基于寻峰算法的荧光检测设备的设计与实现
傅成杰 闫维新 赵言正
关键词： 荧光免疫层析; C反应蛋白; 寻峰算法; 单光路结构; 双闭环反馈; LED光源
中图分类号： TN247?34; TH776 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文献标识码： A ? ? ? ? ? ? ? ? 文章编号： 1004?373X（2019）03?0148?04
Abstract： A small?sized fluorescence detection device is designed to simply and accurately acquire the location of [T]?peak and [C]?peak in C?reactive protein （CRP） detection， and a window shifting peak?searching algorithm is proposed. This detection device includes the design and optimization of optical path and circuit. The design of single optical path structure can maintain the compact structure and small overall size of the device. The inner current feedback and outer light intensity feedback can make the output light excited by LED stable. The detection experiment results of CRP show that the window shifting peak?searching algorithm has easy operation and high precision， and the obtained location accuracy of [T]?peak and [C]?peak is increased by 50.0% and 52.9% respectively than that of the general polynomial fitting method.
Keywords： fluorescent immune chromatography; C?reactive protein; peak?searching algorithm; single optical path structure; double closed?loop feedback; LED light source0 ?引 ?言
免疫学检验包括定性、半定量、定量等检测模式，前两种模式无需知道精确的待检物质含量。然而，随着社会的发展和医学诊断的完善，定量检测模式的需求日渐增加。荧光免疫层析技术是一种快速定量检测技术，该技术建立在荧光免疫分析技术与免疫层析技术的基础上[1]，可以被运用于血样中C反应蛋白（CRP）[2]浓度的定量检测。荧光免疫层析技术利用荧光物质标记待测抗体或抗原的特异性反应过程[3]，荧光物质在激发光的照射下产生特定波长的荧光，通过光电检测模块采样收集光强信息，并通过处理算法将荧光信号量转换为待检物的浓度信息。
CRP是一种急性时相反应蛋白，对于鉴定感染及多种结缔组织病、判断疾病严重性或活动性等具有十分重要的意義[4]。在CRP检测实验中，向试纸条滴加血样，CRP在[T]线处发生反应，而游离标记物则在[C]线处发生相应反应。使用荧光扫描采样得到荧光光强信号数据，处理该数据之后，可获得具有一定峰特征的波形曲线，其含有2个明显峰，分别反映了[T]线和[C]线处对应荧光标记物的浓度。在一定范围内，[T]峰与[C]峰的峰面积比值[TC]与血样中待测物质的浓度成正相关，这是血样检测的理论基础。计算峰面积比值[TC]主要涉及原始数据的滤波算法和曲线的寻峰算法。而峰面积值比[TC]依赖于峰的具体位置，因此高精度的寻峰算法是保证系统检测精度的关键。
