| 标题 | 血栓弹力图在脓毒症凝血功能检测中优势的分析 |
| 范文 | 陈奇 摘要：近年来，随着对脓毒症（Spesis）的研究不断深入，其定义一直在不断的修订和更新，早期对于脓毒症的理解是各种化脓性或致病微生物存在于血液中，但随着临床认知的不断加深，随后提出了以全身炎症反应（Systemic inflammatory response syndrome SIRS）作为脓毒症的核心诊断标准，而在2016年最新修订的Spesis3.0则不再以SIRS为脓毒症的核心诊断标准，而是以器官功能障碍作为脓毒症的核心诊断标准（1）。对于脓毒症定义的不断质疑与讨论体现了脓毒症复杂的病理生理本质，随着基础研究的不断深入，我们也逐渐意识到脓毒症本质是一种由感染引起的宿主免疫功能紊乱，继发凝血功能紊乱，并产生炎症-凝血网络机制不断促进病情发展，最终导致病患发生休克，脏器功能衰竭，严重者可导致患者死亡。脓毒症相关流行病学研究显示，脓毒症已经是全世界患者住院以及死亡的主要原因之一，其病死率达到25%并逐年提升（2），国内相关流行病学研究则显示在2015年NMSS数据库中报道的1937299 例死亡患者中，脓毒症相关死亡占12.6%，根据人口普查数据计算的标化死亡率为66.7（ 95% CI 66.4～67.0） 例/10万（3）。 【中图分类号】R714 ??【文献标识码】A ??【文章编号】1673-9026（2020）06-003-04 臨床研究发现，脓毒症患者几乎都存在凝血功能紊乱，甚至弥漫性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation DIC）[4] ，因此，脓毒症对于机体正常凝血功能的损害一直受到临床高度关注，通过研究证实，凝血功能紊乱能在脓毒症的病理进程中起到重要作用，这种作用表现在脓毒症相关炎症机制对病患凝血功能的激活和级联反应的影响，同时凝血功能紊乱也可以对脓毒症相关炎症机制产生影响[5]，这是一个基于宿主对感染进行反应的复杂病理过程，有基于此，临床对于脓毒症的治疗方案也逐渐由单纯抗炎，抗细胞因子治疗转变为综合的免疫调理治疗[6]来保证病患的免疫功能平衡以及凝血功能平衡，因而对于脓毒症患者进行早期的，准确的凝血功能检测也就显得尤为重要[1]。 相关研究显示，常规凝血项目对于脓毒症凝血功能检测并不理想，尤其是在早期诊断灵敏度不足，并且无法全面展示病患的实际出凝血状态，相比之下，血栓弹力图在各项试验组数据中均表现相对优异，尤其在脓毒症早期检测中可以更好的提示病患可能存在的凝血功能紊乱。[7-10]，这也进一步体现了血栓弹力图对于脓毒症病患凝血功能检测的临床应用价值。 本文将结合脓毒症相关基础研究以及凝血功能检测相关技术实现手段对比来分析血栓弹力图为何在脓毒症凝血功能的检测中具有优势。 脓毒症炎症反应 脓毒症宿主反应主要表现为初始炎症反应，以及之后的代偿性抗炎反应综合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome CARS），炎症反应可以有效行使抗感染的作用，但同时会对组织造成损伤，而抗炎症反应则可以减弱炎症反应对组织的损伤，却加大了二次感染的概率[11]。 脓毒症初始炎症反应主要表现为早期炎症细胞因子的释放以及固有免疫细胞对炎症的加强[12]。脓毒症初期炎症反应释放的细胞因子可以引起细胞因子风暴，早期炎症细胞因子主要包括TNF-α，IL-1，IL-6等，其中TNF-α是炎症最初启动者，其由激活的单核/巨噬细胞，肝Kuffer细胞，淋巴细胞等所释放，可以促进IL-1，IL-6，IL-8等炎症因子的释放。TNF-α与IL-1的协同作用可以促进炎症的进展。这些细胞因子进一步介导大量炎症介质的释放，如花生四烯酸代谢产物血栓素-2（TXA 2），前列腺环素，前列腺素E2等，而这些炎症介质促进了微循环障碍，介导了发热，心动过速，呼吸急促，心室灌注异常等症状。炎症因子的释放会激活内皮细胞，促进白细胞的黏附和迁移，加速了组织损伤[13]。炎症反应持续上调之后，机体会启动代偿性抗炎反应以对抗过度作用的炎症反应，但是由于脓毒症患者免疫功能稳态已经遭到了破坏，所以此时患者往往表现出免疫抑制状态[14]，或称为免疫麻痹。 