| 标题 | 基于LTQ—Orbitrap液相色谱—质谱联用技术的乳源乳清蛋白组分的差异性研究 |
| 范文 | 徐明芳等 摘要：利用LTQ Orbitrap XL组合型傅立叶变换高分辨质谱系统分析了乳源蛋白主要组分肽指纹图谱。对南方水牛乳与不同来源的乳清蛋白的氨基酸序列研究结果表明，乳清蛋白经酶解后主要为α乳白蛋白（αLa）和β乳球蛋白（βLg）组分，乳清蛋白肽质指纹谱的分析显示水牛乳与荷斯坦奶乳清蛋白αLa氨基酸发生变异的比率明显少于山羊奶乳清蛋白αLa，说明荷斯坦奶αLa和水牛乳αLa的差异更小，同源性更强；而水牛乳βLg与荷斯坦乳βLg氨基酸发生变异的部位比率要多于山羊奶，水牛乳βLg与山羊奶同源性更强；乳源酪蛋白酶解后的肽段主要组分为αs1CN，βCN，κN，通过对水牛乳酪蛋白的氨基酸序列的差异性分析，不同品种的乳源酪蛋白的氨基酸序列明显存在差异。与乳清蛋白相比，奶牛品种差异导致乳蛋白发生氨基酸差异现象更显著，酪蛋白的氨基酸序列对比表明，水牛奶酪蛋白与山羊奶酪蛋白比与乳牛酪蛋白的差异更大。 关键词：LTQ Orbitrap质谱； 乳源蛋白； 酪蛋白； 乳清蛋白； 肽质指纹谱； 差异性 1引言 动物乳中蛋白质主要由酪蛋白（αs1酪蛋白、αs2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白） 、乳清蛋白（β乳球蛋白和 α乳白蛋白、免疫球蛋白、牛血清蛋白）组成，乳蛋白在体内合成过程中经过大量的遗传变异和丰富的翻译后修饰，并受到地域、品种、饲料、气候诸多因素的影响，致使乳蛋白的合成及表达呈现出较大的差异[1]，乳蛋白的组成变得异常复杂。近年对乳及乳制品中蛋白质组分的分析检测已有报道[2，3]，且主要集中在乳蛋白组分分离及含量检测，但分析和鉴定复杂体系中的蛋白组分精细结构肽质指纹谱的差异性还是一大挑战[4]。二维线性离子阱高分辨静电场组合质谱仪（LTQ Orbitrap XL）具有非常高的灵敏度，能够对样品进行快速扫描，分辨率60 K时， 扫描周期不超过1 s； 具有高达100 K的分辨能力，可直接从复杂样品中快速、灵敏、可靠地检测化合物，在各个领域都有广泛应用。本研究将利用LTQOrbitrap液相色谱质谱技术对南方水牛奶乳清蛋白的酶解肽段进行分析，检测各离子片段的相对分子质量及氨基酸组成，使用Mascot软件在数据库中检索，得出预测蛋白质的氨基酸序列，再与Pubmed数据库中已知序列进行比对，得出蛋白源自种属，并与乳牛奶酪蛋白和山羊奶酪蛋白相对应组分的氨基酸序列比对，研究其氨基酸序列间的差异，从而揭示由于乳牛品种遗传特性差异引起乳清蛋白差异变化的本质规律，为不同条件下乳蛋白表达图谱库的建立及奶乳蛋白快速检测寻找分子标记提供技术手段，为乳品加工保存条件的优选及乳源蛋白不同组分的生物活性肽的研究提供理论依据。 2实验部分 2.1仪器、试剂与材料 LTQ Orbitrap XL质谱仪（Thermo公司）；反相高效液相色谱C18色谱柱（Michrom Bioresources公司）；超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物仪器公司）；SCIENTZ11D型高速冷冻离心机（Eppendorf公司）。 乙腈、NH4HCO3、三氟乙酸、二硫苏糖醇、吲哚3乙酸等（Sigma公司）；胰蛋白酶（Promega公司）。南方水牛奶（购于广州市某市场）。 2.2试剂的配制 2.3.2SDSPAGE电泳将分离得到的乳源蛋白SDSPAGE电泳，配制12%分离胶及5%浓缩胶，电泳完毕后用凝胶成像与分析系统对电泳图进行光密度扫描，以等电点沉淀得到的水牛奶酪蛋白电泳图作对比，初步确定分离出的蛋白成分和含量。 2.3.3蛋白胶内酶解将获得的酪蛋白及乳清蛋白SDSPAGE胶分别按以下步骤酶解：切下SDSPAGE凝胶上的目标蛋白点分别于编号EP管中，水洗胶块两次，加入适量新鲜脱色剂，37 ℃水浴脱色至胶块透明，弃液体；再用100% 乙腈脱水至胶块变为白色，弃液体；加入5～6 mL 25 mmol/L NH4HCO3（含10 mmol/L DTT）还原剂并封口，57 ℃水浴1 h，取出样品，冷却至室温，弃液体，迅速加入等体积的烷基化试剂，室温避光放置30 min；去烷基化试剂，加入50%乙腈，静置15 min；弃液体，加入5～6 mL 50 mmol/L NH4HCO3振荡静置吸胀5 min，弃液体；分别用50%和 100%乙腈脱水至胶块变为白色，弃液体。分别加4 μL酶液于各EP管，冰上放置30 min后，吸走多余的酶液，加20 μL覆盖液并封口，37 ℃保温18 h。