寻峰算法常用的方法有直接比较法、一般多项式拟合法、高斯多项式拟合法、高斯拟合法和优化寻峰算法等。其中直接比较法应用一阶微分，该方法在荧光强度曲线波动较大时寻峰精度较低，并且只适合找孤立峰。一般多项式法选择一般多项式进行拟合，最小二乘法进行判定，该方法简单、易于实现，但是寻峰准确度有限[5]。高斯多项式拟合法对波形曲线进行高斯?多项式变换，该方法的寻峰精度高于一般多项式拟合法，但该方法对波形曲线数据较敏感，抗噪性能差，并且如果波峰不在波形曲线数据内，那么得到的峰值误差会较大[6]。高斯拟合法[7]不经过多项式变换，直接作为Gaussian函数进行拟合处理，得到最佳拟合曲线，进而获得波峰位置。遗传算法[8]、基于径向基函数网络算法及蚁群算法等优化寻峰算法可以改善精确度，但计算复杂，需要较长时间的尝试与训练才能确定各个参数，求解速度慢，因此不适合快速、实时的运算[9]。
本文结合荧光波形曲线的峰特征，提出一种实施简单同时精度较高的平移窗口寻峰算法。接着设计了一种小型荧光检测设备，目的是改善目前市场上相关设备体积大、操作难的现状，其中着重进行了光电检测模块和上下位机软件的设计及优化。最后通过分析比较几种寻峰算法的实验结果，验证本文提出的平移窗口寻峰算法具有一定的应用意义。1 ?平移窗口寻峰算法
经滤波算法处理后，荧光强度波形曲线表现出明显的双峰特征。平移窗口寻峰算法的总体流程如图1所示，通过特定的峰位置可以截取获得有效的数据区域，最后得到峰面积值比[TC]。
1.1 ?初寻[T]峰
对多种浓度区间血样进行检测实验时发现，检测带（[T]线）区域和质控带（[C]线）区域的荧光强度，即波形曲线的纵坐标值始终处于较高的水平，并且[T]峰的位置靠前，[C]峰的位置靠后。某次实验的荧光强度波形曲线结果如图2所示。1.2 ?截取有效波形段及再次寻峰
因为[T]峰和[C]峰的位置较为固定，所以得到[T]峰位置后，截取附近的240个采样点作为有效数据区，构成新的荧光波形曲线。截取的目的一是为了减轻后续的数据计算量，二是为了后期能够将荧光波形曲线更加合理完整地展现出来。
现在有效数据区存在明显的、跨度较为合理的双峰特征，再次使用初寻[T]峰时使用的寻峰算法，最高峰和次高峰即为所求的两个峰。其中[T]峰靠前，[C]峰靠后。
1.3 ?确定边界位置及计算峰面积比[TC]
本文根据采样点的微分值确定边界位置。从[T]峰位置向前轮寻，其微分值从大于0.8到小于0.8的点，记为[T]峰的左边界点;从[C]峰位置向后轮寻，其微分值从小于-0.8到大于-0.8的点，记为[C]峰的右边界点;而[T]峰和[C]峰之间最低的点，记为[T]峰的右边界点和[C]峰的左边界点。
确定好边界位置后，采用累加和的思想分别求得[T]峰和[C]峰的面积，两者相除可以获得最终的峰面积比[TC]。2 ?系统设计
为弥补市场上相关检测设备体积过大、操作复杂的缺点，本文设计了一款小型荧光检测设备，整体框架如图3所示。该设备以TI的CC2640芯片作为主控单元，重点设计了光电检测模块和上下位机软件。其中光电检测模块主要包括光路设计和电路设计。2.1 ?光路设计
为减小荧光检测设备的整体体积，本文舍弃了体积占用比大的双通道光路结构，选取了单光路结构。如图4所示是单光路模块示意图，包括反馈PD、检测PD、LED光源、分光片、滤光片及凸透镜等光学元器件。另外，为了减轻杂散光对设备检测的影响，本文设计了光阱结构。
图4中箭头所示为光路的传播路径，当光路选通时，LED光源点亮，发出一定波长范围之间的光，主峰为检测所需的激发光，其波长记为[λ]。发出的光分成两路进行传播：一路作为反馈光路;另一路作为检测光路。反馈光路通过滤光片由反馈PD接收，本文把它作为LED的输出光强反馈信号，将用于后文的双闭环反馈电路中。而检测光路则较为复杂，首先通过滤光片得到带宽较窄、以[λ]为中心波长的激发光谱，接着是两块平行放置的分光片，以[45°]入射角射向第一分光片后，产生的反射光同样以[45°]射入第二分光片，产生的透射光即作为最终的激发光。激发光经由凸透镜聚焦到试纸条的荧光物质上，产生主峰波长为[λf]的荧光，荧光经过凸透镜后由第二分光片反射，产生的反射光通过滤光片后，检测PD接收其中波长为[λf]附近的光，荧光的光强信号由检测PD转化为电信号。
2.2 ?电路设计
为改善荧光信号检测的精度，需要保证激发光光强的稳定。而在一定范围内，LED光强与工作电流成线性关系[10]。因此，本文采用较为成熟的光强与电流的双闭环反馈电路，以减轻激发光对荧光检测的影响。LED光源本身随着使用时间的增长，温度会发生变化，发生光衰现象[11]，LED发出的光强减弱。同时，驱动电路自身存在电流波动，LED光强随之产生波动。外闭环依靠光强反馈来调整电流的数值大小，使光强输出达到稳定状态;内闭环依靠电流反馈使驱动电流输出达到稳定状态。
