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中短链聚羟基脂肪酸酯的低成本生产与应用

范文

魏继华刘越李佳益杨景辰刘长莉

摘要：聚羟基脂肪酸酯（PHA）是在不平衡生长条件下由微生物产生的聚酯。由于其单体组成及排列方式的多样性，PHA不仅具有生产生活中常见塑料材料的优良物理性能，同时具有良好的生物相容性、生物可降解性、可加工性等优良的生物性能，在众多领域都有良好的应用潜能。但与传统石化塑料相比，PHA的生产成本较高，使其生产和应用受到限制。如何降低PHA的生产成本成为当今研究的热点话题。本文主要综述了聚羟基脂肪酸酯的多样性、低成本生产及其应用，以期为今后的相关研究提供一定参考。

关键词：聚羟基脂肪酸酯;生产成本;PHA产量;PHA的应用

中图分类号：X172 ?文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）16-0039-06

收稿日期：2018-05-02

基金项目：东北林业大学大学生科研训练资助项目（编号：201710225107）。

作者简介：魏继华（1997—），男，山东潍坊人，主要研究方向为环境微生物。

通信作者：刘长莉，博士，副教授，主要研究方向为环境微生物。

近20多年来迅速发展起来的聚羟基脂肪酸酯（PHA）是一种由微生物合成的胞内聚酯，属于天然的高分子生物材料。由于PHA具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的热加工性能，同时可作为可生物降解的包装材料、组织工程材料、缓释材料、电学材料以及医疗材料，因此其低成本生产已经成为近年来生物材料领域最为活跃的研究热点。本文主要介绍PHA的产量与成本问题以及新型PHA材料开发与利用的研究进展，并对PHA的现存问题进行总结与展望。

1 聚羟基脂肪酸酯概述

1.1 PHA的结构与种类

PHA的结构通式如图1所示，它在生物体内主要作为碳源和能源的贮藏性物质，在这些碳源和能源物质过剩，氮、氧、磷、硫等大量元素被耗尽的情况下，PHA可由不同种微生物合成[1-3]。作为一种从微生物中提取的生物聚酯材料，PHA由300余种单体组合而成，是一种全新的生物塑料[4]。根据单体结构的规律性，PHA可以分为PHA均聚物（homopolymers）、PHA嵌段共聚物（block copolymers）或PHA随机共聚物（random copolymers）等。

由于PHA的单体是手性R型羟基脂肪酸，拥有多种侧链、碳链长度，因此PHA种类繁多。由图2可见，不同单体之间的聚合方式、排布方式、分子量等因素也可造成PHA的多样性[5]。Tripathi等发现，通过预定比例的脂肪酸可以预先控制PHA的单体比例（表1），实现无规共聚物聚羟基丁酸羟基己酸酯（PHBHHx）或由3-羟基丁酸（3HB）和 3- 羟基己酸（3HHx）组成的嵌段共聚物的制备[6-7]。因此，如果单体比例稳定，材料将会显示出稳定的性质。而PHA的分子量同时受PHA合成酶浓度（或活性）、链转移反应的进行、PHA合酶的催化活性以及生物合成期间PHA的降解所影响[8]。因此，可以通过控制PHA分子量来调控聚合物的物理性质。例如在生产过程中向培养基中加入链转移剂如聚乙二醇（PEG）、甲醇、乙醇以及异丙醇，可以降低PHA的分子量[9-10]。

1.2 PHA的功能特性

PHA由于具有气体相隔性、压电性、生物相容性、光学活性等特性[11]，使其在电子科技、航空航天、医学药品、高附加值材料等领域有重要的应用价值。与传统塑料相比，PHA的主要优势在于其生物降解性，传统塑料的降解需要100年，而用聚-β-羟丁酸（PHB）生产的产品只需要12个月即可分解完全，且释放出的产物为无污染的水和二氧化碳，而CO2可被植物光合作用吸收、固定为生物质能源。由表1可见，部分PHA与聚乙烯等传统塑料的物化性能有很大不同[12-13]。

