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霍山石斛薄层鉴别研究

范文

戴亚峰王诗文王渊纵瑞叶潘跃黄跃华尚亮亮

摘要?[目的]]研究霍山石斛薄层鉴别方法，为霍山石斛质量标准的制定提供依据。[方法]采用薄层色谱法对霍山石斛、铁皮石斛、细茎石斛、河南石斛进行定性鉴别。[结果]霍山石斛能明显地区别于铁皮石斛、细茎石斛及河南石斛。[结论]已确定的薄层鉴别方法操作简单、可靠、专属性强，可以用于霍山石斛的薄层鉴别。

关键词?霍山石斛;铁皮石斛;细茎石斛;河南石斛;方法学;薄层鉴别

中图分类号?R284?文献标识码?A

文章编号?0517-6611（2020）14-0168-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.047

Abstract?[Objective]To establish a method to indentify?Dendrobium huoshanense?by TLC，and to provide basis for establishment of quality standard of?D.huoshanense?. [Method]TLC was used for the qualitative identification of?D.huoshanense， Dendrobiun officinale?Kimura et Migo，?Dendrobium moniliforme?（L.） Sw. and?Dendrobium henanense?J.L.Lu et L. X. Gao. [Result]D.huoshanense?was significantly different from?D.officinale， D.moniliforme?and?D.henanense.?[Conclusion]The established method is simple， reliable and specific. It can be used in the qualitative identification of?D.huoshanense.

Key words?Dendrobium huoshanense;Dendrobiun officinale?Kimura et Migo;?Dendrobium moniliforme?（L.） Sw.;?Dendrobium henanense?J.L.Lu et L. X. Gao;Methodology;TLC

霍山石斛是兰科石斛属植物，主要产于大别山区的安徽省霍山县，具有益胃生津、滋阴清热、养肝明目、润肺止渴等功效[1]，是历代中医名家推崇之养生佳品，享有“中华仙草之最” 的美誉[2]。霍山石斛生长环境要求高，以及长期以来无限制的采挖，野生霍山石斛的资源已近枯竭，物种濒临灭绝[3]。随着市场上霍山石斛需求量的日渐增大，其栽培品种正在逐渐地推向市场。而因为霍山石斛的生长周期长，培植成本高，生产产量供不应求，它的伪品产量日益增大，充斥着石斛市场，严重扰乱了正常的市场秩序。近年來，对于霍山石斛的研究主要集中于组培育苗、大棚栽培方向[4];而关于霍山石斛化学成分的研究却鲜见报道，有待进一步加强。迄今为止，有关霍山石斛化学成分的研究主要集中于霍山石斛多糖和生物碱方面[5-10]。霍山石斛的薄层鉴别方面所见报道很少，由魏刚等[11]出版的《中华仙草霍山石斛》（2015年10月出版）中，对霍山石斛薄层鉴别有所体现，但其所载的薄层鉴别方法不能有效地区分霍山石斛与铁皮石斛，未体现出霍山石斛的特征斑点。笔者对霍山石斛薄层鉴别进行进一步的研究，并对研究出的鉴别方法进行方法学验证试验，以期为霍山石斛质量标准的制定提供依据。

1?材料与方法

1.1?试验材料

1.1.1?试材。选取5批霍山石斛（表1），各批次霍山石斛经鉴定为霍山石斛?Dendrobium huoshanense?C.Z. Tang et S.J. Cheng。铁皮石斛?（Dendrobiun officinale?Kimura et Migo），批号121501-201201，ID：XAD3-95SK，来源于中国食品药品检定研究院。

细茎石斛?[Dendrobium moniliforme?（L.） Sw.]，批号20150406，由九仙尊霍山石斛股份有限公司栽培技术中心提供。河南石斛?（Dendrobium henanense?J.L.Lu et L. X. Gao），批号20150406，由九仙尊霍山石斛股份有限公司栽培技术中心提供。

1.1.2?试剂。薄层色谱用聚酰胺薄膜，分别购买于浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂出品、武汉鑫思锐科技有限公司;试验所用试剂均为分析纯，购买于国药集团化学试剂有限公司;试验用水为双重蒸馏水。

1.1.3?仪器。ZF-2型三用紫外分析仪（上海安亭电子仪器厂）;EX224ZH型电子天平（美国奥豪斯）;JP-020超声波清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）。

1.2?试验方法

1.2.1?样品溶液的制备。

取霍山石斛粉末（过2号筛）1 g，加无水甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水15 mL使溶解，用石油醚（60～90 ℃）洗涤2次，每次20 mL，弃去石油醚液，水液用乙酸乙酯洗涤2次，每次20 mL，弃去洗液，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，沸水浴蒸干，残渣加无水甲醇1 mL使溶解作为霍山石斛样品溶液。另取铁皮石斛对照药材、细茎石斛、河南石斛同法制成铁皮石斛对照溶液、细茎石斛样品溶液、河南石斛样品溶液。

1.2.2?方法耐用性考察。

1.2.2.1?不同固定相考察方法。

将20150126批霍山石斛样品溶液，按照薄层色谱法试验，吸取3～5 μL，分别点样于3种聚酰胺薄膜上（表2），以乙醇-丁酮-乙酰丙酮-水（20∶20∶5∶85）为展开剂，展开，取出，105 ℃烘干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，105 ℃烘约3 min，置365 nm紫外光灯下检视。