2.3 ?软件设计
小型荧光检测设备的软件部分包含上位机和下位机。上位机包括安卓APP和Java Web服务端，实现了荧光波形曲线的显示、结果的分析与存储等功能。下位机选择的是CC2640芯片，其本质是一块嵌入式ARM芯片，带有A/D可编程放大的功能，主要实现试纸条的推送控制、荧光光强信号的扫描采样以及荧光光强的数据传输等功能。
该设备忽略暗电流的影响，直接进入检测流程。血样首先在试纸条上完成层析反应，接着传送装置推送试纸条匀速通过光电检测模块，完成扫描采样最终得到荧光波形曲线。荧光光强信号的扫描采样流程如图5所示。
設备进行初始化后，扫描采样分三步完成：
1） 预采样，荧光光强信号由检测PD转换为电压量，经A/D转换可得到数字量，通道增益选择默认值;
2） 调整增益，根据满量程的数字量和预采样得到的数字量，调整增益的大小，保证再采样得到的数字量比满量程的数字量大于0.5，假如两者比值偏小，那么需调大增益来提高分辨率;
3） 再采样，增益值调整之后得到更准确的荧光光强信号并记录数值大小。判断采样点数是否达到目标采样点数，若已达到，则停止采样，将其作为有效的荧光光强信号数据，否则返回步骤1）。
有效光强信号数据通过蓝牙传输给安卓手机，安卓APP再上传到网站Web服务端，经处理后可得到荧光波形曲线，其数据分析结果可保存到本地MySQL数据库中。3 ?寻峰算法的实验对比分析
为了验证平移窗口寻峰算法的精确度，本文选择一般多项式拟合法和高斯拟合法作为对比算法，并以高斯拟合法求得的峰位置作为标准值。
本文选取8种CRP浓度不同的校准血样，其CRP浓度分别为0.50 mg/L，1.84 mg/L，3.00 mg/L，9.09 mg/L，18.18 mg/L，72.72 mg/L，145.44 mg/L，205.00 mg/L，每种浓度做3组实验，取其平均值作为实际检测值。各个寻峰算法的寻峰位置检测值如表1所示，其中每一个数据记录中包含两个数字，上面代表[T]峰位置，下面代表[C]峰位置。
根据表1数据，以高斯拟合法求得的结果作为标准，分析计算可得，一般多项式拟合法求得的[T]峰和[C]峰的平均偏差分别是[δ1T=2.25]，[δ1C=2.125]，而平移窗口寻峰算法求得的[T]峰和[C]峰的平均偏差分别是[δ2T=1.125]，[δ2C=1.0]。对比可知，平移窗口寻峰算法的精度相较于一般多项式拟合法，[T]峰精度提升50.0%，[C]峰精度提升52.9%。本文设计的平移窗口寻峰算法的寻峰精确度满足要求。4 ?结 ?语
小型荧光检测设备采用单光路结构、双闭环反馈电路，既保证了设备体积小，也保证了激发光的稳定。针对影响设备检测精度关键之一的寻峰算法，本文采用操作简单的平移窗口寻峰算法，通过初寻[T]峰、截取有效波形段以及再次寻峰等步骤，实现对[T]峰和[C]峰的寻找。对CRP的检测实验结果表明，该寻峰算法的精度介于一般多项式拟合法和高斯拟合法之间，达到了荧光检测设备的设计要求。
参考文献
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[2] 蒋树海，杨发青，崔迎进，等.基于免疫层析的CRP定量检测试剂研制[J].中国生化药物杂志，2014，34（1）：76?78.
JIANG Shuhai， YANG Faqing， CUI Yingjin， et al. Development of a quantitative CRP test with lateral flow method [J]. Chinese journal of biochemical pharmaceutics， 2014， 34（1）： 76?78.
[3] 刘翔，杜民，李玉榕，等.荧光免疫层析定量检测系统的设计与实现[J].电子测量与仪器学报，2013，27（9）：859?866.
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HAN Ping， ZHOU Zude. Feedback relative peak?detection algorithm for high?speed and high?precision grating demodulator [J]. Journal of Wuhan University of Technology （information & management engineering）， 2011， 33（1）： 10?12.