2 聚羟基脂肪酸酯的主要研究问题及解决思路

虽然PHA有诸多优良特性，但其广泛应用受到高昂生产成本的限制。高成本是由昂贵的碳源、复杂的灭菌步骤、强烈的曝气操作、碳底物向PHA产物的较低转化率、微生物的缓慢生长、不连续的发酵生产过程和昂贵的下游加工成本等高能量需求所导致的[14-15]。因此，如何降低生产成本、开发廉价的生产工艺是世界各国生物制品领域研究的热点。以下是针对当前问题所提供的解决思路。

2.1 廉价碳源的选择

为了降低原料成本，有研究者尝试采用纸浆、稻秆、山毛榉壳、活性污泥、食品废水和工业废水来代替精致碳源，且均已有成功的案例。表2展示了利用不同廉价碳源生产PHA的积累率。Povolo等报道，3HB-co-3HV-co-4HB三元共聚物可以直接以乳糖或废物原料如乳酪、乳清作为碳源来获得[16]，可见乳品业的剩余乳清可以作为碳源合成PHA;Cerrone等发现，富含甘露醇的青贮草榨汁可作为生产PHA的可再生碳基质[17];Ciesielski等认为，可以利用生物燃料的副产品——液相甘油作为原料生产PHA和乳酸，但液相甘油中含有残余甲醇，可能会对菌株的生长造成影响[18];罗氏真养菌能吸收未过滤的植物油脂废物以及废弃的动物油脂，并将其转换成PHA，且产量较高，与以葡萄糖作为碳源得到的产率相近[19];利用活性污泥法生产的PHA在细胞干质量（CDW）中的比例达到50%以上[20]，在厌氧-好氧活性污泥工艺中，微生物中储存的PHA最高可达细胞干质量的67%[21]，且该工艺流程不需要进行灭菌操作，从而实现了剩余活性污泥的资源化利用，表3展示了利用不同菌株生产PHB的积累率;另外，微生物还可以以苯系污染物如甲苯为碳源，通过开发新型的补料系统，实现纯菌株的大量稳定培养，从而使合成PHA的产能可以达到与使用其他碳源相当的水平[22]。

2.2 高产菌株的筛选

2.2.1 低成本野生菌

传统的PHA生产主要通过脂肪酸 β-氧化和脂肪酸从头合成途径实现，但这2种途径各有不足之处，脂肪酸β-氧化途径以脂肪酸为碳源来合成PHA，但脂肪酸是一种较昂贵的碳源且对微生物细胞有毒害作用，因此利用该途径大量合成PHA具有很大的限制性;脂肪酸从头合成途径虽然是利用碳水化合物为碳源生产PHA，但细胞内积累的PHA含量较低。基于上述原因，需要構建一个廉价、高效生产PHA的平台，而大肠杆菌作为目前合成PHA最常用的底盘菌之一，可以用来构建新的合成途径。Zhuang等在重组大肠杆菌中构建了逆向脂肪酸β-氧化循环中所需酶的过表达质粒，试图直接利用葡萄糖为碳源，通过构建逆向脂肪酸β-氧化循环，合成含有不同单体的中长链聚羟基脂肪酸酯（mcl-PHA）共聚物[23]。向单敲除硫酯酶基因菌株的发酵培养基中添加30 g/L葡萄糖，发现敲除硫酯酶基因的菌株合成的mcl-PHA含量最高，约占细胞干质量的4.01%[24]。Wu等基于减少发酵过程中鼓气能耗的思路，在大肠杆菌中用8个串联重复的微氧启动子来表达PHB合成基因，大大提高了重组大肠杆菌在微氧条件下合成PHB的能力，使PHB积累量达到90%，且有可能在发酵后期低氧条件下同样实现高效PHA生产[24]。