在脓毒症相关病理机制的研究中已经发现脓毒症晚期病患往往以免疫抑制为主要表现。通过临床试验也表明，中和病患促炎症因子以及增强抗炎作用的治疗反而使得患者的生存率下降[15-16]。脓毒症免疫抑制主要表现为免疫细胞的大量凋亡以及功能丧失，同时，具有抗炎作用的调节性T细胞（regulatory T cells Tregs细胞），髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells MDSCs）等大量产生，实验显示脓毒症免疫抑制期患者外周血中TNF-α，IL-1β等促炎症细胞因子不足10%，而IL-10等抗炎症因子大量存在[17]，这也进一步证明了脓毒症引起的早期炎症是一种过度反应，脓毒症晚期病患最终进展为代偿性的免疫抑制状态。 这也进一步反映了脓毒症患者病理机制的复杂性。 脓毒症凝血功能激活 几乎所有的脓毒症患者都表现凝血功能紊乱，严重者可能引起弥漫性血管内凝血[4]。对于脓毒症凝血功能紊乱，最早认为是由于内皮细胞损伤而导致以激活FXII为起始的内源性凝血途径所介导，而在Tent Cate H的实验中发现，阻断内源性凝血途径并不能有效阻断脓毒症凝血功能的激活，在Taylor FB等的实验中则显示，通过阻断TF（tissue factor）或者抑制FVII来阻断外源性凝血途径则可以有效阻断脓毒症患者的凝血功能激活，故现在一般认为脓毒症凝血功能激活主要以TF介导的外源性凝血途径为主[18]。 TF一般表达于大部分不直接接触血液的组织细胞上，如血管外膜成纤维细胞，平滑肌细胞等。研究也发现粒细胞，血小板，单核细胞等均表达TF，并且通过检测可以发现血浆内存在由内皮细胞，单核细胞，血小板等分泌的富含TF的颗粒。 TF是一个由263 个氨基酸残基组成的跨膜单链糖蛋白，当血管完整性被破坏时，其从血管外膜进入血液可以启动外源性凝血途径，并且TF介导的外源性凝血途径的激活速度快于内源性凝血途径对凝血级联的激活。在脓毒血症中，TF一般由被激活的单核/吞噬细胞，内皮细胞，血小板等合成并分泌。 各种因素引起的血小板被大量激活加剧了脓毒症的凝血功能紊乱以及微循环障碍。血小板在体内成栓反应中起到了重要作用，主要表现为血小板为凝血因子介导的凝血酶途径提供了稳定的反应表面以及磷脂成分（血小板磷脂3），通过血小板对于凝血因子的吸附作用则可以在局部提高凝血因子的浓度，进一步促进了凝血级联，同时凝血酶以及纤维蛋白的生成又可以进一步促进血小板的激活和聚集。 研究表明，脓毒症患者的抗凝血系统以及纤溶系统受到了抑制，主要表现为抗凝血物质如AT被大量消耗，PC以及TM等则出现了抗凝功能丧失，并且因为脓毒症导致的肝功能受损使得抗凝血物质合成不足，同时血管内皮损伤导致其通透性增加则加重了抗凝物质的流失，最终体内抗凝系统功能丧失[18]。 脓毒症凝血与炎症网络机制 研究显示，脓毒症病理机制中存在凝血与炎症的相互促进作用，即炎症可以启动并促进凝血功能异常，而凝血功能的异常则进一步了促进了炎症的病理进程[19]。 脓毒癥细胞因子大量释放后作用于内皮细胞首先导致内皮细胞表达抗凝机制受损，并使内皮细胞表面表达血管性血友病因子（von Willebrand Factor ?vWF），暴露内皮下胶原[20]。细胞因子进一步促进了花生四烯酸代谢产物，缓激肽等物质的释放，并激活补体系统，以此加速了血小板的激活与聚集。而激活的血小板则可以分泌促炎症蛋白以及生长因子[19]，并通过P一 选择素依赖途径与单核细胞源性吞噬细胞系统相互作用，并通过这个方式增强吞噬细胞系统组织因子的表达[21-22]。 脓毒症时，TF可被多种细胞因子所激活，如TNF-α，IL-1，C反应蛋白（C-reactive protein CRP）等，这些细胞因子作用于单核/巨噬细胞，内皮细胞可以激活这些细胞并使之合成并分泌TF[23]，TF起始外源性凝血途径并极大促进凝血功能紊乱的进程。随之由凝血途径大量激活的凝血酶则可以进一步促进血小板的激活。同时研究表明，TF本身也是一种促炎性细胞因子受体，其介导了炎症因子的信号转导。 