[6] 刘泉，王欢.高速光纤光栅解调的寻峰算法研究[J].武汉理工大学学报，2010，32（6）：59?61.
LIU Quan， WANG Huan. Research on the peak?detection algorithm in the high?frequency demodulation for the fiber Bragg grating [J]. Journal of Wuhan University of Technology， 2010， 32（6）： 59?61.
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[8] 马永杰，云文霞.遗传算法研究进展[J].计算机应用研究，2012，29（4）：1201?1206.
MA Yongjie， YUN Wenxia. Research progress of genetic algorithm [J]. Application research of computers， 2012， 29（4）： 1201?1206.
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[11] 崔泽英，谷青博.LED光源光衰规律研究[J].半导体技术，2012，37（4）：312?315.
CUI Zeying， GU Qingbo. Research on LED light source lumens depreciation rule [J]. Semiconductor technology， 2012， 37（4）： 312?315.
关键词： 荧光免疫层析; C反应蛋白; 寻峰算法; 单光路结构; 双闭环反馈; LED光源
中图分类号： TN247?34; TH776 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文献标识码： A ? ? ? ? ? ? ? ? 文章编号： 1004?373X（2019）03?0148?04
Abstract： A small?sized fluorescence detection device is designed to simply and accurately acquire the location of [T]?peak and [C]?peak in C?reactive protein （CRP） detection， and a window shifting peak?searching algorithm is proposed. This detection device includes the design and optimization of optical path and circuit. The design of single optical path structure can maintain the compact structure and small overall size of the device. The inner current feedback and outer light intensity feedback can make the output light excited by LED stable. The detection experiment results of CRP show that the window shifting peak?searching algorithm has easy operation and high precision， and the obtained location accuracy of [T]?peak and [C]?peak is increased by 50.0% and 52.9% respectively than that of the general polynomial fitting method.
Keywords： fluorescent immune chromatography; C?reactive protein; peak?searching algorithm; single optical path structure; double closed?loop feedback; LED light source0 ?引 ?言