Yin等研究发现，在极端条件下培养的极端微生物对微生物污染更有抵抗力[25]。嗜盐细菌能够在高pH值、高盐浓度的培养基中迅速生长，表明嗜盐细菌具有高抗污染性，特别是在海水中至少可以生长2个月[26]。因此，采用廉价的农业废弃物为发酵材料，结合极端生存环境抑制杂菌生长的特性，以及培养基不灭菌、开放式培养的发酵工艺，可以显著降低PHA生产过程中的能源动力消耗以及底物、设备投资，最大程度降低PHA的合成成本[27]。

因此可以将嗜盐细菌作为底盘菌，通过合成生物学以及代谢工程改造手段，将其应用在PHA的合成方面。在用5-氟乳清酸和尿嘧啶作为选择压力的前提下，曾有学者将地中海富盐菌（Haloferax mediterranei）中乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶（pyrF）基因敲除，结果显示，该方法可以大大提高基因重组的效率，这种高效的基因敲除技术可广泛应用于嗜盐微生物的基因组改造中[28]。

2.2.2 工程菌株的筛选

在产量高、耐高密度发酵的菌种选育方面，Kahar等筛选的罗氏真养菌（Ralstonia eutro PHAH16）细胞干质量可达1.28×105～1.38×105 mg/L，PHB的积累量最高占菌体干质量的72%～76%[29]。Lee等研究发现，Pseudomonas putida在适宜生长条件下，细胞浓度可达?1.73×105 mg/L，降低培养基中的磷浓度后，PHA的积累量可达1.91×103 mg/L[30]。Arora等通过敲除Pseudomonas putida KT2442中的fadA、fadB基因，削弱了β-氧化循环途径，增强了该菌株积累3-羟基十二酸单体的能力，在增加产物附加值的同时提高了PHA产量，该工程菌株的PHA产量可达细胞干质量的84%，比野生菌株提高5倍左右[31]。

Lv等使用CRISPRi工程细菌合成PHA，通过编辑真核生物基因组来控制PHA生物合成途径通量和调整PHA组成[32]。首先，通过葡萄糖生产聚羟基丁酸酯（P3HB4HB）的途径构建大肠杆菌工程菌株。为了重定向碳通量，先把编码大肠杆菌琥珀酸半醛脱氢酶的天然基因sad用5个特别设计的单引导RNA置于CRISPRi的控制之下，该体系可形成由 1 mol%～9 mol% 4HB组成的P3HB4HB。另外，使用选择的单引导RNA如sucC2、sucD2、sdhB2和sdhA1，通过CRISPRi将由琥珀酰-辅酶A（CoA）合成酶和琥珀酸脱氢酶（分别由sucC、sucD、sdhA和sdhB基因编码）产生的琥珀酸优先引导至4HB前体。P3HB4HB中产生的4HB含量可以从1.4 mol%调整至18.4 mol%，这取决于下调基因的表达水平。结果显示，CRISPRi法是同时操作多种基因并控制大肠杆菌中代谢流量的可行方法[32]。

综上所述，与纯培养微生物相比，菌群发酵虽可以降低能耗，但菌群中菌种组成不能保持稳定，无法保障PHA单体的种类与含量稳定，因此菌群不能用于合成均一、稳定的高附加值PHA产品。

2.3 发酵生产工艺的改进

利用现代科学手段，例如合成生物学、基因工程技术、代谢路径的修饰、蓝水生物技术等方法，开发PHA高产菌株已成为研究领域中的主体思路[4]。在合成聚羟基脂肪酸酯的过程中，对发酵流程进行改造与优化，从而控制培养过程中的相关条件如温度、pH值、通气量（碳氮比）、流加速率、培养周期等，可以使细菌的生长繁殖速率与PHA的生成量达到最大值[33-35]。Li等研究发现，菌体中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）水平对PHA的产量影响较大，因此可以通过相应的辅酶工程手段提高PHA产量[36]。