取样品于10000 g/min条件下超声5 min，上清液转移至新的EP管中，胶块中加入萃取液，37 ℃保温30 min， 超声后与之前上清液混合并真空冷冻干燥，备用。 2.3.4质谱分析取冻干的样品，分别加入4 μL样品溶解液，充分振荡涡旋，于4 ℃下，13200 r/min离心15 min，取上清液进行质谱分析。样品先经系统的反相高效液色谱C18柱（100 mm×100 μm， 3 μm）分离后，进入LTQ Orbitrap系统分析。样品在反相柱上的洗脱梯度是5%～45%乙腈（含0.1% 甲酸）洗脱60 min，洗脱速度为30 nL/min。质谱参数：离子传输管温度200 ℃；电喷雾电压是1.85 kV。一级质谱Orbitrap扫描范围是400～2000 Da，一级质谱里选取信号最强的10个母离子做二级质谱分析，动态排除功能开启，时间90 s。二级质谱LTQ为CID碰撞模式，标准化碰撞能量35%，活化q值0.25，活化时间30 ms。肽段信息用Mascot软件进行数据库检索，得出结果。 3结果与讨论 3.1水牛奶乳清蛋白的总离子流色谱及二级质谱图 蛋白酶酶解的水牛乳乳清蛋白、酪蛋白的多肽混合物经LTQOrbitrap XL液质联用分析，获得样品的总离子流色谱图（图1）。水牛乳乳蛋白多肽混合物总离子流色谱图纵坐标代表物质纵声的总离子信号，总离子流色谱图由许多峰组成，这些峰是按色谱峰出峰先后顺序排列的，同一峰又由许多不同质荷比的碎片组成。同一个离子流峰中的不同的质荷比的碎片由小到大的顺序形成质谱图。 4结论 本实验对乳源蛋白各个主要组分进行质谱分析，获得水牛奶酪蛋白主要组分（αs1CN，βCN和κCN）和不同来源乳源乳蛋白主要组分（α乳白蛋白和β乳球蛋白）肽段的氨基酸序列信息，及各组分的完整氨基酸序列。结果表明，不同品种的乳源乳蛋白的氨基酸序列均不同，存在氨基酸变异现象。在α乳白蛋白的氨基酸序列对比中，水牛乳和羊奶的差异比荷斯坦奶的差异大；而在β乳球蛋白中， 水牛乳和荷斯坦奶的差异比羊奶的差异大。与酪蛋白相比，不同乳源两种乳清蛋白的变异现象比酪蛋白少很多[7]； 与乳清蛋白相比，发生氨基酸差异现象的部位和比率更多； 在酪蛋白的氨基酸序列对比中， 水牛奶酪蛋白与山羊奶酪蛋白比与乳牛酪蛋白的差异更大。 References 1CHEN JingTing， MA Lu， YANG JinHui， ZHANG JuanXia， LI FaDi， BU DengPan. Chinese Journal of Animal Nutrition， 2013， 25（8）： 1683-1688 2FENG XuDong ，AN WeiDong， DING Yi ，YU AiMin， LIU Jing ，GAO DeJiang， WANG ZhiHong ，YU Yong. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（10）： 1496-1500 3Albreht A， Vovk I. J. Chromatogr. A， 2012， 1227：210-218 4Erve J C L， Gu M， Wang Y D， DeMaio W， Talaat R E. J. Am. Soc .Mass Spectrom.， 2009， 20： 2058-2069 5ZHANG Rui，YUAN MinWei，SHI BingZhao. Chinese J. Pharmaceuticals， 1999， 30（2）： 51-53 6LI YunKai， LI ZiChao， WANG LiNa， XU MingFang. Chinese J. Analysis Laboratory， 2011， 4（30）： 70-72 7CHENG XiFei， LI YunKai， XIANG MingXia， LI ZiChao， XU MingFang. Food Science and Technology， 2012， 11： 289-292 4结论 本实验对乳源蛋白各个主要组分进行质谱分析，获得水牛奶酪蛋白主要组分（αs1CN，βCN和κCN）和不同来源乳源乳蛋白主要组分（α乳白蛋白和β乳球蛋白）肽段的氨基酸序列信息，及各组分的完整氨基酸序列。结果表明，不同品种的乳源乳蛋白的氨基酸序列均不同，存在氨基酸变异现象。在α乳白蛋白的氨基酸序列对比中，水牛乳和羊奶的差异比荷斯坦奶的差异大；而在β乳球蛋白中， 水牛乳和荷斯坦奶的差异比羊奶的差异大。