免疫学检验包括定性、半定量、定量等检测模式，前两种模式无需知道精确的待检物质含量。然而，随着社会的发展和医学诊断的完善，定量检测模式的需求日渐增加。荧光免疫层析技术是一种快速定量检测技术，该技术建立在荧光免疫分析技术与免疫层析技术的基础上[1]，可以被运用于血样中C反应蛋白（CRP）[2]浓度的定量检测。荧光免疫层析技术利用荧光物质标记待测抗体或抗原的特异性反应过程[3]，荧光物质在激发光的照射下产生特定波长的荧光，通过光电检测模块采样收集光强信息，并通过处理算法将荧光信号量转换为待检物的浓度信息。
CRP是一种急性时相反应蛋白，对于鉴定感染及多种结缔组织病、判断疾病严重性或活动性等具有十分重要的意義[4]。在CRP检测实验中，向试纸条滴加血样，CRP在[T]线处发生反应，而游离标记物则在[C]线处发生相应反应。使用荧光扫描采样得到荧光光强信号数据，处理该数据之后，可获得具有一定峰特征的波形曲线，其含有2个明显峰，分别反映了[T]线和[C]线处对应荧光标记物的浓度。在一定范围内，[T]峰与[C]峰的峰面积比值[TC]与血样中待测物质的浓度成正相关，这是血样检测的理论基础。计算峰面积比值[TC]主要涉及原始数据的滤波算法和曲线的寻峰算法。而峰面积值比[TC]依赖于峰的具体位置，因此高精度的寻峰算法是保证系统检测精度的关键。
寻峰算法常用的方法有直接比较法、一般多项式拟合法、高斯多项式拟合法、高斯拟合法和优化寻峰算法等。其中直接比较法应用一阶微分，该方法在荧光强度曲线波动较大时寻峰精度较低，并且只适合找孤立峰。一般多项式法选择一般多项式进行拟合，最小二乘法进行判定，该方法简单、易于实现，但是寻峰准确度有限[5]。高斯多项式拟合法对波形曲线进行高斯?多项式变换，该方法的寻峰精度高于一般多项式拟合法，但该方法对波形曲线数据较敏感，抗噪性能差，并且如果波峰不在波形曲线数据内，那么得到的峰值误差会较大[6]。高斯拟合法[7]不经过多项式变换，直接作为Gaussian函数进行拟合处理，得到最佳拟合曲线，进而获得波峰位置。遗传算法[8]、基于径向基函数网络算法及蚁群算法等优化寻峰算法可以改善精确度，但计算复杂，需要较长时间的尝试与训练才能确定各个参数，求解速度慢，因此不适合快速、实时的运算[9]。
本文结合荧光波形曲线的峰特征，提出一种实施简单同时精度较高的平移窗口寻峰算法。接着设计了一种小型荧光检测设备，目的是改善目前市场上相关设备体积大、操作难的现状，其中着重进行了光电检测模块和上下位机软件的设计及优化。最后通过分析比较几种寻峰算法的实验结果，验证本文提出的平移窗口寻峰算法具有一定的应用意义。1 ?平移窗口寻峰算法
经滤波算法处理后，荧光强度波形曲线表现出明显的双峰特征。平移窗口寻峰算法的总体流程如图1所示，通过特定的峰位置可以截取获得有效的数据区域，最后得到峰面积值比[TC]。
1.1 ?初寻[T]峰对多种浓度区间血样进行检测实验时发现，检测带（[T]线）区域和质控带（[C]线）区域的荧光强度，即波形曲线的纵坐标值始终处于较高的水平，并且[T]峰的位置靠前，[C]峰的位置靠后。某次实验的荧光强度波形曲线结果如图2所示。
1.2 ?截取有效波形段及再次寻峰因为[T]峰和[C]峰的位置较为固定，所以得到[T]峰位置后，截取附近的240个采样点作为有效数据区，构成新的荧光波形曲线。截取的目的一是为了减轻后续的数据计算量，二是为了后期能够将荧光波形曲线更加合理完整地展现出来。
现在有效数据区存在明显的、跨度较为合理的双峰特征，再次使用初寻[T]峰时使用的寻峰算法，最高峰和次高峰即为所求的两个峰。其中[T]峰靠前，[C]峰靠后。
1.3 ?确定边界位置及计算峰面积比[TC]
本文根据采样点的微分值确定边界位置。从[T]峰位置向前轮寻，其微分值从大于0.8到小于0.8的点，记为[T]峰的左边界点;从[C]峰位置向后轮寻，其微分值从小于-0.8到大于-0.8的点，记为[C]峰的右边界点;而[T]峰和[C]峰之间最低的点，记为[T]峰的右边界点和[C]峰的左边界点。
确定好边界位置后，采用累加和的思想分别求得[T]峰和[C]峰的面积，两者相除可以获得最终的峰面积比[TC]。2 ?系统设计
为弥补市场上相关检测设备体积过大、操作复杂的缺点，本文设计了一款小型荧光检测设备，整体框架如图3所示。该设备以TI的CC2640芯片作为主控单元，重点设计了光电检测模块和上下位机软件。其中光电检测模块主要包括光路设计和电路设计。
2.1 ?光路设计为减小荧光检测设备的整体体积，本文舍弃了体积占用比大的双通道光路结构，选取了单光路结构。如图4所示是单光路模块示意图，包括反馈PD、检测PD、LED光源、分光片、滤光片及凸透镜等光学元器件。另外，为了减轻杂散光对设备检测的影响，本文设计了光阱结构。
