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不同施肥处理对有机种植土壤微生物区系的影响

范文

王超刘明庆黄思杰李妍田伟陈秋会王磊席运官

摘要：在有机种植条件下，基于高通量测序分析复合微生物肥及有机肥的施用对有机冬瓜根区土壤微生物区系的影响，结合土壤化学性质及酶活性、有机冬瓜果实品质作相关分析。结果显示，复合微生物肥的施用显著降低土壤真菌群落丰富度，施用有机肥提高真菌群落丰富度，二者均提高土壤真菌、细菌种群多样性;根区土壤中变形菌门、厚壁菌门和放线菌门是优势细菌，子囊菌门是优势真菌;复合微生物肥和有机肥的施用均降低厚壁菌门和芽孢杆菌科的相对丰度，施用复合微生物肥提高结合菌门的相对丰度，降低毛壳菌科和肉座菌科的相对丰度，施用有机肥则相反。施肥显著提高土壤过氧化氢酶、蔗糖酶活性;显著提高冬瓜总氨基酸含量，显著降低可溶性固形物含量。因此，施用复合微生物肥及有机肥可改变有机冬瓜根区土壤微生物的丰富度、多样性及群落结构，提高土壤酶活性，改善有机冬瓜品质。

关键词：复合微生物肥;有机肥;有机冬瓜;高通量测序;微生物区系

中图分类号： S154.3 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）20-0266-07

健康的土壤是农业种植生产的基础，通过施肥培育健康土壤、提升土地质量是当前我国农业种植生产中提高作物产量和品质的关键环节。相较于常规农业中化学肥料的大量使用，施用复合微生物肥及有机肥是当前有机种植生产中改良土壤、增加土壤肥力的重要手段。与传统有机肥料不同，复合微生物肥含有特定微生物[1]，田间施用会将大量微生物引入土壤局部区域，对有机种植土壤中原有的微生物区系造成影响，甚至会破坏土壤微生态平衡，须科学评价其对土壤微生态的影响。以往的研究主要探讨了有机肥料施用对植物生产及土壤养分的影响，部分研究关注其对常规农业种植土壤微生物区系的影响[2-3]，而针对有机肥料影响有机种植土壤微生物区系的研究极少。对于土壤微生物的研究，传统的分析方法包括琼脂培养基培养法、Biolog平板法、磷脂脂肪酸法、PCR-变性梯度凝胶电泳（DGGE）和限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）等，但均存在操作复杂、试验周期长、痕量微生物检测困难等弊端，无法深入分析，而高通量测序技术通过检测土壤微生物细胞内特定遗传物质（原核微生物16S rDNA/rRNA、真核微生物18S rDNA/rRNA）的碱基序列，可以更全面、准确地揭示土壤中微生物群落的复杂性和多样性，已被广泛应用于土壤微生物区系研究[4-6]。

2015年农业部制定了《到2020年化肥使用量零增长行动方案》，明确了“有机肥替代化肥”的技术路径，同时确立“一控两减三基本”的目标，力争实现农药化肥的零增长。在此背景下，有机肥料及微生物肥料的作用越来越凸显。截至2016年7月，农业部登记的微生物肥料产品达到2 780个，年产量已突破1 000万t，应用面积超过1 333万hm2[7]。与之相对应的是我国有机作物种植面积的快速增长，截至2015年年底，有机植物生产面积为222.4万hm2，有机生产面积已达全国农业耕地面积的0.77%[8]。随着我国有机作物种植面积的不断增长，有机肥及复合微生物肥必将被大量施用，然而其在提升有机种植耕作层土壤质量中的作用尚缺乏明确的科学依据，因此需要科学评测二者对有机种植土壤微生物区系的影响。本研究基于Illumina新一代Miseq平台的高通量测序技术，结合相关生物信息学方法，全面分析土壤细菌16S rRNA基因V3+V4区和真菌ITS1区的多样性指数及群落结构，旨在研究江苏省仪征市有机蔬菜田在轮作种植条件下，复合微生物肥及有机肥对有机冬瓜根区土壤微生物多样性和群落结构的影响，并结合土壤化学性质、酶活性以及有机冬瓜果实品质作相关分析，以期科学反映施用复合微生物肥及有机肥对有机种植土壤健康的影响。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

