动物钙蛋白酶系统的研究进展

    姚慧

    摘要：钙蛋白酶系统在动物体内的各组织细胞中普遍表达，主要由钙蛋白酶（Calpains，CAPN）、钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastain，CAST） 和骨骼肌特异性钙蛋白酶（Muscle specific calpain，P94）组成。对动物体屠宰后的肌肉僵嫩程度有着重要作用。对CAPN和CAST的结构、功能、研究进展做了阐述和分析。

    关键词：钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）；钙蛋白酶（CAPN）；结构；功能

    中图分类号：S858.3 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2014）02-0081-04

    钙蛋白酶系统在生物体内的各组织中广泛表达，主要由钙蛋白酶（Calpains，CAPN）、钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastain，CATS）和骨骼肌特异性钙蛋白酶（Muscle specific calpain，P94）组成，其参与动物肌肉生长、细胞信号转导、神经发育等生理活动。另有研究表明钙蛋白酶Ⅰ及钙蛋白酶抑制蛋白在动物屠宰后的肌肉嫩化中发挥重要作用。目前，CAPN1及CAST已被认为是影响动物肌肉嫩化过程的重要候选基因。近年来，随着人们生活水平的日益提高，对肉类质量的要求越来越高，其中肉质细嫩就是一个重要的标准。随着分子生物学的不断发展，对于钙蛋白酶系统的研究已经进入了分子领域，可以从微观领域更清晰的了解其的结构，功能以及研究进展。

    1 钙蛋白酶（CAPN）

    1.1 CAPN同工酶种类

    目前在动物体内已经发现了15种钙蛋白酶同工酶，根据其在机体内的存在位置可以分为无组织特异性蛋白酶和组织特异性蛋白酶两种。Calpain1、2、4、5、7、10、12、13a、14和15为无组织特异性蛋白酶；Calpain3、6、8a、9、11（也称CAPN10）为组织特异性蛋白酶，分别在骨骼肌、胎盘、胃和黏膜、消化道、睾丸中对应表达，其中Calpain1和Calpain2研究得最为深入。

    Goll 等[1]发现在这15种钙蛋白酶中Calpain1、2、3、8、9、11 和12拥有钙蛋白酶典型的4个结构域（从氨基端到羧基端依次为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），Calpain5、6、7、10和15的结构中则缺少第Ⅳ结构域。因此又可以根据是否拥有典型的结构域将其划分为典型和非典型钙蛋白酶。

    1.2 CAPN的结构

    钙蛋白酶（Calpain）是一类在生物细胞中普遍表达，依赖于钙激活的中性半胱氨酸巯基内肽酶，主要存在于细胞质中，根据激活其活性所需要的钙离子浓度可以分为μ- Calpain（激活的Ca2+浓度以微摩尔计量，CAPN1）和m-Calpain（激活的Ca2+以毫摩尔计量，CAPN2），主要分布在肌原纤维Z盘附近。CAPN1和CAPN2都是不均一的二聚体蛋白，由一个分子质量为80 ku的大亚基和一个分子质量为30 ku的小亚基组成，小亚基是单基因的产物而大亚基则是不同基因的产物，发生自溶时80 ku的大亚基降解为76 ku，30 ku的小亚基降解为17 ku。

    通过克隆CAPN1的cDNA序列分析发现其大亚基由4个结构域组成，约含700个氨基酸残基，具有催化活性；小亚基由两个结构域组成，具有调节功能。典型的钙蛋白酶大亚基4个结构域中，位于N端的结构域Ⅰ，由19个氨基酸残基组成，约占氨基酸残基数的10%，在钙蛋白酶激活状态下或激活前易发生自溶现象，具有活性调节作用；结构域Ⅱ，约占氨基酸残基数的35%，是表现水解活性的关键区域，其催化活性中心主要由105位的半胱氨酸，262位的组氨酸以及286位的天冬酰胺残基组成，104 位天冬氨酸和 287 位脯氨酸在已知的 CAPN 中相同，属高度保守区域，由于钙蛋白酶是由钙调蛋白和木瓜蛋白酶以非共价键嵌合而成，因此其与木瓜蛋白酶、组织蛋白酶有一定的水解相似性；结构域Ⅲ，含有磷酸化位点和磷脂结合域，主要发挥钙蛋白酶的活性调节作用，约占氨基酸残基数的35%。位于C端的结构域Ⅳ，是钙结合区域，含有钙结合蛋白特有的4个EF-手结构，与其他钙结合蛋白如CaM（钙调素蛋白）有明显的相似性。钙蛋白酶小亚基也含有两个结构域，与大亚基类似，其也有4个EF-手结构，故也具有结合钙的活性。

