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标题

鸡皮刺螨病的PCR诊断及18S rRNA·ITS·28S rRNA基因序列分析

范文

刘成倩李红高骏

摘要江苏某蛋鸡场发生体外寄生虫感染，经临检症状观察及镜检疑似鸡皮刺螨病。根据GenBank 中已登录的鸡皮刺螨基因组18S rRNA、ITS、28S rRNA基因的序列设计1对引物，采用PCR方法及测序鉴定确诊该体外寄生虫为鸡皮刺螨。对18S rRNA、ITS、28S rRNA基因序列进行了比对分析，并给出了治疗和防控建议。

关键词鸡皮刺螨;诊断;序列分析

中图分类号 S831.7 ?文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）18-0104-03

Abstract An ectoparasite infection occurred in a laying hen farm in Jiangsu Province. It was suspected to be Dermanyssus gallinae disease by clinical inspection and microscopically observation. A pair of primers were designed based on the 18S rRNA，ITS，28S rRNA sequence of D. gallinae registered in GenBank.The ectoparasite was identified to be D. gallinae by PCR and sequencing.The sequences of 18S rRNA，ITS，28S rRNA were compared and analyzed， and some treatment and recommendations of control measures were given.

Key words Dermanyssus gallinae;Diagnosis;Sequence analysis

雞螨病是由多种对鸡有侵袭、寄生特性的螨类引起发生的，以鸡群表现为易惊恐、食欲减退、贫血、消瘦等症状的鸡体内外寄生螨病的统称[1-2]。螨虫在全球许多地区流行，对养鸡行业造成了威胁，并影响鸡的健康和福利。引起鸡螨病的螨虫种类很多，较常见的螨虫包括鸡皮刺螨和北方域螨[3]。

鸡皮刺螨（Dermanyssus gallinae）因吸血后会变成红色又称为血螨或红螨，是寄生在鸡表皮上、附着于羽毛上的一种体外寄生虫，以泄殖腔周围寄生较为常见，大量的螨虫寄生易导致尾羽聚成束状[4-5]。由于虫体可以脱离鸡体，在自然环境中长期存活，常规消毒药很难杀灭它，所以会在一定区域内长时间发生流行。鸡皮刺螨不仅引起鸡只骚动不安、采食量下降、贫血、生产性能下降，而且鸡皮刺螨可以携带并传播多种病原体（如沙门氏菌等），也会叮咬饲养人员，对人类的健康造成威胁[6]，因此对鸡螨虫的防治要引起高度重视。规模化养殖场鸡只饲养密度高，温湿度较为恒定，更易于螨虫的生存繁殖，经常发生暴发，严重影响蛋鸡及肉鸡的生长、生产性能。江苏某鸡场发生体外寄生虫感染，通过样品采集、显微镜镜检及PCR检测比对分析确诊为鸡皮刺螨病。

1 材料与方法

1.1 样品采集用蘸有水的棉签，黏附鸡槽或鸡体上的虫体，放入容器中密封保存。

1.2 显微镜观察将虫体置于干净的载玻片上，滴加1滴松柏油，加上盖玻片，使虫体散开，在显微镜下观察。

1.3 鸡皮刺螨PCR检测

1.3.1 引物的设计与合成及DNA抽提。

根据GenBank数据库已公开的鸡皮刺螨18S rRNA、ITS、28S rRNA 基因碱基序列，利用Primer 5.0软件设计了l对特异性引物，引物预扩增片段大小为519 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。特异性引物序列如下：F1为TAGGTGAACCTGCGGAAGGATC;R1为AGTTCAGCGGGTCGTCACACTTG。DNA 的抽提按照DNA抽提说明书进行。

1.3.2 PCR扩增。PCR 反应体系（50 μL）：DNA模板2.0 μL，10×Buffer（不含Mg2+） 5.0 μL， MgSO4 ?4.0 μL，dNTP（2 mmol/L）5.0 ?μL，F1/R1（10 μmol/L）各1.5 μL，KOD-Plus 酶 2.0 ?μL，ddH2O 29.0 ?μL。PCR反应条件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s，55 ℃ 35 s，68 ℃ 60 s，循环35次;最后 68 ℃ 延伸 10 min。

1.4 序列分析和数据处理

将扩增结果中条带亮的PCR产物送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行纯化测序。用DNASTAR 软件包中的SeqMan 软件对获得的基因序列进行校对和编辑，并在 NCBI网站的GenBank中搜寻最相关序列进行比对分析，使用DNAstar MegAlign 软件进行同源性分析及进化树建构。

