| 标题 | 超高效合相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术快速分析广西莪术化学成分 |
| 范文 | 韦明思 谷筱玉 袁铭 王晖 黄天述 刘佳琪 申玲玲 谭晓杰 摘?要?采用超临界流体萃取（SFE）技术提取广西莪术根茎，应用超高效合相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术（UPC2-QTOF-MS）分析其提取物，结合UNIFI软件的内置中药数据库和自建的姜黄属植物化学成分数据库筛查，快速分离鉴定广西莪术SFE提取物中的化学成分。本研究初步鉴定出广西莪术SFE提取物中47种化合物，其中42种是倍半萜类化合物。47种化合物中有8组同分异构体化合物，共37种化合物。UPC2采用Torus Diol 130 色谱柱分离，流动相A为CO2，流动相B为甲醇/异丙醇（3∶1， V/V）+0.1%甲酸，进行梯度洗脱，在7 min内实现了47种化合物的分离。本方法无需复杂的样品前处理过程，分析速度快、试剂用量少、成本低、环保，是一种全面高效的分析方法，为中药的化学成分分析提供了新方法。 关键词?超高效合相色谱-四极杆飞行时间质谱联用; 广西莪术; 同分异构体; 超临界流体萃取 1?引 言 中药是发现新的生物活性物质的重要来源[1]，是典型的复杂物质体系[2]。当前亟需新的分析方法和技术快速鉴定中药中具有生物活性的化学成分[3～5]。色谱-质谱联用技术越来越多地用于中药成分的研究，如超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术（UPLC-QTOF-MS），促进了中药成分的研究[6～10]。 高效分离是准确进行中药化学成分鉴定的关键。以低黏度、高传质以及溶剂化能力强的超临界流体为流动相的超临界流体色谱（Supercritical fluid chromatography， SFC）具有高效分离和分析速度快等特点[11]。因此，SFC可作为气相色谱（GC）和液相色谱（LC）的互补技术[12]。超高效合相色谱（Ultra-performance convergence chromatography， UPC2）结合了SFC和UPLC及亚2 μm色谱柱技术的优点，提高了仪器的分析通量、重现性和精密度[13]。UPC2在复杂样品的分析中表现出强大的分离能力[14]，已被用于食品、药品和环境的分析研究[15～17]。超高效合相色谱-四极杆飞行时间质谱联用（UPC2-QTOF-MS）结合了具有强大分离能力的UPC2和能提供高分辨、高灵敏度、精确质量数和丰富结构信息的QTOF-MS，将会在复杂样品分析中表现出巨大潜力。目前，UPC2-QTOF-MS技术主要应用于食品科学领域的研究[18～20]。 广西莪术（Curcuma kwangsiensis S. G. Lee & C. F. Liang）的根茎具有行气破血、消积止痛的功效[21]，主要活性成分是二苯庚烷类化合物和萜类化合物[22～24]。 其中广西茂术的糖类化合物也有生物活性作用[25，26]。广西莪术的活性成分表现为抗炎、抗肿瘤、抗增殖和免疫刺激活性[25～29]。 气相色谱-质谱（GC-MS）是分析广西莪术挥发油中化学成分的常用方法[30]。GC-MS适用于分析可气化且热稳定的化合物，对难气化或热不稳定的化合物需化学衍生化处理。在分析中药化学成分时，常会同时分离鉴定多种非目标未知化合物，当其难以气化或热不稳定时，化学衍生化的前处理结果较差，无法进行GC-MS分析。因此，GC-MS分析中药的化学成分会受到一定的限制。全二维高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用（RPLC×RPLC-Q-TOF-MS）分析广西莪术根茎时共分离鉴定出105种化合物[31]。虽然RPLC×RPLC具有超强的分离能力，但仅1D LC的运行时间为120 min，分析时间长，不适于中药的质量控制和日常分析。因此，需要建立一种快速、灵敏、高效和全面的分离鉴定中药化学成分的新方法。 本研究应用超临界CO2萃取（SFE）广西莪术根茎，UPC2-QTOF-MS分析其提取物，建立了一种快速、高效分离鉴定中药化学成分的新方法。本方法无需复杂的样品前处理过程，分析速度快、全面、高效且环保。 2?实验部分 2.1?