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标题

宽体金线蛭研究进展

范文

郑利覃川杰

摘要宽体金线蛭是一味中药材，具有活血化瘀、抗血栓、抗肿瘤及抗早孕等重要作用，其唾液腺中存在着能减缓血液凝固、抑制血栓形成的水蛭素。目前，宽体金线蛭体内的活性成分是治疗心血管疾病重要药物之一，因此宽体金线蛭在药业市场的需求量大。近十几年来，宽体金线蛭养殖技术和水蛭素药用价值深受研究者关注。主要归纳和总结了宽体金线蛭的生物学特性、养殖技术，水蛭素的提取方法、药理作用等方面的研究进展，以期为宽体金线蛭的养殖和开发提供参考。

关键词宽体金线蛭;生物学特性;养殖技术;分离纯化;活性测定;药理作用

中图分类号 S917.4? 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）20-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.001

Research Progress of Whitmania pigra

ZHENG Li 1，2，QIN Chuanjie 1，2 （1.College of Life Science， Neijiang Normal University， Neijiang，Sichuan 641100; 2. Key Laboratory of Sichuan Province for Fishes Conservation and Utilization in the Upper Reaches of the Yangtze River， Neijiang Normal University， Neijiang，Sichuan 641100）

Abstract Whitmania pigra is a kind of traditional Chinese medicine. It has the functions of promoting blood circulation，removing blood stasis， antithrombotic， antitumor and anti early pregnancy. Hirudin ，in salivary gland of W. pigra，relieve blood coagulation and inhibit thrombosis.At present， hirudin of W. pigra is an important drug for the treatment of cardiovascular diseases. So W. pigra has a large demand in the pharmaceutical market.In recent ten years， the cultivation technology of W.pigra and the medicinal value of hirudin have attracted much attention of researchers. In this paper， the biological characteristics， cultivation technique， the extraction method and pharmacological action of hirudin were summarized， in order to provide reference for the farming and development of W. pigra.

Key words Whitmania pigra;Biological characteristics;Cultivation technique;Separation and purification;Activity determination; Pharmacological action

宽体金线蛭（Whitmania pigra ）隶属于环节动物门、蛭纲、无吻蛭目、黄蛭科、金线蛭属 [1]，其分布范围广 [2]、个体大、适应能力强，可用于治疗血滞经闭、瘀血和跌打损伤等症状 [3]。随着生物技术的蓬勃发展，宽体金线蛭的药用价值陆续被挖掘利用。从宽体金线蛭头部和口部提取的水蛭素，不仅有活血化瘀的作用，还具有抗癌、抗细胞凋亡和抗早孕等作用，且为目前治疗心脑血管疾病的重要药物之一。随着社会老龄化问题不断加重，心脑血管疾病患者不断增加，对水蛭素等抗凝药物的需求量越来越大。然而化肥和农药的大量使用，使自然环境逐年恶化，加上人工过度捕捞，野生宽体金线蛭资源严重不足，这使宽体金线蛭不能满足市场需求。为此，对其进行大规模引种养殖是解决这一问题的有效途径。此外，水蛭素的纯化程度和活性强弱是影响药物效果的重要因素。欲获得高纯度、抗凝血作用强的水蛭素，则需要采用恰当的分离纯化和活性测定法，才能有效提高水蛭素的提取率、纯度和抗凝作用。笔者主要从宽体金线蛭的生物学特性、养殖技术，水蛭素的分离纯化、活性检测以及药理作用方面进行综述，以期为宽体金线蛭的养殖和开发提供参考资料。

1 宽体金线蛭的生物学特性

1.1 形态学特征宽体金线蛭个体较大，其体型为纺锤且扁平型，体长7～13 cm，宽1.3～2.0 cm，体重10～30 g;蛭体有2个吸盘分别位于其前后的尖端处;宽体金线蛭的前吸盘与后

吸盘不断交替吸附物体可使蛭体运动，其主要的运动方式有游泳式、尺蠖式和蠕动式 [4]。宽体金线蛭的口腔内生长着比较发达的颚，颚表面有2列用来撕破宿主皮肤的齿板 [5]。宽体金线蛭体表的颜色会因环境不同而稍有区别，大多数蛭体背部由暗绿和黄黑相间的纵线条纹组成，且位于中间的条纹颜色较深;蛭体腹面呈淡黄色且混杂着许多不规则的暗绿色斑点;处于生殖季节的宽体金线蛭体表有较明顯的生殖环带，但非生殖季节的蛭体表面环带不是很明显 [6]。