    CAPN2与CAPN1一样，由一分子80 ku的大亚基和一分子30 ku的小亚基组成。两者大亚基的氨基酸序列存有差异而小亚基相同，大亚基同样有四个结构域，但是只有结构域Ⅱ是两种同工酶氨基酸重复序列高的区域，结构域Ⅱ是CAPN2的半胱氨酸蛋白酶活性区域，由半胱氨酸、组氨酸、天门冬酞胺构成活性中心。结构域I可能与钙蛋白酶自我水解有关，参与钙蛋白酶的活性调节，结构域Ⅲ由于与其他蛋白质氨基酸序列相似性甚低，功能至今尚未明确。

    根据GenBank上发布的序列可知，人的CAPN1基因位于11号染色体上，落于BTA29 的 QIL 区间，由22个外显子和21个内含子组成；猪 CAPN1 基因位于 15q23-26，CAPN1A 的 cDNA 开放读码框架约 2 142bp；鸡 CAPN1 和 CANP2基因均位于3号染色体上，长度分别为3 381 bp和2 732 bp，均由21个外显子和 20 个内含子构成，内含子远大于外显子，外显子的长短直接影响基因表达产物的结构和功能，内含子是基因中的非编码区，不经过转录翻译但是有研究表明，其在基因的表达调控中起着重要作用。研究表明，不同物种间CAPN1基因的核苷酸序列存在差异。禽类同哺乳动物之间同源性较低，如鸡与牛CAPN1基因mRNA序列同源性分别为53.62%， 翻译成氨基酸后同源性为88.69%；牛CAPN1基因cDNA序列全长2 948 bp，与人的同源性达91%。

    1.3 CAPN作用机理

    肌肉中肌原纤维的降解才是导致肌肉嫩化的主要原因，参与动物宰后肌肉嫩化的酶需具有位于骨骼肌细胞内、与肌原纤维接触、能降解成熟过程中发生降解的三大特征。通过研究发现3种具降解蛋白能力的酶：溶酶体组织蛋白酶、多催化蛋白酶复合体和CAPN1。只有CAPN1能满足动物宰后发挥蛋白降解的酶具有的特征，在肌原纤维更新和宰后嫩化中扮演重要角色。

    CAPN1和CAPN2都能水解肌原纤维，其活性下降是其发挥水解作用的体现，但在研究发现动物死后肉成熟嫩化的过程中m-calpain（CAPN2）的活性几乎不变，而μ-calpain（CAPN1）的活性则显著下降，因此人们普遍的认为CAPN1是参与肉嫩化的主要酶。CAPN1降解肌原纤维的过程大致如下，CAPN1被激活后首先开始降解N2线的连接蛋白（Titin）和半肌动蛋白（Nebulin），导致维肌原纤维I带与Z盘之间的结合变弱或断裂，从而使肌纤维释放出肌丝降解为小片段，释放出的肌丝小片段被细胞溶酶体捕获再进一步降解。