仪器与试剂 ACQUITY UPC2超高效合相色谱-Xevo G2-XS Q-TOF四极杆飞行时间质谱联用仪（美国Waters公司），配有电喷雾离子源（ESI），ISM补偿泵; 色谱柱：Torus DEA （100 mm×3 mm， 1.7 μm）、 Torus 1-AA （150 mm×3 mm， 1.7 μm）、Torus 2-PIC （100 mm×3 mm， 1.7 μm）、Viridis BEH （100 mm ×3 mm， 1.7 μm）、Torus Diol 130（100 mm ×3 mm， 1.7 μm）（美国Waters公司）; UNIFI 1.8.2软件，内置中药数据库（美国Waters公司）; SFE-30A超临界流体萃取仪（日本島津公司）; GRX6电热恒温鼓风干燥箱（上海天恒医疗器械有限公司）; FW135中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）; Milii-Q超纯水仪（美国Millipore公司）。 甲醇、异丙醇、甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）; 乙醇（色谱纯，德国Merck公司）; ?CO2（99.999%，上海振信气体有限公司）; 实验用水为超纯水。 2.2?实验方法 2.2.1?样品处理?广西莪术根茎样品采集自广西壮族自治区药用植物园，经广西壮族自治区药用植物园苏燕秋研究员鉴定为广西莪术根茎。将其切成片，用电热恒温鼓风干燥箱（40℃）烘干，然后用中草药粉碎机粉碎（24目）。取2.0 g干燥粉末于5 mL 萃取罐中，在超临界流体萃取仪中进行萃取。萃取条件：萃取背压15 MPa，萃取压力20 MPa，改进剂为乙醇，其比例为15%，萃取温度50℃，静态萃取时间10 min，动态萃取时间10 min，萃取次数（静态萃取+动态萃取）1次。获得的提取液经0.22 μm滤膜过滤后， 待测。 2.2.2?超高效合相色谱条件?色谱柱为Torus Diol 130 （100 mm×3 mm，1.7 μm）; 流动相A为CO2，流动相B为甲醇/异丙醇（3∶1， V/V）+ 0.1%甲酸; 梯度洗脱：0～2 min，98% A; 2～4 min，98%～92% A; 4～9 min，92%～60% A; 9～9.5 min，60%～98% A; 9.5～11 min，98% A; 流速0.4 mL/min; 补偿溶剂为甲醇，流速0.2 mL/min; 进样体积为1 μL; 柱温： 45℃; 背压：12.41 MPa。 2.2.3?质谱条件?比较正负离子两种扫描模式，结果正离子模式下质谱响应更强，在高能量通道下碎片信息更丰富。因此，最终选择在正离子模式下进行实验。离子化模式：ESI+; 毛细管电压：2.5 kV; 锥孔电压：40 V; 离子源温度：120℃; 雾化气温度：500℃; 雾化气流速：800 L/h; 锥孔气流速：50 L/h。扫描模式：Full Scan/MSE; MS1和MS2扫描范围：m/z 50～1200。 2.2.4?姜黄属植物化学成分数据库的建立?根据文献[32]报道的姜黄属植物的化学成分，建立姜黄属植物化学成分数据库。每种化合物条目包括化合物的名称、化学结构、分子式、精确分子量、植物来源及其拉丁名。姜黄属植物化学成分数据库共收录了211种化合物。 2.2.5?数据处理和化合物鉴定 把自建姜黄属植物化学成分数据库导入UNIFI软件后，设置UNIFI数据处理的参数：保留时间范围0～7.0 min; 在3D峰检测中高能量的峰强度阀值设为20 counts， 低能量的峰强度阀值设为160 counts; 分子质量偏差和碎片质量偏差分别设为5.0和10.0 mDa; 质量范围：50～1200 Da; 加合离子包括+H， +Na， +K和+NH4。亮氨酸脑啡肽[M+H]+=556.2766作为LockSpray校正标准液。UNIFI软件可自动完成以下数据处理，包括色谱峰的提取、分子式的确定、在内置的中药数据库和自建姜黄属植物化学成分数据库内筛查、离子碎片的匹配到化学成分的初步鉴定。对未与内置的中药数据库和自建姜黄属植物化学成分数据库匹配的化学成分，可通过UNIFI软件中的“说明”工具实现未知组分的鉴定，包括未知组分的分子式确定，在PubChem、ChemSpider等数据库进行在线数据库搜索，然后通过离子碎片匹配来确认化合物结构。 3?结果与讨论 3.1?