《杀菌温度对乳化香肠腐败菌群的影响与靶向抑制》-工学论文，食品科学与工程论文-论文范文参考-科学狗论文网

标题

杀菌温度对乳化香肠腐败菌群的影响与靶向抑制

范文

潘晓倩张顺亮李素乔晓玲陈文华李家鹏曲超赵燕

摘要：采用90、95、100、105、110 ℃ 5 種温度对塑料肠衣灌装的乳化香肠进行杀菌，杀菌时间均为20 min，研究25 ℃贮藏过程中不同杀菌温度乳化香肠中腐败菌的多样性变化及菌群变化规律，并测定8 种抑菌剂对分离所得菌株的抑制效果。结果表明：随着杀菌温度的升高，以菌落总数为指标的产品货架期越长，分离得到的腐败菌菌相也趋于简单。经比较分类，从不同杀菌温度样品中共分离得到10 株腐败菌，根据形态学、16S rDNA菌种鉴定和生理生化特征分析，分离得到的10 株腐败菌均为芽孢杆菌属。8 种抑菌剂对10 株腐败菌表现出不同的抑制效力，其中乳酸链球菌素（nisin）和ε-聚赖氨酸具有普遍、明显的抑菌活性；葡萄糖酸-δ-内酯、乳酸钠和双乙酸钠对多数菌株抑制效果良好；山梨酸钾、亚硝酸钠和脱氢乙酸钠仅选择性地对个别菌株表现出一定的抑制作用。结合不同杀菌温度乳化香肠的腐败菌菌相分析结果，90、95、100 ℃杀菌样品可以选择nisin和ε-聚赖氨酸作为抑菌剂；105、110 ℃杀菌样品可以根据生产需求选择nisin、ε-聚赖氨酸、乳酸钠和双乙酸钠4 种抑菌剂。

关键词：杀菌温度；乳化香肠；腐败菌；微生物多样性；抑菌剂

Effect of Sterilization Temperature on Spoilage Bacteria in Emulsified Sausages and Targeted Inhibition

PAN Xiaoqian， ZHANG Shunliang， LI Su， QIAO Xiaoling， CHEN Wenhua， LI Jiapeng， QU Chao， ZHAO Yan*

（Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology， China Meat Research Center， Beijing 100068， China）

Abstract： Emulsified sausages stuffed in plastic casing were subjected to two-stage sterilization at different temperatures （90， 95， 100， 105 and 110 ℃； 20 min for each temperature） before storage at 25 ℃. The spoilage bacterial diversity and community in emulsified sausages were investigated as a function of storage time. We also measured the inhibitory potency of 8 bacteriostatic agents on these spoilage bacteria. The results showed that as the sterilization temperature increased， the shelf-life was extended as indicated by measurement of total colony count， and the diversity of spoilage bacteria was reduced. A total of 10 spoilage bacterial strains were isolated from the sterilized samples， and they were all identified as Bacillu according to morphological observations， 16S rDNA gene sequence alignment and physio-biochemical identification. Eight bacteriostatic agents exhibited different antibacterial effects on these bacterial strains. Of these agents， nisin and ε-poly-L-lysine （ε-PL） had remarkable broad-spectrum inhibitory activity. Glucono-δ-lactone， sodium lactate and sodium diacetate had good bacteriostatic efficacy against most strains. But potassium sorbate， sodium nitrite， sodium dehydroacetate selectively showed inhibitory effect on very few strains. Taken together， nisin and ε-PL were selected for emulsified sausages sterilized at 90， 95 and 100 ℃， and nisin， ε-PL， sodium lactate and sodium diacetate were selected for emulsified sausages sterilized at 105 and 110 ℃.

Keywords： sterilization temperature； emulsified sausages； spoilage bacteria； microbial diversity； bacteriostatic agent

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201801001

中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）01-0001-08

引文格式：

潘晓倩，张顺亮，李素，等. 杀菌温度对乳化香肠腐败菌群的影响与靶向抑制[J]. 肉类研究， 2018， 32（1）： 1-8. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201801001. http：//www.rlyj.pub

PAN Xiaoqian， ZHANG Shunliang， LI Su， et al. Effect of sterilization temperature on spoilage bacteria in emulsified sausages and targeted inhibition[J]. Meat Research， 2018， 32（1）： 1-8. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201801001. http：//www.rlyj.pub

乳化香肠是指原料肉经腌制、斩拌、灌装、熟化等加工工艺制成的一种即食肉糜类制品[1]，口感鲜嫩、工艺简单，在我国有着广阔的市场占有率。热杀菌是目前包括乳化香肠在内的熟肉制品普遍采用的杀菌方式，具有杀菌效果好、成本较低和操作简便的优点[2]。在肉制品热杀菌过程中，杀菌温度是影响产品品质与安全性的重要条件，根据杀菌温度的差异，目前市场上流通的乳化香肠产品主要分为高温（121 ℃高温高压殺菌）和低温（巴氏杀菌）产品2 种[3]。高温杀菌产品能够常温贮藏，货架期较长，但感官品质[4]、风味[5-6]及营养[7-8]等均受到很大损害；低温杀菌产品最大程度保留了肉制品的营养和风味，肉质鲜嫩，但其流通和贮藏需要完整的冷藏链支持，且货架期较短[9]。