1.2.2.2?不同展开剂考察方法。

将20150126批霍山石斛样品溶液，按照薄层色谱法试验，吸取3～5 μL，分别点样于同一批号的聚酰胺薄膜上，分别在不同的展开剂（表3）中展开，取出，105 ℃烘干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，105 ℃烘约3 min，置365 nm紫外光灯下检视。

1.2.2.3?不同展开环境考察方法。

将20150126批霍山石斛样品溶液，按照薄层色谱法试验，吸取3～5 μL，分别点样于同一批号的聚酰胺薄膜上，以乙醇-丁酮-乙酰丙酮-水（20∶20∶5∶85）为展开剂，设置不同的室内环境（表4），在不同的室内环境中展开，取出，105 ℃烘干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，105 ℃烘约3 min，置365 nm紫外光灯下检视。

1.2.3?方法专属性考察。按照薄层色谱法试验，分别吸取20150126批霍山石斛样品溶液、铁皮石斛对照溶液、细茎石斛样品溶液、河南石斛样品溶液各3～5 μL，点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-丁酮-乙酰丙酮-水（20∶20∶5∶85）为展开剂，展开，取出，105 ℃烘干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，105 ℃烘约3 min，置365 nm紫外光灯下检视。

1.2.4?霍山石斛薄层鉴别。按照薄层色谱法试验，分别吸取20150126、20150228、20150402、20150530、20150625共5批霍山石斛样品溶液、铁皮石斛样品溶液、细茎石斛样品溶液各3～5 μL，点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-丁酮-乙酰丙酮-水（20∶20∶5∶85）为展开剂，在温度低于20 ℃的环境下展开，取出，105 ℃烘干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，105 ℃烘约3 min，置365 nm紫外光灯下检视。

2?结果与分析

2.1?方法耐用性考察

2.1.1?不同固定相考察。

由图1可知，采用不同厂家的聚酰胺薄膜及同一厂家不同批号的聚酰胺薄膜为固定相，霍山石斛薄层鉴别色谱图无明显差异，固定相1中各斑点分离效果较固定相2、固定相3好。

2.1.2?不同展开剂考察。

由图2可知，对展开剂进行微小的变动，霍山石斛薄层鉴别色谱图存在较明显的差异，霍山石斛薄层鉴别展开剂要求严格按照已确定的配比进行精密配制。

2.1.3?不同展开环境考察。

由图3可知，对霍山石斛薄层鉴别展开时室内环境进行考察，在低温的环境下（图3a），各斑点分离较好，在空调25 ℃制热、相对湿度70%的条件下（图3d），霍山石斛各斑点基本无法正常分离。因此，霍山石斛薄层鉴别，在色谱展开的过程中，建议控制室温在20 ℃以下，确保各斑点显色清晰可辨。

2.2?方法专属性考察?由霍山石斛专属性考察（图4）可知，霍山石斛薄层色谱图能明显区分于其亲缘性很近的铁皮石斛、河南石斛、细茎石斛，即已确定的霍山石斛薄层鉴别方法专属性强，可用于霍山石斛的鉴别。

2.3?霍山石斛薄层鉴别?由5批霍山石斛薄层色谱图（图5）可知，不同批次间霍山石斛存在细微的差异，但不影响霍山石斛的整体鉴别;霍山石斛能明显地区分于铁皮石斛和细茎石斛。霍山石斛薄层鉴别方法简单、可操作性强。

3?结论与讨论

霍山石斛具有很高的商业价值[12]，因此市场上假冒伪劣产品现象严重。近年来对霍山石斛的鉴别方法很多，各有利弊。传统霍山石斛的鉴别方法均为外观性状及显微鉴别，难以区分真伪;王晖等[13]对霍山石斛及其常见混伪品进行了DNA条形码分析，但方法操作复杂且成本高昂。

許莉等[14]采用薄层色谱鉴别方法对细茎石斛、金钗石斛等20种石斛进行了考察，其未对霍山石斛进行研究;由魏刚等[11]出版的《中华仙草霍山石斛》中虽利用薄层色谱法对霍山石斛、细茎石斛、铁皮石斛进行鉴别，但无法区分霍山石斛与铁皮石斛。这2个文献涉及的鉴别方法与该研究均不相同。从上述薄层鉴别试验结果中斑点的有无、斑点的大小、斑点颜色深浅上可以看出，霍山石斛与细茎石斛、铁皮石斛、河南石斛中所含化学成分及含量有较大差异，霍山石斛相比细茎石斛、铁皮石斛和河南石斛有一明显特征斑点。该研究结果表明霍山石斛中含有多种黄酮类成分，且与铁皮石斛、细茎石斛、河南石斛有一定的差别。到目前为止，暂未确定从霍山石斛中分离出来的特征斑点属于哪种黄酮类成分，需要进一步的研究。

通过对霍山石斛薄层鉴别方法进行方法学试验可知，霍山石斛薄层鉴别方法操作简单、可靠、专属性强，可用于霍山石斛的薄层鉴别，为霍山石斛质量标准的制定提供理论依据。

参考文献

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[13]王晖，时玲玲，周珏，等.基于DNA条形码分析的霍山石斛及其常见混伪品的初步研究[J].中国中药杂志，2018，43（20）：4055-4061.

[14]许莉，郭力，陈佳江，等.20种石斛的薄层色谱鉴别[J].成都中医药大学学报，2013，36（2）：6-7.

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