1.2 生活习性自然环境里的宽体金线蛭一般喜欢生活在较温暖的沿岸浅水区，环境安静隐蔽、水流缓慢、有较多的水生植物和水生软体动物，便于宽体金线蛭吸附物体活动和摄取食物，沿岸处要有湿润疏松和腐殖质丰富的土壤，便于宽体金线蛭产卵孵化 [7]。在人工养殖过程中，用于宽体金线蛭产卵孵化的土壤需要保持一定的湿度，其土壤基质的湿度一般以60%为宜 [8-9]，便于宽体金线蛭的种蛭钻入土壤层中产卵茧。吴雷明等 [10]研究发现蘑菇菌渣与土壤混合组比单独的蘑菇菌渣组和土壤组幼蛭孵化率高。童水明等 [11-12]研究认为宽体金线蛭偏好于稻草基质上产卵，膨胀蛭石可作为其蛭卵的孵化保温基质利于孵化。郭坤等 [13]研究认为将稻草和土壤按1∶1混合后适合作为宽体金线蛭的越冬基质。

宽体金线蛭是一种变温动物。温度的变化对宽体金线蛭影响较大 [4]。自然水温在10 ℃以下时会使宽体金线蛭陆续进入冬眠状态;13 ℃的水温会使宽体金线蛭陆续出土摄食 [14];25 ℃是宽体金线蛭幼蛭生长速率最快、存活率最佳的养殖水温 [15]。水温在30 ℃以上时宽体金线蛭会出现急躁、疯狂游动，水温超过35 ℃或低于4 ℃时出现大量死亡 [16]。宽体金线蛭主要生活于淡水中，其对水体中的含盐量要求不高，一般不应超过0.1% [4]。宽体金线蛭适合生活在pH为 6.5～8.0的水体中 [16]。宽体金线蛭主要依靠体表进行有氧呼吸，它对水体溶解氧的量要求不高，在适宜温度条件下，宽体金线蛭能在水体溶解氧为1 mg/L以上生长良好 [7]。

自然水域中的螺蛳类、蛙类和蚬等软体动物是宽体金线蛭的天然饵料 [8-9]。在人工养殖条件下，动物的内脏、配合饲料和杂鱼类等可作为宽体金线蛭的饵料 [17]。宽体金线蛭幼蛭生长过程中，使用高质量的饵料对其健康生长极为重要。蔡银碧等 [18]研究发现与鸭血和菲牛蛭配合饲料相比，螺类更适合作为宽体金线蛭饵料。吴雷明等 [19]研究认为与蚯蚓相比，漂螺适合作为幼蛭的饵料，但应该用蚯蚓搭配使用，以提高幼蛭免疫力。王建国等 [20]研究認为幼蛭对螺蛳饵料的个体大小具有选择性，一般投喂体积小的螺蛳且早期投喂量为幼蛭体质量的11倍以上，才能满足幼蛭生长的营养需要。童水明等 [21]研究发现更适合作为宽体金线蛭幼蛭生长的饵料是福寿螺，而非田螺。王亚等 [22]研究认为与田螺相比，以椎实螺作为宽体金线蛭苗饵料能显著促进其生长，提高幼苗存活率。林小清等 [23]研究发现最佳宽体金线蛭仔蛭生长的饵料是由原生动物与螺蛳混合所制。王宣朋等 [24]研究发现以轮虫和圆田螺作为饵料的仔蛭生长率最快、存活率最佳，这与马春庆等 [15]的研究结果基本一致。由此可见，投喂原生动物与田螺混合而成的饵料，有利于宽体金线蛭仔蛭生长。

1.3 繁殖习性宽体金线蛭属于雌雄同体、异体交配的环节动物。在水温为14? ℃时，达到性成熟的宽体金线蛭会在安静的清晨，就近岸疏松土层中进行交配 [4]。宽体金线蛭交配受精后，需经历30 d的怀孕期，才开始产卵茧 [25]。刚产下的卵茧经28 d自然孵化，可孵出幼蛭，每个卵茧可孵化出16～35条幼蛭 [26]。

2 宽体金线蛭养殖技术

2.1 养殖模式

2.1.1 池塘养殖。用于养殖宽体金线蛭的池塘分为土泥池和水泥池2种。渗透性好的土池，可用水泥修建成水泥池塘;而对于渗透性差的地方，可根据当地实际情况开挖养殖池塘。养殖宽体金线蛭的池塘面积为300～400 m2，水深为 0.8～1.0 m;池壁周边应修建高出池塘水位0.1～0.2 m的平台，其宽为0.5～1.0 m;保持平台土壤的湿润疏松和丰富腐殖质是宽体金线蛭打洞产卵茧的必要条件 [27]。在池底部可放置些小瓦片、碎石块和种植一些水草等;水面放些浮性水生植物，以供宽体金线蛭栖息 [28]。熊良伟等 [29]研究表明用池塘养殖宽体金线蛭，可收入纯利润28.5万元/hm2，获得了较高的养殖效果。