为了满足市场需求，许多肉制品企业尝试降低杀菌温度（90～110 ℃），采用亚高温杀菌[10]并适当增加其他防腐保鲜技术，以保证产品既能在常温条件下流通和贮藏，同时具有良好的风味和口感[11]。虽然降低杀菌温度能够杀灭大部分细菌的营养体，杀菌效果优于低温杀菌，但并不能彻底杀灭细菌芽孢和真菌孢子等小部分极耐热微生物[12-13]，常温贮藏时，肉制品中残存的微生物经过一定程度的修复和适应过程，将再次生长繁殖并产生相关代谢产物，最终导致产品的腐败变质[14]。因此，特定杀菌条件下腐败微生物的菌群结构分析是研究如何延长产品货架期的依据。熟肉制品的腐败微生物菌

群结构主要取决于原、辅料、肉制品组分和杀菌保鲜工艺等[15-16]，此外，产品包装方式、流通和贮藏条件也在一定程度上影响腐败菌的菌相构成[17-18]。目前，包括乳化香肠在内的熟肉制品中腐败微生物的研究主要集中于低温杀菌产品[16，19]。研究表明，乳杆菌属、明串珠菌属、热杀索丝菌属和魏丝菌属等乳酸菌是低温熟肉制品中的主要腐败微生物，此外还有假单胞菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属等[20-21]。国内外关于90～110 ℃杀菌温度条件下熟肉制品中腐败微生物的分离鉴定及多样性变化研究鲜有报道。

本研究以塑料肠衣灌装的乳化香肠为研究对象，根据实际生产需求，设定90、95、100、105、110 ℃ 5 种杀菌温度，杀菌时间均为20 min，分析不同杀菌温度的乳化香肠在常温（25 ℃）贮藏过程中菌落总数的超标情况，并对其腐败菌菌株进行分离。应用生理生化方法与16S rDNA基因序列分析相结合对分离得到的腐败菌菌株进行鉴定，并比较不同杀菌温度的乳化香肠中腐败菌的多样性变化；同时探讨8 种肉制品常用防腐剂对腐败菌生长繁殖的抑制效果，以期为实际生产中针对不同杀菌温度（90～110 ℃）的乳化香肠产品提供特定、有效的抑菌剂添加方案以及其他肉制品的腐败微生物控制、货架期延长和产品保鲜提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉北京中瑞食品有限公司；食盐、白砂糖、大豆蛋白、玉米淀粉中国肉类食品综合研究中心香辛料部；塑料肠衣北京德茂科贸有限公司；平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基、营养肉汤北京陆桥技术有限责任公司。

亚硝酸钠、双乙酸钠北京迪朗生化科技有限公司；

乳酸链球菌素（nisin）、ε-聚赖氨酸兰州伟日生物工程有限公司；葡萄糖酸-δ-内酯安徽省兴宙医药食品有限公司；山梨酸钾、乳酸钠、脱氢乙酸钠北京天竹鸟食品添加剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix 天根生化科技有限公司；溶菌酶北京索莱宝科技有限公司；引物27F（5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3）和1492R（5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3）英潍捷基（北京）贸易有限公司。所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WH82绞肉机、K20 Ras V斩拌机德国Seydelmann公司；杀菌釜诸城中泰机械有限公司；G154DWS全自动高压灭菌锅美国致微仪器有限公司；

B2二级生物安全柜新加坡Esco公司；F1-45恒温培养箱

日本三洋公司；Scientz-11L无菌均质器宁波新芝生物科技股份有限公司；T100 Thermal Cycler PCR仪

美国Bio-Rad公司；Eppendorf 5417离心机艾本德中国有限公司；ZEISS primo star生物显微镜（配有相差

功能）北京普瑞赛司仪器有限公司；Bioscreen全自动生长曲线分析仪上海谓载商贸发展有限公司；VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪北京威泰科生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳化香肠加工工艺

乳化香肠加工工艺：原料肉→空气自然解冻→分割修整→绞肉→斩拌（过程中依次加入香辛料、辅料和脂肪）→灌肠→杀菌→冷却→成品

乳化香肠配方：猪瘦肉80 g、猪脂肪20 g，食盐2.2%、白砂糖1.5%、味精0.2%、卡拉胶1.0%、马铃薯淀粉5.0%、大豆分离蛋白2.0%、亚硝酸钠0.006%、三聚磷酸盐0.3%、异抗坏血酸钠0.1%、红曲红0.1%、五香粉0.4%、冰水35%（均以原料肉的总质量计）。杀菌工艺条件：设定90、95、100、105、110 ℃ 5 种杀菌温度，杀菌时间均为20 min。