色谱条件的优化 考察了Waters Acquity UPC2 Torus DEA （100 mm×3 mm， 1.7 μm）、Torus 1-AA （150 mm×3 mm， 1.7 μm）、Torus 2-PIC （100 mm×3 mm， 1.7 μm）、Viridis BEH （100 mm×3 mm， 1.7 μm） 和 Torus Diol 130（100 mm×3 mm， 1.7 μm） 5种色谱柱的分离效果，结果表明，Torus Diol 130 色谱柱的分离效果最好。因此，选用Torus Diol 130 色谱柱进行后续实验。采用梯度洗脱，调节流动相的比例，确定的最佳梯度洗脱条件如2.2.2节所述。应用Waters ISM补偿泵补充溶剂，增强化合物的离子化，补偿溶剂为甲醇，流速为0.2 mL/min。UPC2的背压为12.41 MPa。由色谱图（图1）可知，UPC2分离广西莪术化学成分的时间为7 min，运行时间短，体现了UPC2快速分离复杂中药化学成分的能力。 3.2?应用UNIFI软件鉴定广西莪术化学成分的方法 LC-MS联用鉴定中药化学成分的传统方法是通过手动提取每个色谱峰，然后由精确分子量推测出可能的分子式，检索在线数据库，最后由二级碎片离子推出可能的裂解途径，进而确定化学结构，这种方法费时、低效[33]。本研究应用UNIFI软件完成姜黄属植物化学成分数据库的建立和导入，自动进行分子式的确定、峰的提取、数据库筛查、数据处理以及化合物鉴定，进行中药的化学成分鉴定，快速、简单、高效。 3.2.1?建立姜黄属植物化学成分数据库?姜黄属植物包括广西莪术、蓬莪术（Curcuma phaeocaulis Valeton）、温郁金（Curcuma wenyujin）、姜黄（Curcuma longa L.）和郁金（Curcuma aromatica Salisb.）等植物。通过检索PubChem、ChemSpider等数据库并结合文献收录的姜黄属植物的化学成分[32]，建立姜黄属植物化学成分数据库，该数据库共收录了211种化合物，包括二苯庚烷类、单萜、倍半萜、二萜、多糖和酚酸类等化合物。姜黄属植物化学成分数据库的基本结构及其包含的信息包括化合物的名称、化学结构、分子式、精确分子量、植物来源及其拉丁名。 药用植物亲缘学理论认为，亲缘相近的药用植物所含的化學成分通常也相似，同一属的药用植物含有许多相同化学成分[34]。据此， 广西莪术的化学成分与姜黄属中其它药用植物会有许多相同的化学成分。有的化学成分实际上存在于广西莪术中，不过尚未有文献报道其在广西莪术中有分布，但已有文献报道其在姜黄属其它植物中有分布[33]。因此，建立姜黄属植物化学成分数据库作为筛查数据库，扩大了化合物的筛查范围，但筛查范围又比在线数据库小很多，这样有助于快速全面鉴定广西莪术中的化学成分。 3.2.2?UNIFI软件自动进行数据处理和化学成分鉴定?使用UNIFI软件的内置中药数据库（1.8.2版）和自建的姜黄属植物化学成分数据库共同作为筛选数据库。UNIFI数据处理的参数如2.2.5节所述。通过UNIFI软件的工作流程快速筛选出目标组分。UNIFI软件自动完成色谱峰的提取识别、分子式的确定、对中药数据库和姜黄属植物化学成分数据库的筛查以及将软件计算的理论碎片和仪器采集的碎片离子进行匹配，给出碎片离子的可能化学结构。对与中药数据库和姜黄属植物化学成分数据库中化合物结构匹配的组分，仅需要判断Mass Fragment自动给出碎片的合理性，便可初步鉴定目标组分。 3.2.3?鉴定未与筛选数据库匹配的未知化合物?对未与内置中药数据库和姜黄属植物化学成分数据库匹配的组分，可通过精确质量数和元素组成分析，推测可能的分子式，再以分子式在PubChem、ChemSpider等数据库进行在线搜索，得到可能的化学成分，并进行质谱碎片自动匹配，从而实现未知组分的鉴定。对未与筛选数据库匹配且并未在在线数据库检索到的化学成分，需根据其精确分子质量、质谱碎片以及同类化合物的特征碎片推断其结构。 3.3?广西莪术的化学成分鉴定 应用UNIFI软件鉴定广西莪术化学成分的方法，得到其化学组分，并通过与文献报道的化学成分的分子式、化学结构和质谱数据相比较，对一些化合物进行了进一步验证。本实验初步鉴定广西莪术干燥根茎的SFE提取物中共47种化学成分，其中42种是倍半萜类化合物， 有8组同分异构体共37种化合物，结果见表1。 应用GC-MS方法分析6个不同产地广西莪术的揮发油，GC运行时间约50 min，各产地广西莪术的化学成分种类和含量都有非常大的差别，所含的化学成分都是单萜和倍半萜类化合物，其中广西玉林福棉区的样品测出的化合物种类最多，为40种[35]。