2.1.2 网箱养殖。用40～50目尼龙网布缝制成网箱;箱体的四边用4根毛竹或其他柱子作为框架;用泡沫桴子撑起箱顶的四角使网箱向内高出水面0.2 m左右，以防止宽体金线蛭逃逸;沉子放于箱底部以固定箱体;用铁丝将网箱固定于已经打好的木桩上;网箱底部与池底保持0.6～0.7 m，使水体交换流通 [30]。在箱底放瓦片、石块并种植一些绿色水草，供蛭栖息 [31]。养殖过程中的网箱应经常清理，并始终保持网箱内外水体流通 [32]。

2.1.3 生态养殖。水生植物与宽体金线蛭间作是一种生态养殖模式，如莲藕-水蛭-螺蛳、水蛭-田螺-水稻或茭白，具有节约用地、投资少和经济效益高等特点。作为生态养殖池的池埂可高出水面1 m，水深0.8 m，宽3.0 m，而生态养殖池的长度可因养殖规模和地势高低而变化;水生植物的种植面积应占池塘面积的1/3，以便供宽体金线蛭栖息;在池子边需用网遮挡住进出水口，便于水的排灌以及防止宽体金线蛭逃逸 [33]。李顺等 [34]将水蛭与莲藕混养于667 m2的池塘里，获得500 kg的水蛭，经济效益显著。

2.2 养殖技术路线虽然宽体金线蛭的养殖模式诸多，但其养殖的基本技术路线还是大致相似的，其基本养殖路线如图1所示。

2.2.1 宽体金线蛭的选择与放养。引种放养的种蛭一般选择2龄以上、健康有活力，若用手去触碰它，它会立刻皱缩成一团者为最佳 [35]。体质量为20～30 g的宽体金线蛭适合作种蛭 [36]。新购回的种蛭不可直接放到养殖池中，以防止突然的应激而造成种蛭死亡 [37]。种蛭放养前应清除池内杂物并注水10 mL，再用15 kg/hm2的强氯精杀死池中的野生鱼虾及病原微生物;繁殖小球藻作为螺类的食物 [29]。在4月中旬，可陆续将亲蛭放入养殖池中，待其入池后应尽量保持水体环境良好，且要有充足的浮游动物和螺蛳类以供宽体金线蛭吸食 [38]。舒斌等 [39]研究发现宽体金线蛭繁殖时最佳放养时段为30～35 d，可提高产卵率。

2.2.2 日常管理。

2.2.2.1 投喂饵料。人工养殖的宽体金线蛭主要摄食鲜活的螺类，其次是以昆虫幼虫和动物血块作为辅料。在人工养殖过程中，应遵循四定原则，以利于宽体金线蛭正常进食和生长繁殖。宽体金线蛭食用完后应及时将剩余的残渣清理干净，避免污染水质 [38]。

2.2.2.2 防治疾病。若环境突然变化与饲养密度过大，会使生命力顽强的宽体金线蛭增加感染疾病的机率 [37]。因此需保持池水清洁酸碱适中，保持养殖水温在20～25 ℃;以养殖池水的水质情况作为换水次数的依据，若养殖池水的水质良好，可15 d左右换一次水;若养殖池水的水质较差，需根据实际情况勤换水;换水速度不宜过快，否则过大的水温变化会影响宽体金线蛭的生长 [29]。唐毅等 [40]研究发现养殖宽体金线蛭时可以放心选择的渔药为二氧化氯和聚维酮碘，而应谨慎使用伊维菌素、高锰酸钾和苯扎溴铵等药物。在养殖过程中，每天应做到经常巡塘，观察水蛭活动情况和水体颜色变化状况，避免出现问题后不能及时处理。

2.2.3 宽体金線蛭产卵孵化。亲蛭交配期间需保持安静，避免其受到干扰而不能成功交配。亲蛭在交配受精后，会经历30 d左右的怀孕期，30 d后产下卵茧，卵在茧内自然孵化 28 d 左右，幼蛭会破茧而出;孵化过程中，保持适当的温度至关重要，当卵茧所处的土壤温度低于15? ℃时，所能孵出幼蛭的孵化率极低;25? ℃左右的土壤温度，能孵出幼蛭的孵出率最高;温度若超过35? ℃，则不能孵出幼蛭 [41]。而孵化时，水位所处的位置是保持孵化温度的关键。在室外孵化时，若天气炎热应向池中注水到产卵时的水位，否则卵会干死;若天气潮湿多雨应使水位降到产卵时的水位，否则卵会烂掉 [4]。邱楚雯等 [8]研究发现若维持孵化箱内土壤的湿度为30%～40%时，能使幼蛭的孵出率最佳。幼蛭生长期间，应提供充足的螺类的软体部分、动物的新鲜血块和原生动物等;待每条幼蛭平均体长为0.15 m以上时，转入大池进行养殖 [38]。