田间试验选址在江苏省仪征江扬生态农业有限公司四庄基地有机蔬菜田（119°7′4.3″E，32°22′59.8″N;有机认证证书编号：134OP1200259），土壤类型为潮土，年平均气温 15.3 ℃，年日照时数2 054.1 h，无霜期224 d，年均降水量约994 mm。经本研究种植前采样分析测定得到，试验田0～20 cm 土壤基本性质：pH值6.59，铵态氮含量12.67 mg/kg，速效磷含量 20.33 mg/kg，速效钾含量201.06 mg/kg，有机质含量33.27 g/kg，过氧化氢酶活性10.16 U/g，蔗糖酶活性 15.67 U/g，脱氢酶活性271.91 U/g，脲酶活性1 330.98 U/g，酸性磷酸酶活性17.42 U/g。

1.2 试验设计

试验于2017年5—10月进行，采用随机区组设计，共设置3个处理，分别为复合微生物肥处理（B）、有机肥处理（O）和对照（C），每个处理设置3个重复，共9个小区，每个小区面积为3 m×10 m=30 m2，保护行宽为1 m，走道宽及小区间排水沟宽均为0.5 m。试验作物为冬瓜[Benincasa hispida （Thunb.） Cogn.]，前茬作物为青菜（Brassica chinensis L.）。复合微生物肥处理和有机肥处理施肥作为基肥，施用量均为1 500 kg/hm2，对照组不施肥。田间管理及有害生物防治采取有机管理模式。

复合微生物肥[微生物肥（2017）准字（2285）号]由作物秸秆制作而成，总养分含量为8%，有机质含量为20%，有效活菌数为0.2亿个/g，其中细菌数量为0.16亿个/g，真菌数量为0.03亿个/g，其他菌种数量为0.01亿个/g。有机肥[苏农肥（2012）准字0381号]的有机质含量≥45%，总养分含量≥5%。

1.3 样品采集

土壤样品采集于第1次盛花期进行，用土壤采样器钻取各处理小区0～20 cm根区土壤，按照“S”形多点取样，每小区钻取6鉆，去除根系、杂草、土壤动物和石块等杂质后充分混匀作为1个根区土壤样品，采用四分法平均分成2份，低温保存带回实验室，分别置于-80 ℃和-20 ℃冰箱保存备用。

有机冬瓜样品统一采集第2批进入成熟期的冬瓜果实，每个处理随机选取3个果实进行品质测定。

1.4 土壤性质测定

土壤样品经自然风干、研磨过筛（1 mm）后，参照文献[9]的方法测定其理化性质。其中，pH值使用pH计测定（土水比1 g ∶5 mL）;将土壤样品用浓度为 0.5 mol/L 的K2SO4溶液浸提1 h后，用连续流动分析仪测定氨态氮含量;速效磷含量采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-分光光度法测定;速效钾含量采用1 mol/L CH3COONH4浸提-火焰光度法测定;有机质含量采用油浴外加热-K2Cr2O2容量法测定。土壤过氧化氢酶、蔗糖酶、脱氢酶、脲酶和酸性磷酸酶的活性分别使用南京建成生物工程研究所提供的土壤酶试剂盒测定。

1.5 土壤微生物总DNA提取和高通量测序

采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit（OMEGA，美国）的试剂盒提取土壤微生物总DNA，采用NanoDrop-ND1000测定提取的DNA浓度，并经2%琼脂糖凝胶电泳对DNA样品进行检测，合格后用于构建文库;以各土壤样品微生物总DNA为模板，以细菌V3+V4区（338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′;806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[10]和真菌ITS1区（ITS1F 5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′;2043R 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）[11]特异性引物为扩增引物进行融合引物PCR;采用Illumina MiSeq测序平台对PCR扩增产物进行双端测序分析，测序委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.6 有机冬瓜品质测定

游离氨基酸含量测定参照GB 5009.124—2016《食品安全國家标准食品中氨基酸的测定》;可溶性固形物含量测定参照GB/T 8210—2011《柑桔鲜果检验方法》;可溶性总糖含量测定参照NY/T 1278—2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的测定铜还原碘量法》;总酸度测定参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》;糖酸比以可溶性总糖含量与总酸度的比值表示;蛋白质含量测定参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》;粗纤维含量测定参照GB/T 5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》;维生素C含量测定参照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》;硝酸盐含量测定参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》。

1.7 数据处理与分析

土壤理化性质、土壤酶活性及有机冬瓜品质数据采用Microsoft Excel 2010软件进行整理和图表制作，用DPS 7.05进行方差分析（LSD法），显著性水平设定为0.05。