应用RPLC×RPLC-Q-TOF-MS分析广西莪术根茎的超声提取物，初步鉴定出105种化学成分，但分离时间太长，仅1D LC的运行时间就达到120 min[31]。以上两种方法与本方法分离鉴定广西莪术的化学成分的种类有区别。一种原因是不同地区不同时间采集的广西莪术样品所含的化学成分有不同。正如Zhang等[35]用同样的样品制备和分析方法分析不同产地的广西莪术，发现无论是它们的化学成分，还是化学成分含量都有明显的区别。另一种原因是样品提取的方法不一样，导致提取物中的化学成分不完全相同。还有一种原因是分析方法不同，可能也会导致分离鉴定的化学成分不一样。GC-MS无法分离鉴定高沸点、难气化或热不稳定的化合物。二维色谱比一维色谱具有更强的分离能力，可分离出比一维色谱更多的化合物。 对复杂中药中化学成分的分析，RPLC×RPLC-Q-TOF-MS比UPC2-QTOF-MS具有更高的峰容量，但UPC2-QTOF-MS比RPLC×RPLC-Q-TOF-MS的分析速度快，更适合中药的质量控制和日常分析。应用GC-MS分析中药中化学成分时，为了将化合物更好地分离，并得到较好的峰形，常采用程序升温方法，但会导致分析时间较长。如应用GC-MS分析广西莪术时，采用程序升温方法，升温速度为5℃/min， 柱温从40℃升温到280℃需要48 min[35]。本方法仅需7 min即可分离广西莪术中的47种化合物。由此可见，UPC2-QTOF-MS方法分析复杂中药中化学成分具有比GC-MS方法更快的速度，并且无需衍生化处理也能分析难气化或热不稳定的化合物。因此，UPC2-QTOF-MS是一种快速分离鉴定中药中化学成分的方法。 由于化学成分复杂，天然产物的分离是一个很大的挑战，尤其是当同分异构体是结构类似物和立体异构体时，分离和纯化难度更大[36]。大量的同分异构体分析物对色谱分离是一个巨大的挑战[37]。本研究共分离鉴定出47种化学成分，其中有8组同分异构体共37种化合物，说明UPC2-QTOF-MS具有卓越的分离鉴定同分异构体的能力。 4?结 论 建立了一种应用SFE萃取广西莪术、UPC2-QTOF-MS分析其提取物，结合UNIFI软件的中药数据库和自建的姜黄属植物化学成分数据库筛查，快速分离鉴定广西莪术中的化学成分的方法。本方法具有前处理简单、分析速度快、高效全面以及绿色环保等特点，为广西莪术中药材及其产品的质量控制和药效物质基础研究提供了一种新的分离鉴定方法。UPC2-QTOF-MS也可用于其它中药化学成分的分析。 References 1?Jiang Y， David B， Tu P F， ?Barbin Y. Anal. Chim. Acta， ?2010， 657（1）： 9-18 2?Li D X， ?Schmitz O J. Anal. Bioanal. Chem.， ??2015， ?407（1）： 231-240 3?LIU Xuan， ?YUE Qing-Xi， ?GUO De-An. Chin. J. Nat. Med.， ??2009， ??7（4）： 260-269 刘 璇， ?岳庆喜， ?果德安. 中国天然药物， ??2009， ??7（4）： 260-269 4?Li F S， Weng J K. Nat. Plants， ??2017， ?3： 17109-17116 5?GAO Wen， SONG Hui-Peng， YANG Hua， LI Ping. Chinese Journal of Chromatography， 2017， 35（1）： 121-128 高 雯， 宋慧鹏， 杨 华， 李 萍. 色谱， 2017， 35（1）： 121-128 6?Zhang Z X， ?Bo T， Bai Y， ?Ye M， ?An R， ?Cheng F F， ?Liu H W. TrAC-Trend. Anal. Chem.， ??2015， ?72： 169-180 7?SONG Wei-Feng， TAO Ling， ZHONG Ming. Journal of Instrumental Analysis， 2012， 31（7）： 810-815 宋伟峰， 陶 玲， 钟 鸣. 