    1.4 活性调节

    CAPN1的活性受到CAST、钙蛋白酶激活蛋白、Ca2+、底物浓度、pH等因素的调节。当Ca2+浓度增高， CAPN1活性增加；随着离子强度增加CAPN2和CAPN1的水解活性降低， 但不明显；随着pH的增加，CAPN1水解活性增加；底物存在时， CAPN1的活性下降的慢，且不同底物作用下CAPN1的活性表现会有所不同。Yoshizawa等[2]发现，CAPN1被Ca2+激活后大小亚基分离，且小亚基迅速降解为17 ku，为水解提供前提调节。大亚基最终降解为76 ku，表现出蛋白水解酶活性。因此认为大亚基起催化的作用，小亚基具调节作用。CAPN1在体内活性的表达主要通过钙离子浓度的增加和自溶两种途径，并由钙蛋白酶抑制蛋白调节。Ca2+浓度的提高激活CAPN1，使之构象发生变化发挥酶活性，当其发挥活性的同时周围存在的CAST可迅速与之结合，防止其被随机激活而只对底物特定位点进行水解，保证了钙蛋白酶作用的特异性。而令人一直困惑的问题是，钙蛋白酶在活体细胞中是如何发挥作用的。在活体动物中，大部分的Ca2+都存在于肌浆网中，细胞内的Ca2+浓度仅为0.2～0.8 μmol/L，达不到激活CAPN1的浓度。随着磷酯酰丝氨酸和磷酯酰肌醇这两种能降低CAPN1激活所需Ca2+浓度的物质被发现后，推测活体中是否存在钙蛋白酶激活蛋白，可提高钙蛋白酶对Ca2+的亲合力， 大大降低钙蛋白酶激活所需的Ca2+浓度。动物死后，失去了束缚Ca2+的能力，肌浆网中的钙离子成为游离状态从而达到激活CAPN1的浓度，并随着Ca2+浓度的增加CAPN1的活性逐渐增强。

    另外，通过对氨基酸末端序列测定发现导致蛋白酶对Ca2+敏感性变化的酶切部位均为蛋白质的氨基末端，而非梭基端的钙结合区域[3，4]。钙蛋白酶自我消化水解具有重要生物学意义，活体细胞内Ca2+水平较低，无法达到激活CAPN2的Ca2+浓度，若通过一瞬局部过性Ca2+浓度的上升促使酶激活而发生自我消化，从而降低酶自身对Ca2+的依赖性并激活更多的钙蛋白酶，则可在正常的细胞微环境下发挥酶自身的生物学效应，意义颇深。

    2 钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）

    2.1 CAST的结构

    钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）是一种存在于细胞内的专一性抑制钙蛋白酶（CAPN）的蛋白质，其同样需要Ca2+激活才具有活性。肌肉组织中Calpastatin的分子质量约为77 ku，斯托克半径为6.8 nm包括很少的a螺旋，以随机的卷曲结构存在。1964年钙蛋白酶抑制蛋白被正式认定为钙蛋白酶系统的成员，1979年被正式命名为钙蛋白酶抑制酶，1987年钙蛋白酶抑制蛋白首先被克隆出cDNA。到目前为止，已经有几种不同的哺乳动物（牛、兔、猪、人等）的不同组织中CAST的cDNA被成功地克隆与测序[5]，通过比较不同物种的cDNA发现其保守性较差，但均有5个结构域[6]（图2）。

    从N端起始至C端依次为L、I、II、III、IV结构域[7]，L结构域富含碱性氨基酸，在某些细胞（如血红细胞）的CSAT中是不存在的，其功能至今也不甚清楚，可能与膜结合有关也可能具有其他多种生物功能。I到IV结构域结构和组成几乎相同，具有相似重复单位，都是由140个氨基酸组成，不同重复单位的氨基酸残基同源性达20%～35%，结构域内都有A、B、C 3个保守区。经研究发现保守区A、C是决定CAST中CaM结构的结合区域，保守区B可能是CSAT表达抑制作用的关键区域，其大约由30个氨基酸组成，其中由Thr-Ine-Pro-Pro-X-Tyr-Axg组成的七肽序列十分保守，X代表不同的氨基酸。通过在大肠杆菌中的基因重组试验发现，只要含有此段序列，即使多肽片段少至30个氨基酸残基也能发挥CSAT的抑制作用。根据不同哺乳动物CSAT基因cDNA片段中N末端编码区的不同，可以将CAST分成四种类型：I型、II型、III型、IV型。鼠的CAST是I型、牛的是II型、人和猪的是III型，I型和II型相对于III型有着较长的L区，IV型则是从II一部分开始就要一个不同的N末端序列。