测序数据采用FLASH[12]和Trimmomatic[13]软件进行过滤优化和双端序列连接，优质序列利用Usearch软件基于97%的相似水平进行OTU（operational taxonomic units）聚类，根据Silva细菌数据库[14]和Unite真菌数据库利用RDP Classifier进行物种注释和分类[15];基于OTU丰度信息，利用R语言工具制作稀释曲线（rarefaction curve）、Venn图和群落柱形图，利用Mothur软件计算α-多样性指数（Shannon、Simpson、Chao、ACE）[16-17]，并用Excel和DPS进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 土壤微生物文库测序结果评价

本研究对9个土壤样品进行了Illumina MiSeq高通量测序，数据经过滤优化，细菌文库共得到392 525条有效序列，序列长度分布在267～516 bp之间，97%相似水平下聚类获得21 528个OTU;真菌文库共得到541 244条有效序列，序列长度分布在204～452 bp之间，97%相似水平下聚类获得 5 694 个OTU。每个样品的有效序列数量和OTU数量如表1所示，各处理组间细菌文库的有效序列数和OTU数、真菌文库的有效序列数差异不显著，处理组B真菌文库的OTU数显著低于处理组O和对照组C（P<0.05）。

稀释曲线反映了样品文库测序数据量的合理性，可用于评价测序数据量能否覆盖所有类群。细菌和真菌多样性稀释曲线（图1）显示，随着测序量的不断增大，各样品OTU数目的增加趋势趋于平缓，最终基本达到饱和，说明测序数据量合理;在97%相似水平上计算各土壤样品测序的覆盖率，结果（表2）显示，细菌文库测序覆盖率在98%以上，真菌文库测序覆盖率在99%以上，说明取样合理，处理组间微生物文库测序覆盖率差异不显著。因此，测序数据能够真实地反映土壤样品中的微生物群落，但可能仍有少量微生物种类未被发现。

2.2 施肥对根区土壤微生物群落丰富度和多样性的影响

Shannon指数和Simpson指数用于反映土壤样品中微生物的多样性，前者数值越大，表示群落多样性越高;后者数值越大，表示群落多样性越低[18]。表2数据显示，施用肥料后，处理组B有机冬瓜根区土壤细菌Shannon指数、Simpson指数下降，处理组O Shannon指数上升、Simpson指数下降，但与对照组C之间差异均不显著。处理组B土壤真菌Shannon指数上升、Simpson指数下降，处理组O Shannon指数、Simpson指数上升，与对照组C之间差异均不显著。可见，有机冬瓜根区土壤施用复合微生物肥和有机肥可分别在一定程度上提高土壤真菌、细菌种群多样性。

ACE指数和Chao指数可反映群落物种丰富度。由表2数据可知，有机冬瓜根区土壤细菌ACE指数和Chao指数在施用复合微生物肥后上升，上升幅度分别为3.17%和3.98%，处理组O指数变化幅度不大，均与对照组C之间差异均不显著。与对照组C相比，施用复合微生物肥显著降低土壤真菌的ACE指数、Chao指数（P<0.05），分别降低8.39%、9.39%;处理组O指数小幅上升，差异不显著。结果表明，施用复合微生物肥在一定程度上丰富了有机冬瓜根区土壤细菌群落结构，但显著降低真菌群落丰富度;施用有机肥则提高了土壤真菌群落丰富度。

2.3 施肥后根区土壤微生物类群分析

在97%的相似水平上，对照组C、处理组B、处理组O土壤样品分别得到2 373、2 422、2 380个细菌OTU（平均值），差异不显著;得到631、595、672个真菌OTU（平均值），处理组O显著高于对照组C和处理组B（表1）。可见，施用复合微生物肥和有机肥在一定程度上提高了有机冬瓜根区土壤细菌类群的特异性;施用复合微生物肥显著降低土壤真菌类群的特异性，施用有机肥则显著提高土壤真菌类群的特异性。

Venn图可直观展现并反映组间或样品之间的OTU数目组成相似性、重叠情况以及特异性[19]。由图2-A可知，对照组C、处理组B和处理组O之间共有的细菌OTU数目为 2 257个，代表的物种分别属于α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、放线菌纲（Actinobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、酸杆菌纲（Acidobacteria）和芽单胞菌纲（Gemmatimonadetes）（占比超过1.5%的纲）。对照组C、处理组B、处理组O特有的OTU数分别为59、74、67个，说明施用复合微生物肥和有机肥会增加有机冬瓜根区土壤特有细菌物种。

从图2-B中可以看出，对照组C、处理组B和处理组O共有的真菌OTU数目为474个，主要共有物种分别属于盘菌纲（Pezizomycetes）和糞壳菌纲（Sordariomycetes）（占比超过7%的纲）。对照组C、处理组B、处理组O特有的OTU数分别为74、74、127个，说明施用有机肥会增加根区土壤特有真菌物种。