2 结果与分析

2.1 临诊症状

江苏某蛋鸡场发生体外寄生虫感染，鸡只喙食羽毛，鸡群表现躁动不安;鸡只出现贫血、消瘦，减蛋及蛋品质下降;在鸡蛋上可见迅速移动的小黑点。

2.2 显微镜观察结果

虫体呈淡红色，吸血后呈棕黑色，长椭圆形，后部略宽，体表布满短绒毛，有4对长足，假头前生有细长针状螯枝1对（图1）。

2.3 PCR检测结果以抽提的虫体基因组DNA为模板，以F1/R1为引物进行PCR扩增，得到的扩增片段约519 bp（图2），与预期结果相符。

2.4 鸡皮刺螨18S rRNA、ITS、28S rRNA 基因序列的测序

经PCR产物测序，得到鸡皮刺螨18S rRNA、ITS、28S rRNA 基因浙江分离株基因序列，命名为JS-D.gallinae（图3）。

2.5 序列分析结果

将获得的JS-D.gallinae基因与GenBank数据库中相似的核苷酸用DNAMAN 软件进行同源性比较和进化树分析。从同源性结果来看，JS-D.gallinae序列与日本地区的LCO34921、LCO34936、LCO34939、LCO34949、LCO34950、LCO34953TO同源率达100%。从系统进化树来看，JS-D.gallinae株和日本地区的LCO34921、LCO34936、LCO34939、LCO34949、LCO34950、LCO34953TO在同一进化分支，亲缘关系相同（图4、5）。

3 討论

鸡皮刺螨的感染会影响蛋鸡的产量，降低饲料转化率，会导致禽类变得不安和烦躁，但鸡皮刺螨是一种非常有弹性的禽类寄生虫，繁殖周期的速度与温度有关，如果温度适宜，可迅速大量增殖[7]。由于螨的特殊生物习性，传播快，很难从鸡舍内清除，必须采取综合性防治策略[8-9]。对于严重感染的群体，可用高效、低毒杀螨剂对感染鸡全身浸泡灭虫，对鸡舍、室内墙壁可用防虫剂全方位湿淋喷雾处理。

传统的鸡皮刺螨病的诊断方法一般都是通过形态学观察。为了从分子水平上来确诊[10]，根据鸡皮刺螨18S rRNA、ITS、28S rRNA 基因序列设计了1对特异性引物，经PCR反应扩增出大小519 bp的片段，经序列分析可以看出该例鸡皮刺螨序列与其他地区序列的同源性为99.6%～100%，同源性很高。18S rRNA、ITS、28S rRNA 基因序列的保守性很强，可作为诊断鸡皮刺螨病的基因序列，这为探索出适于诊断鸡皮刺螨病的方法提供了科学依据。

4 结论

江苏某蛋鸡场发生的体外寄生虫感染确诊为鸡皮刺螨病，建议采取综合性防治策略。

参考文献

[1] 王玉田，郑瑞峰，刘泉，等.鸡皮刺螨病的诊断与防治[J].养禽与禽病防治，2015（5）：17-18.

[2] 王海杰.北方地区鸡螨病的诊断与治疗[J].中国动物保健，2019（5）：36-37.

[3] 孙桂芹.鸡螨的发生与防治[J].中国动物保健，2018（6）：60-62.

[4] 朱继祖.蛋鸡鸡刺螨的治疗[J].中兽医医药杂志，2018，37（4）：80-81.

[5] 姜琪.蛋鸡刺皮鸡螨的防治措施[J].畜牧兽医科技信息，2014（2）：107.

[6] 樊琼.一例种鸡皮刺螨病诊断与治疗[J].中国畜禽种业，2017（3）：138.

[7] 李婵.鸡红螨的防治[J].广西畜牧兽医，2017，33（6）：299-300.

[8] 赵佳怡，李豪，李环，等.鸡皮刺螨防控技术研究进展[J].中国家禽，2019，41（9）：48-52.

[9] 蔡惠娴.浅谈畜禽疾病的病因及控防对策[J].兽医导刊，2019（22）：30.

[10] CHU T T H，MURANO T，UNO Y，et al.Molecular epidemiological characterization of poultry red mite，Dermanyssus gallinae，in Japan[J].J Vet Med Sci，2015，77（11）：1397-1403.

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