分析测试学报， 2012， 31（7）： 810-815 8?Sun H， ?Liu C， ?Zhang A H， ?Han Y， ?Yan G L， ?Wang P， ?Wang X J. Anal. Methods， ??2015， ?7： 279-286 9?Fan YY， ?Man S L， ?Li H F， ?Liu Y X， ?Liu Z， ?Gao W Y. J. Pharmaceut. Biomed.， ??2016， ?120： 364-373 10?Zhuang B， ?Bi Z M， ?Wang Z Y， ?Duan L， ?Lai C J S， ?Liu E H. J. Pharmaceut. Biomed.， ??2018， ?154： 207-215 11?Perrenoud A G G， ?Veuthey J L， ?Guillarme D. J. Chromatogr. A， ??2014， ??1339： ?174-184 12?Huang Y， ?Tang G Y， ?Zhang T T， ?Fillet M， ?Crommen J， ?Jiang Z J. J. Pharmaceut. Biomed.， ??2018， ??147： 65-80 13?XU Yong-Wei， ?SUN Qing-Long， ?HUANG Jing， ?TAN Xiao-Jie. Mod. Instrum.， ??2012， ??18（5）： ?45-48 徐永威， ?孫庆龙， ?黄 静， ?谭晓杰. 现代仪器， ???2012， ??18（5）： 45-48 14?Gourmel C， ?Perrenoud A G G， ?Waller L， ?Reginato E， ?Verne J， ?Dulery B， ?Veuthey J L， ?Rudaz S， ?Schappler J， ?Guillarme D. J. Chromatogr. A， ??2013， ??1282： ?172-177 15?Gong X， ?Qi N L， ?Wang X X， ?Lin L J， ?Li J H. Food Chem.， ??2014， ?162： ?172-175 16?Guo W Y， ?Bian Z Y， ?Zhang D H， ?Tang G L， ?Liu W， ?Wang J L， ?Li Z H， ?Yang F. J. Sep. Sci.， ??2015， ??38（5）： 858-863 17?Jiang H， ?Yang L， ?Xing X D， ?Yan M L， Guo X Y， ?Yang B Y， ?Wang Q H， ?Kuang H X. J. Pharmaceut. Biomed.， ??2018， ??153： ?117-125 18?Zhou Q， Gao B Y， ?Zhang X， ?Xu Y W， ?Shi H M， ?Yu L L （Lucy）. Food Chem.， ??2014， ??143： ?199-204 19?Gao B Y， ?Luo Y H， ?Lu W Y， ?Liu J， ?Zhang Y Q， ?Yu L L （Lucy）. Food Chem.， ??2017， ?218： ?569-574 20?Tu A Q， ?Ma Q， ?Bai H， ?Du Z X. Food Chem.， ??2017， ?221： 555-567 21?Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. Beijing： ?China Medical Science Press， ??2015： ??274-275 国家药典委员会. 中华人民共和国药典. ?北京： ?中国医药科技出版社， ??2015： ??274-275 22?Li J， ?Zhao F， ?Li M Z， ?Chen L X， Qiu F. J. Nat. Prod.， ??2010， ?73（10）： 1667-1671 23?Phan M G， ?Tran T T N， ?Phan T S， ?Matsunami K， ?Otsuka H. Phytochem. Lett.， ??2014， ?9： 137-140 24?Xiang F F， ?He J W， ?Liu Z X， ?Peng Q Z， ?Wei H. Nat. Prod. Res.， ??2018， ?32（22）： 2670-2675 25?Dong C X， ?Zhang L J， Xu R， ?Zhang G， ?Zhou Y B， ?Han X Q， ?Zhang Y， ?Sun Y X. Int. J. Biol. Macromol.