杀虫、抗氧化等作用[1，2]。由于狼毒大戟具有多种药效作用，尤其在抗肿瘤方面具有良好的活性而受到广泛关注。然而，《本草纲目》中记载：狼毒（根）辛、平、有大毒。胡爽等[3]在狼毒大戟急性毒性实验研究中发现，小鼠腹腔注射较高剂量的狼毒大戟根部提取物后，明显出现活动困难、呼吸急促、步态不稳等现象，并有一定数量的小鼠死亡。狼毒大戟因为具有较大的毒性，其应用受到了限制。因此，充分认识和了解狼毒大戟的毒性是其安全、合理使用的前提。 代谢组学是通过对生物体内所有代谢物进行定量分析，研究机体代谢产物变化的方法。代谢组学可以反映机体在疾病侵袭、药物干预等作用下，内源性小分子代谢物种类、数量的变化情况[4]，从而得到机体代谢变化的信息，已经应用于中药毒性[5]、疾病诊断[6]、药物作用机制[7]等领域。核磁共振（NMR）技术具有对样品预处理简单、无破坏性、实时动态检测和无偏向检测等特点[4]，通过对体液、组织或粪便等生物样品进行测定，得到体内小分子代谢物的丰富信息，已成为代谢组学中强有力的研究工具[8]。基于核磁共振的代谢组学技术可以最大程度揭示生物体所产生的整体性的代谢变化，已被广泛应用在中药药效评价[9]、中药药理[10]和中药毒理机制[11]等方面。胡永胜等[13]采用核磁共振代谢组学方法研究了雷公藤红素对大鼠糖尿病溃疡促愈合作用的机制。粪便是肠道菌群和宿主的共代谢产物[13]，粪便代谢作为研究机体代谢的一个重要方面，可以反映出肠道菌群对药物、食物等的代谢情况[14，15]，为药物研究提供重要信息。 本研究利用NMR代谢组学方法研究狼毒大戟根部醇提物对大鼠粪便代谢物的变化，筛选造成肠道菌群紊乱的相关的潜在生物标志物，初步从分子水平对狼毒大戟毒性作用机制进行研究，为狼毒大戟的毒性及毒性机制的探讨提供了实验依据，并为研究肠道菌群和机体代谢的紧密关系提供新思路。 2?实验部分 2.1?仪器与试剂 Heraeus Multifuge X1R台式离心机（美国Thermo公司）; BSA124S-CW分析天平（德国Sartorius公司）; 600 MHz Varian VNMRS核磁共振波谱仪（美国Varian公司）; Rotavapor R-220中型旋转蒸发仪（瑞士Buchi 公司）、Cascada Bio Mk2超纯水机（美国PALL公司）。 狼毒大戟干燥根部（河北安国义全中药有限公司）经首都师范大学王英锋教授鉴定为狼毒科（Euporbiaceae）大戟属（Euphorbia ）植物狼毒大戟（Euphorbia Fischeriana Steud ）的根。NaH2PO4（99.5%）、K2HPO4（98%），购于美国Amresco公司; 吐温80（化学纯，天津市光复精细化工研究所）; 重水（D2O，99.9%氘代，美国Cambridge Isotope Laboratories公司）; 2，2，3，3-氘代三甲基硅烷丙酸钠（TSP，98%氘代，美国Cambridge Isotope Laboratories公司）; 叠氮化钠（NaN3，分析纯，天津福晨化学试剂厂）。 SPF级SD雄性大鼠购于斯贝福（北京）实验动物科技有限公司。 2.2?狼毒大戟醇提物的制备 按照课题组前期提取方法，取1.5 kg狼毒大戟干燥根部，粉碎，按质量体积比1∶9加入70%乙醇，浸泡过夜（>12 h），60℃加热提取2次，每次1.5 h。药液静置，冷却至室温后减压回收乙醇，水浴蒸干，真空冷冻干燥，得到狼毒大戟根部醇提物。取狼毒大戟根部醇提物溶解在含有3%（V/V）吐温80的生理盐水中，其中，吐温80用于增大狼毒大戟醇提物的溶解度。将混合液超声30 min，配制成相应浓度的狼毒大戟醇提物溶液。 2.3?动物实验 动物饲养条件为室温（25±5）℃，湿度60%±10%，12 h昼夜循环模拟自然光照，自由饮水摄食。