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标题

芪术抗癌方对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

范文

冯文杏　周小舟　韩志毅　孙新锋　马文峰　张卫

摘要目的：探讨芪术抗癌方对肝癌HepG2细胞增殖与凋亡的调控作用。方法：体外培养HepG2细胞，加入不同浓度芪术抗癌方（0，250，500，1 000 mg/L）处理48 h。采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）检测细胞活力，采用免疫印记法检测凋亡相关蛋白c-Caspase-3和c-Caspase-9表达变化。结果：CCK-8结果显示芪术抗癌方可呈浓度依赖性抑制HepG2细胞增殖，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），1 000 mg/L组抑制效果最好，芪术抗癌方刺激HepG2细胞后，凋亡相关蛋白c-Caspase3及c-Caspase9表达增加，呈浓度依赖性，在1 000 mg/L组达到最高且差异有统计学意义（c-Caspase3增加1.83倍，P<0.05;c-Caspase9增加1.06倍，P<0.05）。结论：芪术抗癌方可抑制肝癌HepG2细胞增殖并诱导细胞凋亡。

关键词芪术抗癌方;肝癌;HepG2细胞;增殖;凋亡;Caspase-3;Caspase-9;机制研究

Abstract Objective：To study the effects of Qizhu Kangai Formula on the proliferation and apoptosis of HepG2 heptoma cells of liver cancer.Methods：The HepG2 cells were cultured in vitro and treated with different concentration of Qizhu Kangai Formula （0，250，500，1 000 mg/L ） for 48 h.The living cells were detected by cell counting kit 8 （ CCK8 ） and the protein expression of c-caspase3 and c-caspase9 were observed by Western-blot.Results：CCK8 showed that Qizhu Kangai Formula could inhibit HepG2 cells proliferation in concentration-dependent manner and had significant differences with the control group （P<0.05）.Among them，the 1000 mg/L group had the best inhibition effects.Further studies found that the expression of the apoptotic proteins c-caspase3 and c-caspase9 increased after the stimulating HepG2 cells by Qizhu Kangai Formula and was concentration-dependent and was highest in the 1000 mg/L group with statistical significance （ c-caspase3 increased 1.83 times，P<0.05; c-caspase9 increases by 1.06 times，P<0.05 ）.Conclusion：Qizhu Kangai Formula could inhibit the proliferation and induce apoptosis of HepG2 heptoma cells.

Keywords Qizhu Kangai Formula ; Liver cancer; HepG2 cells; Proliferation; Apoptosis; Caspase-3; Caspase-9; Mechanism research

中图分类号：R289.5;R735.7文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.015

据流行病学研究显示，肝癌是世界第6大最常见恶性肿瘤和第2位癌症相关死亡原因[1-2]，其发病隐匿，很多患者到晚期才诊断，仅仅1/3的新确诊患者适合治愈性治疗[3]，终晚期患者是不可治疗的且大多数生存期为3～6个月[4]，多激酶抑制剂索拉菲尼是美国食品药品管理局（FDA）唯一批准的系统治疗晚期肝癌药物，可以延长生存期3个月[5]。中医药在肝癌综合治疗中显示了好的疗效[6]，能增效减毒。周小舟教授总结多年临床经验，基于郭振球教授抗纤灵方的基础上，创立芪术抗癌方，能明显提高原发性肝癌患者的生命质量及延长生存期[7]，但具体作用机制尚不明确。本研究采用CCK8法和免疫印迹法探索芪术抗癌方在体外对肝癌HepG2细胞增殖与凋亡调控的作用，从而为其临床应用提供一些理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株人肝癌细胞株HepG2购于武汉博士德公司（批号：20161209）。细胞培养用含10%FBS+1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养，置于37 ℃細胞培养箱中（95%湿度，5%CO2）。每1～2天换液1次。细胞生长融合至80%～90%时用0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）溶液消化、传代。

1.1.2 药物芪术抗癌方冻干粉，芪术抗癌方（柴胡6 g、白芍10 g、鸡内金10 g、莪术10 g、黄芪10 g、炙甘草5 g、炒白术15 g），药物浸泡1 h，用8倍的蒸馏水煎煮2次，过滤煎液，12 000×g离心2次，每次30 min，取上清液冻干，密封储存于-20 ℃冰箱（深圳市中医院制剂科制备）。

芪术抗癌方浸提液制备：无菌离心管中用DMEM培养液充分溶解，0.22 μm微孔滤器过滤，得到浓度为1 000 mg/L的母液，DMEM稀释分别获得其他500 mg/L和250 mg/L浓度使用。浸提液均现配现用。

1.1.3 试剂与仪器超净工作台（美国ESCO公司，型号：ACB-4E1）;CO2培养箱（美国Thermo Scientific公司，型号：BBD6220）;全自动凝胶成像和化学发光图像分析系统（美国Bio-Rad公司，型号：ChemiDoc TMMP）;垂直电泳仪、转膜仪（美国Bio-Rad公司，型号：1658003）;酶标仪（美国BioTek公司，型号：synergy2）。CCK8检测试剂盒（日本DojinDo公司，货号：CK04），c-Caspase-3一抗（英国Bioss，货号：Bs-0081R）、β-actin一抗（Sigma，货号：MAB1501）、c-caspase9一抗（英国Abcam公司，货号：Ab202068）和鼠兔二抗（CST，货号：7076P2、7074P2）。