， ???2015， ??77： 99-104 26?Dong C X， ?Zhang W S， ?Sun Q L， ?Jiang Y J， ?Fu Z， ?Zhang Y， ?Du J， ?Sun Y X， ?Tao N， ?Yao Z. Int. J. Biol. Macromol.， ??2018， ??115： 1233-1240 27?LIN Guo-Biao， ?SU Jiang-Yu， ?YANG Xiu-Fen. Chin. J. Exp. Tradit. Med. Form.， ??2011， ?17（16）： 171-173 林國彪， ?苏姜羽， ?杨秀芬. 中国实验方剂学杂志， ???2011， ?17（16）： 171-173 28?ZENG Jian-Hong， ?MO Xuan-Yong， ?DAI Ping， ?HUANG Feng-Xiang， ?LIAO Ying， ?WANG Jian-Hong， ?CHEN Xu. ?Chin. J. Exp. Tradit. Med. Form.， ??2012， ?18（13）： 91-94 曾建红， ?莫炫永， ?戴 平， ?黄凤香， ?廖 迎， ?王建红， ?陈 旭. 中国实验方剂学杂志， ??2012， ?18（13）： 91-94 29?Chen S D， Gao J T， ?Liu J G， ?Liu B， ?Zhao R Z， ?Lu C J. ?Fitoterapia， ??2015， ??102： ?67-73 30?Yang F Q， ?Li S P， ?Zhao J， ?Lao S C， ?Wang Y T. J. Pharmaceut. Biomed.， ?2007， ??43（1）： 73-82 31?Zhou W J， Guo Z M， ?Yu L， ?Zhou H， ?Shen A J， ?Jin Y， ?Jin G W， ?Yan J Y， ?Yang F， ?Liu Y M， ?Wang C R， ?Feng J T， ?Liu Y F， ?Liang X M. Talanta， ??2018， ??186： 73-79 32?Sun W， ?Wang S， ?Zhao WW， ?Wu C H， ?Guo S H， ?Gao H W， ?Tao H X， ?Lu J J， ?Wang Y T， ?Chen X P. Crit. Rev. Food Sci. Nutr.， ??2017， ??57（7）： 1451-1523 33?Deng L， ?Shi A M， ?Liu H Z， Meruva N， ?Liu L， ?Hu H， ?Yang Y， ?Huang Ch， ?Li P， ?Wang Q. J. Mass Spectrom.， ??2016， ??51（12）： ?1157-1167 34?CHEN Si-Bao， ?PENG Yong， ?CHEN Shi-Lin， ?XIAO Pei-Gen. Mod. J. Tradit. Chin. Med. Mater. Medica.-World Sci. Technol.， ??2005， ??7（6）： 97-103 陈四保， ?彭 勇， ?陈士林， ?肖培根. 世界科学技术—中医药现代化， ???2005， ??7（6）： 97-103 35?Zhang L Y， ?Yang Z W， ?Huang Z B， ?Zhao M C， ?Li P H， ?Zhou W， ?Zhang K， Zheng X， ?Lin L， ?Tang J， ?Fang Y X， ?Du Z Y. Chem. Biodivers.， ?2017， 14（7）， e1700020 36?Xin H X， ?Da Z S， ?Cai J F， ?Ke Y X， ?Shi H， ?Fu Q， ?Jin Y， ?Liang X M. J. Chromatogr. A， ??2017， ?1509： ?141-146 37?Teubel J， ?Wust B， ?Schipke C， ?Peters O， ?Parr M K. J. Chromatogr. A， ??2018， ?1554： ?101-116 |
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