Shimizu等通过使用批次和半批次培养方式，在营养物富集和化学成分确定的培养基中研究以乙酸、丙酸和丁酸为碳源，利用嗜碱杆菌产碱菌（Alcaligenes eutrophus）生产PHA的过程，结果发现，PHA的形成与细胞生长有关，高浓度（≥50 mg/L）乙酸会同时抑制细胞的生长和PHA的形成，但毒性效应随细胞质量的增加而降低，在无毒浓度范围内，细胞生长和PHA形成均与乙酸浓度成线性比例;通过半间歇培养，丁酸浓度被控制在低水平（20～40 mg/L），且PHA形成速率与丁酸浓度成线性比例，表明丁酸在化学成分确定的培养基中没有毒性作用，在浓度为80～100 mg/L的铵盐中，丁酸主要用于PHA的形成;在以丙酸为碳源的培养条件下，富营养化生产共聚物聚（羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯），结果显示，含量约为40%[37]。刘一平等对好氧瞬时补料工艺合成聚羟基脂肪酸酯的研究中发现，生产PHA的最适条件为化学需氧量（COD）6 000 mg/L，pH值8.5，运行周期24 h，此时PHA的细胞干质量积累率达到最大值，为31.1%[38]。

2.4 与其他化学品的联合生产

众所周知，能够同时积累多种产品的工程微生物在生产实际中具有强大的经济吸引力。Li等通过采用联合生产的方法，在合成PHA的同时生产出了氨基酸、蛋白质、醇、氢、生物表面活性剂、胞外多糖等有价值的化学品，通过这个方法可以降低PHA生产成本[39]。除降低成本外，联合生产还可以解决部分废弃物问题，使得细胞和上清液乃至沼气都有用。以麻风树生物柴油废弃物为例，利用“废物”可生产3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚物（PHBV）和 ε-聚赖氨酸[40]。Kang等证实了PHA和琥珀酸盐可进行联合生产[41]。Li等发现，用Halomonas sp.TD01进行5-氨基乙酰丙酸（ALA，一种增值光动力抗癌药物）与PHA的联合生产，可以显著降低2种产品的相关生产成本[42]。Licciardello等通过研究地中海假单胞菌中藻酸盐与mcl-PHA的联合生产发现，培养48 h后，细胞干质量（CDM）达到2.89 g/L，粗制mcl-PHA累积量为0.52 g/L，更为有利的是在发酵过程中发现大量的alg基因被激活，导致藻酸盐大量合成[43]，藻酸盐常被作为化妆品原料，且可在食品和医疗领域中用作稳定剂和胶凝剂。综上所述，在聯合生产模式下，设计合理的伴生产品在降低制造成本和提高原材料利用率等方面具有巨大潜力。

3 聚羟基脂肪酸酯的应用

3.1 PHA的生物医药化应用

PHA具有良好的生物可降解性、生物相容性和可加工性能，可以作为高端生物医用材料[44]。其中中等长度PHA（mcl-PHA）因其良好的压电性、相容性等特性而被成功应用，且已被证明在血管组织工程[45]、软骨组织工程[46]和人造神经导管[47]等领域有良好的应用前景。Sodian等在小鼠肺部位置中接种使用3-羟基己酸酯和3-羟基辛酸酯的共聚酯[P（3HHx-co-3HO）]为主要材料制成的心脏瓣膜后发现，其功能持续性较好，可达120 d，无血栓形成和轻度狭窄[48]，且该共聚酯与其他聚合物混合可以改善PHA心脏瓣膜的性能。在PHA血管组织工程研究的早期，使用了灵活的mcl-PHA，包括聚3-羟基辛酸酯（PHO）和聚-4-羟基丁酸酯（P4HB）。在科技不斷发展的过程中，常利用P4HB构建P4HB/低聚半乳糖醛酸（PGA）组织工程血管贴片。Chen等发现，寡聚-羟基脂肪酸酯（HA）可以被身体转化成可以加入生物系统的具有代谢功能或调节功能的单体[49]。

