绿色荧光蛋白（GFP）标记的尖孢镰刀菌在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖

2022.06.25

吕桂云郭绍贵张海英耿丽华许勇

目的与意义：西瓜枯萎病是由半知菌亚门镰孢属尖孢镰刀菌寄生引起的一种真菌土传病害，是世界范围内导致西瓜产量和品质降低的最严重病害。明确枯萎病菌与寄主植物之间的互作机制，揭示其相互作用的分子机制，可为西瓜抗枯萎病育种和病害防治奠定理论基础。利用绿色荧光蛋白（GFP）作为标记，研究枯萎病菌在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖动态，从组织学的角度来阐释西瓜与枯萎病菌亲和互作和非亲和互作的差异。

材料与方法：1.以农杆菌AGL1为介导，将带有潮霉素抗性基因pCH-sGFP质粒转化到西瓜枯萎病菌中，成功获得了能稳定持续表达绿色荧光蛋白的枯萎病菌的突变株BEIJING1-sGFP，对转化子进行抗性鉴定表明，组成型表达sGFP的BEIJING1- sGFP不影响枯萎病菌的致病力。2.以抗病品种‘PI 296341-FR（PI）与感病品种‘Black Diamond （BD）为试验材料，种子消毒后催芽，采用浸根法接种病菌。3.在接种后的 6 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d 、8 d取样进行激光共聚焦显微镜观察。

结果与分析：从西瓜枯萎病菌GFP转化株中选出致病力与转化前的野生型FON1在西瓜抗、感鉴别寄主上的表现无明显差异菌株命名为BEIJING1- sGFP，继代培养后的菌体都有稳定而强的荧光信号，但在细胞质中的液泡无荧光信号。通过人工接种，在无菌条件下进行致病力的检测，BEIJING1- sGFP与转化前的野生型FON1在西瓜抗、感鉴别寄主上的表现无明显差异，说明GFP的转化和表达对枯萎病菌的转化株的致病力无明显影响。

用激光共聚焦显微镜观测GFP标记的西瓜枯萎病菌侵染西瓜感病品种‘Black Diamond过程。在接种6 h后，仅有少量孢子开始萌发（<5%），孢子从一端伸出形成芽管;在1 dpi附着在根系表面的孢子大部分都已经萌发，形成一个长芽管，芽管可向各个方向生长，菌丝在根表生长，随处可见。试验观察发现，菌丝主要出现在根毛区域，菌丝最初黏附在根毛上，然后到达根毛区的根系表面。在接种后2 d，菌丝已经开始侵入了根部的表皮细胞。在渗透位点，呈现为比较重的绿色，菌丝形成类似附着胞的侵染结构，有的菌丝可以形成多个这样的侵入结构，一些孢子在萌发后，很快就形成附着胞，也有的先在根系表面形成菌丝的网络结构。

接种后3～4 d，在几个观察点上，菌丝主要沿着根系的纵轴伸长，或与根毛松松的交织在一起，到第4天根表已经被相互交织的菌丝稀稀疏疏或稠密的包围，菌丝已经扩展到了更大的面积，菌丝沿着表皮细胞的凹槽或者在细胞间隙间生长，在细胞周边形成一个绿色荧光框。在接种后5～6 d，在维管中发现了菌丝生长，在维管周围皮层细胞中的间隙也有大量的菌丝形成的网状结构，说明菌丝已经侵入了皮层细胞和维管束。在5 dpi，根系严重被感染，根表菌丝已形成网络结构，仅有根尖部位还保持没有被感染，菌丝已经到达了中柱螺纹维管处，并沿着木质部生长延伸。接种后第7天到第8天，一些最早定殖的菌丝开始产孢，形成分生孢子，分生孢子继续萌发，形成再侵染;在根系三级和二级的侧根上，菌丝网络已经紧紧包围了根系表面的大部分地方，并且侵染的范围已经扩展到了根尖，在部分小的侧根，菌丝完全定殖在根部组织中，并将其原有的结构完全破坏，从显微观察看，根表完全被菌丝覆盖，感染的根系组织已经瓦解，菌丝充满所有的组织空隙，并包围根系的表面。

在抗病品種中，在接种后前3 d与感病品种没有明显差异，在第4～5天在抗病品种的根系表面形成的菌丝网络结构没有感病品种那么密集和明显，在抗病品种只是形成零星的网络结构，尤其是在主根上。在抗病品种也只能看到菌丝零星侵入到皮层细胞，抗病品种的侵染相对于感病品种是相对滞后的。菌丝形成的分生孢子没有大量再萌发的迹象，菌丝也能侵入根尖区域。侵染的程度也相对较轻，抗病品种与感病品种没有质的区别，只是量的区别和时序上的差异。但在抗病品种中侧根中，与感病品种差异不大，根表也形成稠密的菌丝网络，菌丝能侵入皮层，根系的组织结构也发生瓦解。寄主产生某种物质，规避病原菌侵染主根，或由侧根的维管进入主根的维管部位。此外，西瓜抗枯萎病不是抗侵入，而是抗扩张，再次形成的孢子没有大量萌发的迹象，而在感病品种中，形成的孢子，随即萌发开始新的世代。

枯萎病菌能从自然开口处（如侧生根发生处）和伤口处（如细胞壁破碎的表皮细胞和创伤处）侵染西瓜根系。通过PI染色，发现菌丝。侵入的细胞内有雾状的红色，说明此细胞壁已经破碎，染料PI已经渗入表皮细胞。在接种后3 d，菌丝就能通过伤口直接侵入维管组织，并迅速在维管内延伸。菌丝可以在正常的根系表面，通过在侵入位点形成类似附着胞的侵入结构，直接侵入表皮细胞。此结果验证枯萎病菌是通过自然开口如细胞之间的缝隙、表皮的凹陷部位和次生根毛的基部和伤口进入植物的，但伤口也不是其侵染的必要条件，它也可以直接侵染。

结? ? 论：利用激光共聚焦显微镜观察病原菌在西瓜根系的附着、侵染和定殖等过程。根系表面的孢子在接种当天就开始萌发，菌丝沿着根系表面的纵轴方向伸长，在内部是沿着细胞间隙或细胞间的凹槽生长，菌丝在接种后的第5天就能达到维管束，在侵染后期，产生的分生孢子能再次萌发，形成二次侵染和侵染的继续扩张，最后菌丝完全充满根系组织，并伴随根系组织的瓦解完成其定殖的过程。病原菌在抗、感品种的侧根侵染中，基本无差异，但在抗病西瓜品种主根的侵染中与感病品种存在差异，再生的孢子不萌发，侵染过程滞后，侵染程度比较轻，说明西瓜的抗病表现在抗定殖，而不是抗侵入。根系的自然开口和伤口是病原菌优先侵染的位点，但不是枯萎病菌侵染根系所必须的，病菌可以通过形成类似附着胞的侵染结构直接侵入根系表皮的细胞。