实验剂量设置参考前期小鼠急性毒性实验，小鼠给药最高剂量为0.13 g/kg，换算到大鼠实验高剂量为0.10 g/kg。 36只SPF级SD雄性大鼠，体重280～320 g。随机分为3组，其中高剂量组14只、低剂量组12只、对照组10只。每组剂量等比级数为1∶0.5，剂量设置为0.10和0.05 g/kg，对照组为含有3%吐温80的生理盐水。适应性喂养1周后，在每次收集粪便时，需在给药前禁食不禁水12 h。每天8：00～9：00腹腔注射给药一次，注射体积为0.5 mL/100 g体重。连续给药15天，依据大鼠体重变化随时调整药量。第16天起停止给药，恢复15天。给药前一天记为第0天，给药期间每隔一天收集9：00～15：00的大鼠粪便样品，恢復期间每隔4天收集9：00～15：00的大鼠粪便样品。即第0、1、3、5…15、20、25、29天收集粪便样品，粪样收集后立即以液氮速冻，于80℃保存。 2.4?样品处理 称取50 mg大鼠粪样于2 mL离心管中，加入500 μL磷酸盐缓冲液（NaH2PO4-K2HPO4，0.1 mol/L，pH=7.4），缓冲液使用50% D2O配制，其中含有0.002% （w/V） TSP和0.1% （w/V） NaN3，分别作为化学位移内标和防腐剂。涡旋充分混匀后， 用液氮反复冻融3次。冻融物进行匀浆（20 Hz，90 s），匀浆液于4℃，10000 g离心10 min。取出上清液，剩余沉淀物用相同方法再提取2次，将3次操作所得到的所有上清液混合后再离心（4℃，16000 g，10 min），取上清液550 μL转移至5 mm NMR样品管中， 进行NMR检测。 2.5?核磁共振数据的采集 25℃下，在Varian VNMRS 600 MHz核磁共振波谱仪上采用预饱和的1D-?NOESY脉冲序列测定粪便水溶样的1H-NMR谱，1H的共振频率为599.808 MHz。实验参数为：谱宽12000 Hz，采样点数64 K，信号累加128次，混合时间（tm）为100 ms，在弛豫延迟期间采用预饱和方式压制水峰信号。为进一步对1D谱中的信号进行归属，选取具有代表性的样品， 采集一系列的2D NMR谱，如1H-1H COSY、1H-1H TOCSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC等。 2.6?数据处理 谱图使用MestReNova软件（Version 7.1.2，西班牙Mestrelab Research公司）进行手动相位、基线校正后，用内标TSP的单峰定标（δ 0.00）。对δ 0.5～9.5区域的图谱进行分段积分，积分区间宽为0.002 ppm。为了消除残余水峰信号的影响，剪掉谱图中δ 4.7～5.2区间。对积分后的数据进行总面积归一化处理，然后导入SIMCA-P+（Version 12.0， 瑞典Umetrics公司）进行多变量统计分析。主成分分析（PCA）使用中心化换算（Ctr）的数据标度换算方式，它可以反映样品整体的分布趋势，同时可以观察到组内有无异常点，分析结果以得分图（Scores plots）显示。归一化所得数据经单位方差换算（UV）标度化处理后，进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）。其中，PLS-DA用于分析NMR数据与分组变量之间的关系，同时得到变量投影重要性（VIP）>1的代谢物信息。用舍一法对模型进行交叉验证，参数R2和Q2分别表示模型拟合情况和预测能力，然后通过排列实验验证模型的有效性。