研究表明，凝血酶以及一些其他活化的凝血因子可以通过裂解蛋白酶激活受体表现出一系列的促炎作用[25]。凝血酶所介导的促炎作用主要表现在①作用于内皮细胞，介导白细胞对血管壁的黏附，并激活内皮细胞使血管通透性增加，并增加PAF、IL-8、生长因子及基质金属蛋白酶等可溶性介质的释放;②刺激单核细胞、成纤维细胞和上皮细胞 表达IL-6、IL-8等促炎症介质;③诱导内皮细胞表达黏附分子，并通过黏附分子“锚定”中性粒细胞，使中性粒细胞对血小板活化因子（platelet activated factor，PAF）的激活更敏感，释放蛋白酶和活性氧更多，并加重对内皮细胞的水解和氧化损伤;④刺激中性粒细胞表达CD116/CD18，促进白细胞与内皮细胞的相互作用，促进血小板释放CD40配体，以此促进炎症反应[23]。 活化FX是一种丝氨酸蛋白酶，其可以通过蛋白酶激活受体（protease—activated receptor PAR）PAR-2以及PAR-3激活细胞。在内皮细胞表面的活化FX，则通过促进IL-6，IL-8，以及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的释放，可以引起更加强烈的炎症反应[23]。 研究进一步显示，抗凝血酶可以降低白细胞表达β2-选择素，也可以通过黏附于白细胞，降低趋化因子对白细胞移行的作用，以此参与抗炎机制，同样，蛋白C以及血栓调节蛋白（Thrombomodulin TM）等抗凝因子也在抗炎机制中发挥了重要作用[19]。 血栓弹力图与常规凝血技术对比 脓毒症患者体内存在着炎症凝血网络机制，并且这种网络机制会随着脓毒症变化的病程而发生相应改变，因此，及时准确地了解病患当下的凝血功能状况可以辅助临床针对病患当前的凝血功能采取合理的治疗措施，同时也可以辅助评估当前患者的脓毒症整体病情，协助指导针对免疫功能的调理性治疗，以此增加患者的生存率。 而针对脓毒症的凝血功能检测效果已经有多篇相关临床研究的报道，结论均显示血栓弹力图相对于常规凝血功能检测项目具有优势。[7-10]。 常规凝血功能项目主要包括活化凝血活酶时间（PT），活化部分凝血活酶时间（APTT），凝血酶时间（TT），其检测标本均为枸橼酸钠抗凝血浆，不包括血细胞成分。 PT主要检测外源性凝血途径，其原理主要是通过添加血浆凝血活酶试剂（主要成分为TF的替代物）到样本中，以此激活外源性凝血途径，由血浆中的FVII与试剂中的TF替代物形成TF-FVIIa复合物，最终激活凝血酶（活化FII），并由由凝血酶最终激活样本中的纤维蛋白原，纤维蛋白最终使反应体系凝固，通过测量其凝固时间来得到PT结果，其单位为Secend，而国际标准化比值（INR）则是通过PT检测值与PT正常对照值（正常值存在区域和人群的特点）之比的国际敏感度指数（ISI 由厂家出厂时标定）的次方来求得，INR在临床用药检测，手术出血评估等方面应用十分广泛，其做值与PT检测的相关性很大。 APTT主要检测内源性凝血途径，原理是通过添加鞣花酸或白陶土等带有负离子的异物进入样本后可以激活以FXII起始的内源性凝血途径，此时血浆中因为缺乏血小板，无法形成内源性凝血复合物FIXa-FVIIIa-Ca2+-PF3 ，其中PF3即血小板磷脂3，此时血小板磷脂一般由试剂中的兔脑成分代替（兔脑磷脂），反应最终激活凝血酶，由凝血酶激活纤维蛋白原，纤维蛋白使反应体系凝固，通过计算反应体系凝固时间来得到APTT的结果，单位为Secend。 TT反应原理为向反应体系中加入足量凝血酶直接激活纤维蛋白原，检测反应体系凝固时间，该方法没有内源性和外源性凝血激活途径的参与，单位为Secend。 通过以上对常规凝血功能检测的介绍可以得到的结论是，常规凝血功能检测是无法完整体现病患体内实际凝血功能的整体状态，尤其是在脓毒症患者的凝血功能检测中。 主要原因在于：（1）血小板功能在体内得以实现的基础在于其功能的完整性和数量的保证，常规凝血功能检测提供的血小板磷脂替代物无法和实际血小板数量以及功能相匹配，尤其在脓毒症患者的病理机制下，血小板可能出现功能与数量的异常。