2.2.4 捕获宽体金线蛭。每年10月份可捕捉宽体金线蛭，其方法是将动物的血液洒在草把上经晾干后放入水中诱捕宽体金线蛭，一段时间后将扎草把取出抖下宽体金线蛭，捡大放小，多次重复上述动作即可获得成蛭 [42]。

2.2.5 宽体金线蛭加工方法。宽体金线蛭干制品质量的好坏，会影响到售价的高低;干制的水蛭成品一般以自然扁平、易脆易断且富有光泽者为最佳 [37]。宽体金线蛭的加工方法可归纳为以下3种：①将捕捞的宽体金线蛭埋入石灰中约 0.5 h，然后将死亡的宽体金线蛭晒干，筛出石灰粉即为成品 [25];②用线将捕捞的宽体金线蛭直接悬挂于阳光下暴晒;③用煮好的沸水烫死宽体金线蛭，再将烫死的宽体金线蛭捞出洗净晒干 [27]。

3 水蛭素的分离与纯化

水蛭素的传统提取方法是将水蛭品置于水、有机溶剂或水与有机混合的溶剂中进行提取 [43]。李宝红等 [44]采用丙酮、水提醇沉和醇提水沉的方法来提取水蛭素，并将这3种方法的提取效果进行两两比较，结果表明生物活性最强的水蛭提取物是用水提醇沉的方法提取的。刘洋等 [45]用丙酮提取体蛭的头部、口部以及蛭体其他位置的水蛭素，以比较3个不同部位的水蛭素活性，结果发现，蛭体口部的水蛭素抗凝血酶活性最佳，头部的水蛭素活性是口部的22%，蛭体其他部位的生物活性几乎为0。通过以上的比较，在生产中用水提醇沉法来提取水蛭干制品口部的水蛭素，可提高提取效率，获得较高的抗凝活性以及提高劳动效率，但为防止浪费，可将蛭体口部以外的其他部位作为中药材入药。Shan等 [46]为了确定水提法和仿生法对宽体金线蛭体内活性成分的影响，分别用仿生法和水提法从悬挂干蛭品、滑石粉油炸蛭品及乙醇浸泡后烘干蛭品中提取抗凝活性物，结果发现，用水提法从悬挂干蛭品中提取的活性成分抗凝血作用最强，乙醇浸泡后烘干蛭品次之，滑石粉油炸蛭品最弱;用仿生法从乙醇浸泡后烘干蛭品中提取的活性成分抗凝作用强，滑石粉油炸蛭品次之，悬挂干蛭品最弱。由此可见，对于不同的蛭品应考虑合适的提取方法。水蛭材料的不同也会影响提取效果，从活的蛭体中分离提取的水蛭素具有活性较强、纯度较高、还可以反复提取利用的优点，但从活体蛭体中分离水蛭素的操作难度大，因此在操作时，应避免伤害到蛭体，而影响下次提取;从干制品中分离提取水蛭素时，操作较简便，但水蛭素的纯度和活性不是很高 [47]。李濯冰等 [48]用传统提取方法与酶解提取法对水蛭素进行提取，并将所提取的水蛭素进行活性效果比较，结果发现酶解提取法优于传统提取法。酶解提取法虽然比传统提取法效果较佳，但成本相对较高。

使用科学合理的纯化技术是水蛭素活性物质有效利用的前提，离子交换和凝胶过滤层析法是目前主要的纯化方法。段超等 [49]先采用仿生法对鲜活水蛭进行诱导，再用超滤膜透析法对诱导获得的蛭体唾液进行分离，可得到纯度为92%的水蛭素。陈曦等 [50]通过先后使用阴离子交换层析和凝胶过滤层析的方法，能从35 g的水蛭粗品中得到5 g较纯的天然水蛭素，其总活力为2 250 IU。

4 水蛭素活性测定

目前测定水蛭素活性的方法主要有凝血酶滴定改进法、发色底物吸光值变化率法、纤维蛋白平板法及光散射法 [51]。不同的水蛭素活性测定方法有优点也有缺点，在选择水蛭素活性测定方法时可根据已有的条件，选择合适的测定方法。陈华友等 [52]通过配制不同倍数的凝血酶溶液来缩小所测水蛭素的活性范围，此方法简便又省时，且重复性和准确度好。

赵荣乐 [53]采用发色底物吸光值变化法测定水蛭素的活性，此方法灵敏度和准确度都较高，但需配备昂贵的仪器。

班建东等 [54]采用纤维蛋白原平板的方法来测定水蛭素的活性，此方法成本低、操作简单、准确度好，但比较耗时。

周靓等 [55]在已绘制好的标准曲线上寻找最高斜率处的水蛭素光散射强度每分钟变化值的对应值，此方法操作简单、成本低、准确性好，还可以较好地观察到反应的动力学过程。

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