图4中箭头所示为光路的传播路径，当光路选通时，LED光源点亮，发出一定波长范围之间的光，主峰为检测所需的激发光，其波长记为[λ]。发出的光分成两路进行传播：一路作为反馈光路;另一路作为检测光路。反馈光路通过滤光片由反馈PD接收，本文把它作为LED的输出光强反馈信号，将用于后文的双闭环反馈电路中。而检测光路则较为复杂，首先通过滤光片得到带宽较窄、以[λ]为中心波长的激发光谱，接着是两块平行放置的分光片，以[45°]入射角射向第一分光片后，产生的反射光同样以[45°]射入第二分光片，产生的透射光即作为最终的激发光。激发光经由凸透镜聚焦到试纸条的荧光物质上，产生主峰波长为[λf]的荧光，荧光经过凸透镜后由第二分光片反射，产生的反射光通过滤光片后，检测PD接收其中波长为[λf]附近的光，荧光的光强信号由检测PD转化为电信号。2.2 ?电路设计
为改善荧光信号检测的精度，需要保证激发光光强的稳定。而在一定范围内，LED光强与工作电流成线性关系[10]。因此，本文采用较为成熟的光强与电流的双闭环反馈电路，以减轻激发光对荧光检测的影响。LED光源本身随着使用时间的增长，温度会发生变化，发生光衰现象[11]，LED发出的光强减弱。同时，驱动电路自身存在电流波动，LED光强随之产生波动。外闭环依靠光强反馈来调整电流的数值大小，使光强输出达到稳定状态;内闭环依靠电流反馈使驱动电流输出达到稳定状态。
2.3 ?软件设计
小型荧光检测设备的软件部分包含上位机和下位机。上位机包括安卓APP和Java Web服务端，实现了荧光波形曲线的显示、结果的分析与存储等功能。下位机选择的是CC2640芯片，其本质是一块嵌入式ARM芯片，带有A/D可编程放大的功能，主要实现试纸条的推送控制、荧光光强信号的扫描采样以及荧光光强的数据传输等功能。
该设备忽略暗电流的影响，直接进入检测流程。血样首先在试纸条上完成层析反应，接着传送装置推送试纸条匀速通过光电检测模块，完成扫描采样最终得到荧光波形曲线。荧光光强信号的扫描采样流程如图5所示。
設备进行初始化后，扫描采样分三步完成：1） 预采样，荧光光强信号由检测PD转换为电压量，经A/D转换可得到数字量，通道增益选择默认值;
2） 调整增益，根据满量程的数字量和预采样得到的数字量，调整增益的大小，保证再采样得到的数字量比满量程的数字量大于0.5，假如两者比值偏小，那么需调大增益来提高分辨率;
3） 再采样，增益值调整之后得到更准确的荧光光强信号并记录数值大小。判断采样点数是否达到目标采样点数，若已达到，则停止采样，将其作为有效的荧光光强信号数据，否则返回步骤1）。
有效光强信号数据通过蓝牙传输给安卓手机，安卓APP再上传到网站Web服务端，经处理后可得到荧光波形曲线，其数据分析结果可保存到本地MySQL数据库中。3 ?寻峰算法的实验对比分析
为了验证平移窗口寻峰算法的精确度，本文选择一般多项式拟合法和高斯拟合法作为对比算法，并以高斯拟合法求得的峰位置作为标准值。
本文选取8种CRP浓度不同的校准血样，其CRP浓度分别为0.50 mg/L，1.84 mg/L，3.00 mg/L，9.09 mg/L，18.18 mg/L，72.72 mg/L，145.44 mg/L，205.00 mg/L，每种浓度做3组实验，取其平均值作为实际检测值。各个寻峰算法的寻峰位置检测值如表1所示，其中每一个数据记录中包含两个数字，上面代表[T]峰位置，下面代表[C]峰位置。
根据表1数据，以高斯拟合法求得的结果作为标准，分析计算可得，一般多项式拟合法求得的[T]峰和[C]峰的平均偏差分别是[δ1T=2.25]，[δ1C=2.125]，而平移窗口寻峰算法求得的[T]峰和[C]峰的平均偏差分别是[δ2T=1.125]，[δ2C=1.0]。对比可知，平移窗口寻峰算法的精度相较于一般多项式拟合法，[T]峰精度提升50.0%，[C]峰精度提升52.9%。本文设计的平移窗口寻峰算法的寻峰精确度满足要求。4 ?结 ?语小型荧光检测设备采用单光路结构、双闭环反馈电路，既保证了设备体积小，也保证了激发光的稳定。针对影响设备检测精度关键之一的寻峰算法，本文采用操作简单的平移窗口寻峰算法，通过初寻[T]峰、截取有效波形段以及再次寻峰等步骤，实现对[T]峰和[C]峰的寻找。对CRP的检测实验结果表明，该寻峰算法的精度介于一般多项式拟合法和高斯拟合法之间，达到了荧光检测设备的设计要求。
参考文献
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