2.4 施肥对根区土壤微生物群落分布特征的影响

在门分类水平上的细菌类群分布及相对丰度如图3-A所示，有机冬瓜根区土壤样品中的细菌包含变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）等菌群，处理组B、处理组O和对照组C细菌群落组成相似;除了未分类的其他菌群，变形菌门、厚壁菌门和放线菌门的相对丰度较高，属于优势细菌;施用复合微生物肥和有机肥不同程度地降低了根区土壤厚壁菌门的相对丰度，分别比对照组C降低18.55%、26.07%;处理组B根区土壤酸杆菌门相对丰度较对照组C降低25.09%，而处理组O则升高32.38%。从细菌科的分类水平（图3-B）上看，除未确定科类外，有机冬瓜根区土壤中芽孢杆菌科（Bacillaceae）、黄色单胞菌科（Xanthomonadaceae）、芽单胞菌科（Gemmatimonadaceae）和鞘酯菌科（Sphingomonadaceae）的相对丰度均较高（数值>3%），属于优势细菌;施用复合微生物肥和有机肥分别使芽孢杆菌科相对丰度降低了18.09%、26.37%。

图3-C为有机冬瓜根区土壤真菌在门分类水平上的物种柱状图，子囊菌门（Ascomycota）、接合菌门（Zygomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）等在处理组B、处理组O和对照组C土壤样品中均有分布，子囊菌门是优势菌群，相对丰度占比超过84%;受限于数据库的原因，相对丰度排名第2的菌群未能分类;施用复合微生物肥使根区土壤接合菌门的相对丰度提高35.99%，施用有机肥则降低接合菌门的相对丰度，降幅为22.29%。图 3-D显示，有机冬瓜根区土壤真菌在科水平上主要包括毛壳菌科（Chaetomiaceae）、肉座菌科（Hypocreaceae）、丛赤壳科（Nectriaceae）、发菌科（Trichocomaceae）和小囊菌科（Microascaceae）等，除了未确定科类的菌群外，子囊菌门中毛壳菌科的相对丰度在处理组B、处理组O和对照组C中均最大，是优势菌群;施用复合微生物肥降低了毛壳菌科、肉座菌科的相对丰度（比对照组C降低19.37%、46.02%），施用有机肥则提高了毛壳菌科、肉座菌科的相对丰度（比对照组C提高23.07%、42.00%）;施用复合微生物肥、有机肥均降低了丛赤壳科的相对丰度（比对照组C降低39.36%、22.95%）。

2.5 施肥对根区土壤化学性质及酶活性的影响

本研究于有机冬瓜第1次盛花期测定了根区土壤化学性质及酶活性，结果（表3）显示，处理组B、处理组O和对照组C土壤铵态氮、速效钾、速效磷含量均低于种植前，处理组B各项化学性质指标略低于对照组C，处理组O则高于对照组C（除pH值外），差异均不显著。施用有机肥和复合微生物肥显著提高了根区土壤过氧化氢酶及蔗糖酶活性，对脱氢酶、脲酶和酸性磷酸酶活性影响不显著（表4）。

2.6 施肥对有机冬瓜品质的影响

本研究对第2批进入成熟期的有机冬瓜果实进行了营养品质指标测定分析，结果（表5）显示，施用复合微生物肥和有机肥均显著提高有机冬瓜果实总氨基酸、总糖、总酸的含量（处理组B比对照组C分别上升15.38%、135.29%、14.29%;处理组O比对照组C分别上升7.69%、17.65%、14.29%），二者均显著降低了可溶性固形物、蛋白质、维生素C的含量（处理组B比对照组C分别下降13.31%、26.86%、34.27%;处理组O比对照组C分别下降17.34%、45.14%、14.77%）;施用有机肥可提高有机冬瓜果实硝酸盐含量，较对照组C升高5.64%，影响不显著;施用复合微生物肥可显著降低有机冬瓜果实硝酸盐含量（P<0.05），较对照组C降低 12.09%。