（2）脓毒症TF来源比较复杂，其含量的多少与实际凝血功能紊乱程度相关，而常规凝血功能检测反应体系中的TF试剂替代物并不能有效反应病患此时实际情况。（3）凝血功能本身具有极其复杂的关联性，血小板可以有效促进凝血因子途径的凝血功能激活，而凝血功能激活途径产物如凝血酶，纤维蛋白等又可以有效促进血小板的激活与聚集作用，所以凝血功能在体内的实现是一个十分复杂的系统，凝血功能检测应该体现其中相关性，以此保证凝血功能的体外诊断是符合病患当前体内情况的。（4）脓毒症患者的凝血功能与炎症形成了复杂的交叉网络机制。炎症机制通过细胞因子，免疫细胞功能等方面深刻影响了凝血功能，反之，凝血功能的激活又进一步影响了炎症的病理进程，因此，凝血功能检测应该能夠包含反应体系中的各种影响因素，如炎症因子对凝血因子的影响，凝血因子之间的影响，血小板与凝血因子以及炎症因子之间的影响等。 血栓弹力图（Thromboela-stogram TEG）是Hartert于1948年发明，上个世纪80年代开始应用于临床，经过几十年的发展，其使用领域已经遍及输血，麻醉，重症，心外，妇产等诸多临床科室。 血栓弹力图本质是一种粘弹性实验，通过检测反应体系中不断形成的血凝块的粘弹性变化来获得检测结果的血栓弹力图。实验装置是由一个圆柱形塑料杯以及其杯盖为基础，病患全血样本与试剂加入塑料杯中，塑料杯上方有一根敏感探针连接到插入反应体系的杯盖中，塑料杯以4°45′的角度作逆时针和顺时针缓慢的交替旋转，塑料杯中反应体系的凝血功能被激活后，以包括血小板，凝血因子以及各种其他影响因素在内的全血体系使得塑料杯与杯盖之间的阻力随着凝固的加剧而不断加大，期间不断通过上方探针对阻力转化为的扭转力进行探测，记录下来的电信号在计算机算法处理下最终得到临床应用的血栓弹力图。血栓弹力图基本参数包括R时间，K时间，α角度，MA值，Ly30，Ly60等。 R时间主要表达反应体系被试剂激活后到血凝块开始形成的时间。K时间和α角度一般联合看待，二者综合体现了血凝块形成的速度。MA则体现了血凝块形成后的最大强度，其主要影响因素是血小板数量以及功能。当血凝块最终形成以后，反应体系内纤溶系统开始发挥主要作用，通过检测达到MA值之后的30分钟和60分钟的血凝块强度，即为Ly30和Ly60，二者共同体现了反应体系中纤溶系统功能的情况。 通过上述介绍可以得到结论：血栓弹力图的反应体系中包含了凝血功能除血管体系以外的几乎所有相关的关键要素如血小板，凝血因子，抗凝血因子，纤溶因子等等，以及影响要素如相关细胞因子，免疫细胞等。就脓毒症来说，血栓弹力图可以完整的体现病患当前体内实际的凝血功能状况，这种实际状况的体现主要表现在反应体系内细胞的实际数量情况，实际功能情况，凝血因子，抗凝血因子等实际数量与功能的情况，整个反应体系是符合体内的真实情况的反应体系。 讨论 血栓弹力图虽然通过凝血性凝血途径激活，但是在凝血级联放大作用机制下，血小板（比如可以被凝血酶激活）以及外源性凝血途径（比如细胞相关TF因子的释放和激活）会很快被激活，并参与到整个血栓弹力图的反应体系中，因此，血栓弹力图是一种针对凝血全貌的分析。 同时就脓毒症来说，其病情复杂多变，早期免疫亢进以促炎症为病理主体，而很快被代偿性激活的抗炎反应又会在晚期引起代偿性抗炎反应综合征，而其中细胞因子以及相关免疫细胞的病理性变化无疑会深刻影响到当前以及未来病患凝血功能的变化，而凝血功能的变化由可以进一步影响脓毒症病患的炎症机制，以此为基础的炎症凝血交叉网络一方面促进脓毒症病情，另一方又被脓毒症病情所影响，因此，能够全面涵盖凝血功能全貌——细胞层面，凝血因子层面，抗凝血因子层面，纤溶因子层面等，同时又可以针对患者当前体内实际各要素（包括凝血要素，炎症要素）间相互关系的检测才能更加有效和准确的反应病患的病情，并可以以此为依据，指导临床的诊断以及治疗工作，而血栓弹力图的优势无论从理论基础和实际临床数据中都可以看出来。 参考文献： [1]李维勤，习丰产.脓毒症定义和集束化治疗方案更新对当前临床实践的挑战[J].医学研究生学报，2019，32（01）：15-19. 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