1.2 方法

1.2.1 分组分为对照组和芪术抗癌方浓度分别为250，500，1 000 mg/L组4组。

1.2.2 干预对照组细胞予以DMEM培养，芪术抗癌方组的细胞予以相应浓度浸提液干预。

1.2.3 检测指标与方法

CCK8法检测细胞活性：将指数生长的HepG2按1×106/孔接种在96孔板，置于37 ℃细胞培养箱中（95%湿度，5%CO2），24 h后弃去培养基。按1.2.1和1.2.2分组及干预，每孔200 μL，每组设10个复孔。培养箱中培养48 h后，弃去培养液，每孔加入10 μLCCK8试剂，放入培养箱培养1 h后，用酶标仪测定450 nm波长时各孔A值。

免疫印迹法检测c-Caspase-3、c-Caspase-9蛋白表达：HepG2细胞分组给药培养48 h后，吸除培养液，培养皿置于冰上，PBS洗2次，加入1×细胞裂解液120 μL/皿覆盖均匀，摇床上裂解 10 min。用细胞刮刮下细胞蛋白并移入预冷的1.5 mL EP管中，离心（4 ℃，12 000×g，10 min）后将上清转入另-1.5 mL EP管。采用Bradford法测蛋白浓度并配平。100 ℃水浴10 min变性，离心后于-80 ℃冰箱保存备用。将等量蛋白进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉室温封闭60 min、孵对应一抗、二抗曝光显影、图像分析。采用Image-Lab软件（美国Bio-Rad公司）进行电泳条带灰度值分析，其结果以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）灰度值的比值表示。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间差异进行单因素方差分析，并进行两两比较，方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Games-Howell检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芪术抗癌方对HepG2细胞增殖的影响

抗癌方處理HepG2细胞48 h后，随着药物浓度的增加，肝癌细胞成活率逐渐下降。抗癌方对HepG2细胞增殖抑制呈浓度依赖性，浓度升高，抑制效果更加明显。与对照组比较，250 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L组差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.2 芪术抗癌方对HepG2凋亡的影响

不同浓度芪术抗癌方刺激HepG2细胞48 h均可增加凋亡相关蛋白c-Caspase-3、c-Caspase-9的表达，且呈药物浓度依赖性增加。与对照组比较，浓度为1 000 mg/L时c-Caspase-3、c-Caspase-9蛋白表达分别增加1.83倍、1.06倍，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

3 讨论

周小舟教授认为肝癌的主要病因是正气不足与外感疫毒相互作用所致，结合现代医学，即HBV、HCV、过度饮酒等病原因素与机体免疫失调的综合结果[8]。通过临床调查发现肝癌的主要证型是气虚血瘀[9]，针对此病机，芪术抗癌方以扶正祛瘀为原则，方中黄芪、党参、白术、山药等健脾益气，莪术活血化瘀，鸡内金软坚散结，白花蛇舌草清邪毒。全方扶正为主，佐以祛邪，临床疗效显著。

增殖与凋亡之间的平衡失调是肝癌发生发展的一个潜在因素，通常增殖信号激活而调亡过程抑制，导致肝癌细胞生存，然后增殖[10]，同时增殖凋亡的异常与终晚期肝癌系统治疗药物索拉菲尼的耐药相关[11]。本研究中CCK8法检测细胞活性结果显示芪术抗癌方对HepG2细胞增殖有抑制作用，呈浓度依赖。

细胞凋亡是一种维持机体稳态的程序性死亡，主要分为死亡受体途径和线粒体途径。死亡受体途径是通过死亡配体与细胞表面受体结合的外源性形式激活Caspase-8，继之激活Caspase-3。线粒体途径是哺乳动物细胞凋亡的主要途径，内在信号压力下线粒体外膜通透性（MOMP）增加，释放细胞色素C，Caspase-9与活化的APAF1结合形成凋亡复合体后被激活，活化的Caspase-9随后激活Caspase-3。Caspases本来结构上是不活跃的，需要蛋白水解过程裂解激活，它们可以自我激活或者相互之间发生类似级联过程，活化的Caspase-3是细胞凋亡的关键“刽子手”[12]，许多研究表明诱导凋亡对抑制肝癌的发展有重要意义[13-15]，抗癌方既往研究显示可以提高凋亡相关基因P53表达[16]。本研究中凋亡相关蛋白c-Caspase-9和c-Caspase-3均随着药物浓度的增加表达上调，推测抗癌方对肝癌细胞有促进凋亡的作用，可能是通过激活线粒体途径实现的。

综上所述，芪术抗癌方可以抑制肝癌HepG2细胞增殖并诱导其凋亡，而凋亡具体上游触发机制尚不明确，待进一步研究。

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（2019-03-25收稿责任编辑：张雄杰）

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