    Killefer等[8]将牛的CAST基因的cDNA序列全部克隆并定位于7号染色体，其包含31个内含子和30个外显子；根据GenBank上的序列，鸡的CAST基因位于2号染色体，该基因的mRNA序列长为3 551 bp，由31个外显子和30个内含子构成，内含子远远大于外显子；猪的CAST基因位于2号染色体2q2.1-q2.4区段，且研究发现不同品种的猪CAST 基因位点存在MspI和RsaI-RFLP， 因此认为CAST基因可能是肌蛋白积累和肉质的一个候选基因，且此位点可能位于CAST基因内含子内，不过目前还无法查到其内含子序列。

    2.2 CSAT的作用机理与基因的变异

    CAST是细胞内专一性抑制CAPN活性的蛋白，当CAPN与Ca2+结合导致自身构象发生变化时，附近的CAST能迅速的与之结合抑制CAPN的活性以确保钙蛋白酶对底物的特定位点进行水解，但是这种抑制作用是可逆的，当无钙离子时自动解除抑制作用，对CAPN活性的调节具有很重要的意义[9]。钙蛋白酶参与的水解蛋白系统在哺乳动物中广泛存在，甚至于骨骼肌的生长都与CAST有关系。研究表明，在猪、牛、羊三者的肌肉中，猪肉中的CAST活性最低；瘦肉型猪和肥肉型猪比较则是瘦肉型的猪CAST活性较低。CAST抑制CAPN的过程大致为：①当CAPN被Ca2+激活后，CAST的I型至IV型结构域中的A、C保守区与CAPN紧密结合；②CAST中的B保守区中的七肽片段发挥其抑制作用；③破坏CAPN的空间构象，使CAPN无法发挥水解功能。因此，动物宰后肉嫩度的提高可以通过激活CAPN或者抑制CAST的表达及活性达到。

    CAST基因保守性差，在不同物种与不同组织器官中的表达差异性十分明显，如牛肌肉中的CAST基因在primer中有很多不同的酶可以切开，而酶切位点不同，肌肉的嫩度也会不同。CAST基因表达产物还因物种不同、检测条件不同、检测方法不同而产生差异。因此，CAST基因是与肉质嫩度相关性极高的一个候选基因。

    2.3 骨骼肌特异性钙蛋白酶（P94）

    P94是骨骼肌特异性钙蛋白酶（CAPN3），最早是在1989年克隆出其cDNA，属典型的组织特异性钙蛋白酶，只在骨骼肌中表达，具有高度的表达特异性。P94仅由一个大亚基组成，与CAPN1和CAPN2大亚基同源性高，其基因中存在3个与自我消化、酶寿命和肌联蛋白结合有关的特有插入序列，即NS、ISI和IS2（图3），且P94虽然有钙蛋白酶的经典钙结合区，但其活性的表现为非钙依赖性。人体中如果缺乏P94就会导致2A型肌肉营养失调症[10]，此病症的特点就是蛋白质过度异化。所以尽管对P94的研究还不是很清晰，但是其和肌肉纤维的降解代谢活动是密切相关的。根据GenBank上发布的序列，鸡的CAPN3基因位于5号染色体，该基因的mRNA序列长为3 454 bp（登录号：XM_21157），由24个外显子和23个内含子构成，内含子远远大于外显子。

    大量研究表明，钙激活酶是在活体肌肉组织内导致肌纤维蛋白降解的主要原因，Page等[11]、Casas等[12]、White等[13]通过对安格斯牛、婆罗门牛已经其杂交牛的实验找到了与肌肉的嫩度有关的两个突变位点（即Glu变为Ala（316）、I1e变为Val（530）），造成氨基酸序列发生变异，说明CAPN1基因可以作为牛嫩度的候选基因；Barendse等[14]通过对牛CAST基因进行SNPs扫描，获得不同的多态性位点，发现CAST基因与牛肉嫩度显著相关。Ilian.M.A等研究发现除CAPN1与肉嫩度有关外，肌肉组织特异表达p94对肉嫩度影响也很大，其mRNA水平与肌肉的相对嫩度具有高度相关性[15]也是宰后肌肉成熟过程中肌原纤维降解的主要因素；Melissa等[16]验证了CAPN3基因在骨骼肌中的表达量是受到限制的。费春红等[17]通过对牦牛CAPN1基因的克隆和测序发现，牦牛和普通牛的该基因极其相似；刘博洋等[18]通过实时荧光定量的方法验证了CAPN3在中国草原红牛肌肉、心、脾等多种组织中均有表达，且脾脏内的表达量与其他组织差异极显著。研究表明，CAPN3在禽类和哺乳动物中均有表达，但是其mRNA的同源性较低如鸡与牛和鼠的序列同源性分别为37%、58.51%；杨秀芹等[19]成功的克隆了野猪CAPN7基因，证实了其具有同其他钙蛋白酶一样的蛋白降解能力，并进一步用半定量RT-PCR的方法证实了CAPN7基因在野猪不同组织中的表达差异。