与酪蛋白相比，不同乳源两种乳清蛋白的变异现象比酪蛋白少很多[7]； 与乳清蛋白相比，发生氨基酸差异现象的部位和比率更多； 在酪蛋白的氨基酸序列对比中， 水牛奶酪蛋白与山羊奶酪蛋白比与乳牛酪蛋白的差异更大。 References 1CHEN JingTing， MA Lu， YANG JinHui， ZHANG JuanXia， LI FaDi， BU DengPan. Chinese Journal of Animal Nutrition， 2013， 25（8）： 1683-1688 2FENG XuDong ，AN WeiDong， DING Yi ，YU AiMin， LIU Jing ，GAO DeJiang， WANG ZhiHong ，YU Yong. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（10）： 1496-1500 3Albreht A， Vovk I. J. Chromatogr. A， 2012， 1227：210-218 4Erve J C L， Gu M， Wang Y D， DeMaio W， Talaat R E. J. Am. Soc .Mass Spectrom.， 2009， 20： 2058-2069 5ZHANG Rui，YUAN MinWei，SHI BingZhao. Chinese J. Pharmaceuticals， 1999， 30（2）： 51-53 6LI YunKai， LI ZiChao， WANG LiNa， XU MingFang. Chinese J. Analysis Laboratory， 2011， 4（30）： 70-72 7CHENG XiFei， LI YunKai， XIANG MingXia， LI ZiChao， XU MingFang. Food Science and Technology， 2012， 11： 289-292 4结论 本实验对乳源蛋白各个主要组分进行质谱分析，获得水牛奶酪蛋白主要组分（αs1CN，βCN和κCN）和不同来源乳源乳蛋白主要组分（α乳白蛋白和β乳球蛋白）肽段的氨基酸序列信息，及各组分的完整氨基酸序列。结果表明，不同品种的乳源乳蛋白的氨基酸序列均不同，存在氨基酸变异现象。在α乳白蛋白的氨基酸序列对比中，水牛乳和羊奶的差异比荷斯坦奶的差异大；而在β乳球蛋白中， 水牛乳和荷斯坦奶的差异比羊奶的差异大。与酪蛋白相比，不同乳源两种乳清蛋白的变异现象比酪蛋白少很多[7]； 与乳清蛋白相比，发生氨基酸差异现象的部位和比率更多； 在酪蛋白的氨基酸序列对比中， 水牛奶酪蛋白与山羊奶酪蛋白比与乳牛酪蛋白的差异更大。 References 1CHEN JingTing， MA Lu， YANG JinHui， ZHANG JuanXia， LI FaDi， BU DengPan. Chinese Journal of Animal Nutrition， 2013， 25（8）： 1683-1688 2FENG XuDong ，AN WeiDong， DING Yi ，YU AiMin， LIU Jing ，GAO DeJiang， WANG ZhiHong ，YU Yong. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（10）： 1496-1500 3Albreht A， Vovk I. J. Chromatogr. A， 2012， 1227：210-218 4Erve J C L， Gu M， Wang Y D， DeMaio W， Talaat R E. J. Am. Soc .Mass Spectrom.， 2009， 20： 2058-2069 5ZHANG Rui，YUAN MinWei，SHI BingZhao. Chinese J. Pharmaceuticals， 1999， 30（2）： 51-53 6LI YunKai， LI ZiChao， WANG LiNa， XU MingFang. Chinese J. Analysis Laboratory， 2011， 4（30）： 70-72 7CHENG XiFei， LI YunKai， XIANG MingXia， LI ZiChao， XU MingFang. Food Science and Technology， 2012， 11： 289-292 |
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