最后以OPLS-DA最大化凸显组别之间的差异，并利用MATLAB R2012a软件（Version 7.1， 美国 Mathworks 公司）结合自编程序作出相关系数图，图中颜色沿着右侧越接近红色，表示相应代谢物对组间差异的贡献越大。根据两组中较小的样本数，查阅皮尔森相关系数临界值表，当某代谢物信号的相关系数绝对值|r|>r临界值时，认为该代谢物的变化对模型的区分有意义。本研究中，相关系数的临界值分别为0.291（n=45，给药15天）和0.532（n=13，恢复15天）。为进一步验证差异代谢物的显著性，对代谢物对应的积分面积数据导入SPSS软件（Version 17.0，美国SPSS公司）进行独立样本t检验，显著性阈值设置为p<0.05。当3个标准同时得到满足时，即VIP>1，P<0.05，|r|≥r临界值，相应的代谢物即可被选为差异代谢物。 3?结果与讨论 3.1?粪便样品代谢物谱图分析 图1为高剂量组（High）、低剂量组（Low）和对照组（Control）大鼠粪便样品中具有代表性的1H-NMR谱。根据代谢物文献[11，12，16～19]、已有的经验及Chenomx NMR Suite 数据库（Version 7.5，加拿大Chenomx公司）和代谢组学相关数据库（HMDB， http：//www.hmdb.ca/），对谱图的代谢物进行准确归属。结合相关二维谱图（如1H-1H COSY、1H-1H TOCSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC等）对归属的代谢物进行确认。本研究从图谱中归属出35种代谢物。肉眼可分辨出一些特征性差异代谢物，如给药组中具有较低浓度的尿嘧啶和较高浓度的葡萄糖等。 3.2?多元统计分析 为了观察样本的聚类情况以及排除异常点，对连续给药15天和停药恢复15天后所有大鼠粪便样品的NMR数据进行PCA分析。连续给药15天所有大鼠粪便样品的PCA得分如图2A所示，PC1=55.1%; PC2=16.2%，剂量组与对照组之间虽有部分重叠，但依然能看出分离趋势。由图2C中PLS-DA得分图（R2Y=0.776; Q2=0.759）更清晰地显示出组别之间的分离，其中高剂量组与对照组区分更明显。表明了给药后大鼠体内环境出现显著变化，且药物对机体的影响与剂量呈正相关。图2B和2D分别为停药恢复后剂量组与对照组的PCA（PC1=52.2%; PC2=13.4%）和PLS-DA（R2Y=0.747; Q2=0.597）得分圖，图中依然可以观察到剂量组与对照组的区分，表明在停药恢复15天后，给药组与对照组大鼠仍存在代谢差异。 为了动态观察狼毒大戟对大鼠的影响随时间的变化情况，对不同时间得到的大鼠粪便样品进行时间-轨迹分析（图3），图3中每个点代表一组大鼠在同一天的平均位置。在给药初期，剂量组即与对照组存在明显差异，此后均在一定范围内波动，且高剂量组与对照组的差异较低剂量组更为明显。停药恢复阶段，两剂量组的变化趋势趋于一致，但仍与对照组保持一定差异。 采用PLS-DA对给药期间和恢复期间高剂量组和对照组所有大鼠粪便样品的NMR数据进行分析。图4A为连续给药15天高剂量组和对照组大鼠粪便样品的1H-NMR谱得到的PLS-DA得分图（R2Y=0.869; Q2=0.848），图4C为停药恢复15天高剂量组和对照组大鼠粪便样品的1H-NMR谱得到的PLS-DA得分图（R2Y=0.794; Q2=0.666）。模型的排列验证（200次）结果如图4B和4D所示，Q2回归线与y轴交点在负半轴，R2回归线与y轴交点在正半轴，且R2和Q2的数值在最右端接近，表明建立的粪便样品数据模型成立，即两组大鼠粪便样品中的代谢物存在显著的差异。 |
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