    另有研究表明，钙蛋白酶系统不仅与死后动物的肌肉嫩化有关系，也参与人体的许多生理过程如葡萄糖转运、细胞信号转导等。当机体发生某些病变时，相应的钙蛋白酶表达量也会发生变化。人们已经开始研究出钙蛋白酶与某些胰岛素抵抗相关疾病具有一定的相关性，如，CAPN10与2型糖尿病、高血压、多囊卵巢综合征、肥胖症等的发生均具有相关性，且因种族的差异[20]相关性也具有一定的差异。

    3 研究钙蛋白酶系统的实际意义

    3.1 遗传育种

    CAPN和CAST已经被认定为动物肌肉嫩化的候选基因。随着分子生物学技术的发展，可以利用辅助标记选择育种（MAS）技术，以CAPN和CAST基因作为肉质嫩度的分子标记，生产出嫩度较好且安全的畜禽肉产品，也可以利用重组DNA技术，超表达钙蛋白酶抑制蛋白，从而达到控制肌原纤维降解，加快蛋白质沉积的目的。从遗传分子的角度出发，为培养符合大众口味要求的，高品质的肉类食品找到了一个较好的方向，避免了传统育种方法耗资大，费时长的缺点。

    3.2 医疗贡献

    钙蛋白酶系统不仅与遗传育种有着紧密的联系，还在机体的生理过程中扮演重要角色，钙蛋白酶及其抑制剂的生物学特性、可能的生理功能、作用与病理机制等在医学界都有是非重要的地位。在正常生理状态时，CAPN与CAST保存平衡，对细胞的结构及功能的维持起着重要的作用。钙蛋白酶参与了系列的生理活动，如血小板的聚合，裂解许多膜蛋白和膜相关的蛋白，修饰受体蛋白和细胞骨架蛋白等。当钙蛋白酶表达过度时，由于细胞内蛋白和酶的大量降解，机体会发生如脑缺血、脱髓鞘性疾病、创伤性脑损伤、糖尿病、脊髓损伤、白内障等一系列的疾病。钙蛋白酶系统还与机体的生长和正常代谢活动如，细胞周期的调节、细胞间的信号转导和凋亡过程、成肌细胞的融合等有关。研究发现，当机体发生相关病变的时候，钙蛋白酶系统在体内的含量也会相应变化，这就为临床的医疗工作提供了研究的依据，有很大的意义。

    3.3 生物进化的依据

    钙蛋白酶系统在各个动物种类中普遍存在，但其因物种的不同表达也有差异，可通过研究钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白的突变位点来寻找相关遗传信息，如家禽与家畜之间的同源性就较低，因此遗传工作者可以根据该系统在各动物种类间的同源性来确定彼此间的进化关系远近，因而可以作为生物进化的依据。

    4 小结

    自1964年Guroff首次分离钙蛋白酶后，对钙蛋白酶系统的研究就经久不衰。目前虽然对钙蛋白酶系统的结构和一些作用机制等有了（下转第 86 页）（上接第 84 页）

    一定的了解，但是对具体的机制还停留在推测的阶段，没有充分的实际证据。主要的研究集中在分子克隆、酶切和蛋白质结构等方面，研究范围有一定的局限性。对于遗传育种还停留在理论阶段，并未投入实践。关于钙蛋白酶系统在治疗人类疾病中的研究也越来越受到人们的重视，但是在实际治疗中还面临一些困难，如，治疗参数的确定、药物产生的副作用和给药方式等，都还需研究加以确定。因此，还需进一步加强钙蛋白酶系统在分子领域的研究工作，将理论落实到实际中来，才能真正的发挥其作用。

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