除此之外，鉴于PHA微球表面易被修饰改造的特性，越来越多的功能蛋白通过与PHA微球表面蛋白（PHAC或PHAP）的融合表达，呈递在了PHA微球表面，使PHA微球成为一种廉价、高效的蛋白固定技术[50]。

3.2 PHA的工业化应用

目前工业化的应用主要是可降解塑料，用来解决传统塑料的白色污染问题，而未被修饰过的原始PHA无法满足工业化要求，因此，常常通过改变其物理性能来提高其机械性能。美国Metabolix公司将PHA作为一种新型环保的增塑剂对聚氯乙烯（PVC）进行了改性，拓展了PHA在塑料添加剂方面的应用[51]。Sudesh等研究发现，PHA具有明显的吸油效果，可能在化妆品和护肤品领域具有应用市场[52]，同时可被用于处理污水，吸附污水中的有机物[53]。

3.3 研发新型PHA，提高附加值

近年来，新型PHA材料的生产受到相关研究领域的关注，部分原因是目前市场上只有PHB和PHBV实现了半商业化规模生产，而通常研究的是PHA、聚羟基丁酸酯和聚羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯（PHB-V），其中PHB-V比PHA具有更坚韧、更不脆弱的优点，因此可以通过遗传修饰和培养条件优化等方式，使其发挥更大的作用。

4 总结与展望

利用农业原料、工业副产品、废水等生产PHA既可以降低PHA生产成本又有利于环境保护;利用野生和突变菌株的低成本底物研究可以提高PHA生产过程的经济性。

PHA通常由简单的碳源如糖（葡萄糖或蔗糖等）生产得到。然而，这些原料的高价格成本占PHA总生产成本的50%。因此，在过去几年中，植物油作为廉价碳源代表已被作为PHA生产的最佳候选者。由于它们在中链和长链脂肪酸单元中的组成不同，含油底物可以作为不同类型PHA的前体，具有特定的性质，导致最终产品有了新的应用。植物油因此具有广阔的发展空间。而作为植物油中的一种，橄榄油馏出物是橄榄油精炼工业的低市场价值（0.24～0.39美元/kg）副产品，占总加工油的0.05%～0.10%，主要由游离脂肪酸组成，该副产品对PHA生产的潜力尚未被调查。因此以橄榄油馏出物为唯一碳源，分别接种已经筛选好的食树脂假单胞菌（Pseudomonas resinovorans）和钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator）用于mcl-PHA和scl-PHA生产，可获得较高产量。因此，橄榄油馏出物是PHA生产的最佳候选底物，由于它能够提供高聚合物产量并允许通过选择适当的菌株合成不同的聚合物（scl-或mcl-PHA），因此是PHA生产的最佳候选底物。

众所周知，我国是一个人口大国，每年对肉类的消费非常庞大，产生的屠宰场废弃物或食用副产品、不再可食用的动物产品或食堂垃圾数量同样非常可观。这些废弃动物脂肪的处理难度较大，极易影响环境卫生，造成健康隐患。选择以牛脂为基础的生物柴油作为一种重要的碳源，接种绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis），采用连续补料分批模式合成 mcl-PHA 的体积生产率为138 mg/（L·h）。除此之外，从生物技术的角度来看，未来生物反应器的规模试验必须关注细胞内mcl-PHA含量的增加。这可以通过调节除氮源之外的其他生长限制因素来完成，如限制性磷酸盐供应等。另外，从敲除基因工程角度来看，可以通过敲除PHA解聚酶基因来防止已经积聚的mcl-PHA降解;同时还可以通过增加合酶的基因拷贝数或引入可提高聚合酶水平的诱导型启动子来获得更高的mcl-PHA产量。

作为具有良好生物性能和物化特性的新型材料，PHA具有深远的开发潜力，但是高额的生产成本限制了其大规模应用，如何更加有效地降低生产费用是当下亟需完善的问题，经过多年的研究，PHA产量已经逐步得到提升。随着研究的不断深入，PHA将在更多的领域有更好的应用前景。

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