3 讨论

当前，高通量测序技术已被广泛用于土壤微生物的群落结构及多样性研究[5]。针对复合微生物肥及有机肥施用对有机种植土壤微生物区系影响的研究鲜有报道，本研究基于Illumina Miseq平台，对有机冬瓜根区土壤细菌16S rRNA基因V3+V4区域和真菌ITS1区域进行高通量测序，结合相关生物信息学方法分析发现，施用复合微生物肥会提高细菌群落多样性，降低土壤真菌群落丰度，与顾欣等在设施田块西瓜种植中应用菌肥的研究结果[20]一致。基于Silva和Unite数据库分析显示，有机冬瓜根区土壤中变形菌门、厚壁菌门和放线菌门是主要细菌类群，与Schloss等利用16S rRNA对农田土壤细菌进行生态学分类的结果[21]一致;子囊菌门是主要真菌类群，与Roesch等对土壤微生物群落的研究结果[22]一致。

α-多样性指数是有效评价土壤微生物群落多样性和物种丰富度的指标[23]。本研究发现，施用有机肥提高了有机冬瓜根区土壤细菌多样性Shannon指数，施用复合微生物肥提高了细菌丰富度ACE、Chao指数，游偲等同样发现，采用枯草芽孢杆菌菌剂处理后的烟草根际土壤细菌多样性指数和丰富度指数均提高[24]。多数植物病原菌来自真菌，康捷等发现，麻山药糊头病和根茎腐病发病植株土壤真菌多样性和丰富度均高于健康植株[25]，本研究显示，施用复合微生物肥能显著降低有机冬瓜根区土壤真菌群落丰富度，表明它在一定程度上能减少有机种植作物受病原真菌侵害的概率。有机肥可为土壤微生物的活动提供所需的碳源、氮源和能量，并可改善土壤微生态环境的理化性状，促进微生物的生长和繁殖，增加微生物数量[26];有机质被认为是影响土壤微生物动态的主要因素[27];本研究同样发现，施用有机肥会提高土壤细菌和真菌群落多样性及丰富度，土壤有机质含量也相应提高。

本研究发现，施用复合微生物肥和有机肥均会降低有机冬瓜根区土壤真菌丛赤殼科的相对丰度，同时，有机肥处理组土壤毛壳菌科真菌相对丰度升高。李发虎等发现，施用玉米秸秆生物炭后黄瓜结果期土壤子囊菌门毛壳菌科比例明显提高[28]。毛壳菌通过重寄生和产生毛壳素等抗生素对病原菌产生拮抗作用，是重要的植物病害生防真菌[29]。子囊菌门丛赤壳科（Nectricaceae）菌多属菌生真菌，可以寄生病原真菌[30]。可见，施用复合微生物肥有助于控制有机种植作物病害发生。

有机肥有机质含量高、养分全面、肥效长，在作物种植中发挥着改良土壤、改善土壤微生物群落结构、提高作物品质等作用[31]。本研究发现，复合微生物肥及有机肥的施用均能显著提高土壤过氧化氢酶和蔗糖酶活性;与对照组相比，有机肥处理在一定程度上提高了有机冬瓜果实硝酸盐含量，与汪峰等对大棚黄瓜施用有机肥的研究结果[32]一致;李瑞霞等研究表明，木霉NJAU4742生物有机肥处理的番茄果实硝酸盐含量降低[33]，本研究同样发现，施用复合微生物肥能显著降低有机冬瓜果实硝酸盐含量，可能与其中特定的微生物有关;同时，有机肥处理在一定程度上提高了土壤铵态氮、速效钾、速效磷和有机质等养分含量。曲成闯等同样发现，施用复合微生物肥能提高黄瓜不同生育期潮土土壤过氧化氢酶、脲酶活性[34]。研究表明，土壤微生物量关系到土壤肥力状况是否良好，它们之间存在显著相关性[35]。同样，土壤酶活性与土壤微生物关系密切，影响土壤微生物的因素同样影响土壤酶活性[31]。珊丹等发现，施用微生物菌肥的土壤中可培养细菌、真菌菌落数量均显著高于未施肥处理（P<0.05），而且细菌、真菌菌落数量与土壤蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶活性之间有一定的正相关性[36]。本研究中土壤微生物群落结构变化与过氧化氢酶、蔗糖酶活性显著变化的相关性还需进一步探讨。

土壤微生物类群复杂，微生物群落特征是多种微生物种群协同作用的结果，不能依照单一或某几个种群的变化阐释施肥对有机种植土壤微生物区系的影响，后续研究将进行长期定位连续观测，并对微生物群落特征与土壤化学性质及酶活性等相关指标进行相关性分析，进一步揭示其影响作用。本研究还发现，根区土壤微生物中未分类或未确定种属的物种受复合微生物肥和有机肥施用的影响，受限于数据库原因，未能解释，有待通过深度测序或利用其他先进手段对这些微生物进行更细致深入的分类研究。

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