1.3.2 菌落总数测定

将乳化香肠成品置于室温（25 ℃）贮藏，间隔不同时间取样（90、95 ℃杀菌样品每天取样，其他样品取样间隔时间有所变化，根据样品情况，后期取样的间隔时间逐渐缩短，尽量找到样品腐败的准确时间点）。参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[22]测定样品的菌落总数，记录其超出

GB 2726—2016《食品安全国家标准熟肉制品》[23]中规定时的贮藏时间。

1.3.3 菌株分离鉴定

从每组样品贮藏过程中的PCA平板上挑取不同形态的单菌落，并反复划线纯化，获得单菌株，甘油保藏。

1.3.3.1 菌落与细胞形态观察

对分离纯化得到的单菌落进行菌落形态观察，包括其形状、质地、隆起度等特征，并结合革兰氏染色观察细胞形态，采用相差显微镜观察是否有芽孢产生及芽孢形状。将从不同贮藏时期的每组样品中分离得到的菌株进行比较后，重新标记并保藏。

1.3.3.2 分子生物学鉴定

利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，并以此为模板，采用通用引物27F和1492R扩增16S rDNA序列。PCR扩增反应体系：2×Taq PCR MasterMix 25 μL、ddH2O 21 μL、DNA模板2 μL、引物27F和1492R各1 μL；PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物经凝胶电泳检验后，送英潍捷基（北京）贸易有限公司测序。

1.3.3.3 生理生化鉴定

将待测菌株接种至PCA培养基，37 ℃培养18～24 h，挑取纯菌落，制备1.8～2.2 麦氏浊度的菌悬液，插入BCL鉴定卡片，用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪进行鉴定。

1.3.4 抑菌剂的筛选

抑菌剂配制：根据GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[24]中防腐剂在肉制品中的添加限量及实际生产经验，称取相应质量（精确到0.001 g）的8 种防腐剂（表1），加入无菌水充分溶解，并用0.45 μm无菌滤膜过滤除菌。

采用液体培养抑制测定法[25]，并略作修改。将待测菌株接种至营养肉汤中活化2 次，获得浓度为107～108 CFU/mL的菌悬液。将500 μL配制好的抑菌剂溶液和100 μL菌悬液加入到4.4 mL营养肉汤中，使每种抑菌剂的终质量浓度如表1所示，充分振荡后取300 μL于生长曲线分析仪配套的比色板中，并以无菌生理盐水替代抑菌剂作为对照。将比色板置于37 ℃条件下持续振荡培养24 h，每隔1 h测定其在600 nm波长处的光密度（OD600 nm），以培养时间为横坐标，OD600 nm为纵坐标，绘制8 种抑菌剂对待测菌株的抑菌动力学曲线。每组样品均平行测定3 次，取平均值。

1.4 数据处理

采用Excel 2007软件进行数据处理并作图，用MEGA 5.0软件绘制菌株系统发育树。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌温度乳化香肠的货架期

菌落总数是反映乳化香肠腐败程度的最直接指标。由表2可知，当杀菌时间均为20 min，杀菌温度分别为90、95、100、105、110 ℃时，乳化香肠产品的货架期分别为11、18、50、88、110 d，这表明杀菌工艺对微生物污染的抑制效果有所影响，其中杀菌温度是影响产品中微生物残留数量和产品货架期的重要因素。同批次生产的乳化香肠可以认为初始污染微生物相同，经过不同温度杀菌后，产品中残留微生物的种类、数量及热损伤程度均发生不同程度的变化，导致后期贮藏过程中不同微生物的生长繁殖和相互作用，从而形成不同的微生物菌群结构[26]。

2.2 菌株的分离与菌落形态学观察

采用稀释平板法和划线分离法，分别从90、95、100、105、110 ℃杀菌乳化香肠样品贮藏过程中筛选到7、6、5、3、1 株特征菌，再经革兰氏染色观察细胞形态，相差显微镜观察是否有芽孢产生及芽孢形状，通过反复比较归类，共从5 种样品中分离出10 种典型菌，分别命名为M1～M10。革兰氏染色镜检发现这10 株菌均为杆菌，且生长过程中产生芽孢，各菌株的菌落形态和基本特征如图1和表3所示。90 ℃杀菌样品中分离出的7 种腐败菌包括M1～M5、M7和M8；95 ℃杀菌样品中分离出的腐败菌包括M1、M2、M5～M7和M10；100 ℃杀菌样品中分离出的腐败菌包括M3、M5、M7、M8和M10；105 ℃杀菌样品中分离出的腐败菌包括M8～M10；110 ℃杀菌样品中分离出的腐败菌仅有M10。

2.3 菌株的16S rDNA基因序列分析

将菌株M1～M10的16S rDNA测序结果在NCBI网站上进行BLAST比对，初步判定M1和M2为类芽孢杆菌属（Paenibacillus），M3为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），M5为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），M6為枝芽孢杆菌属（Virgibacillus），M7为浸麻类芽孢杆菌（Paenibacillus macerans），M8为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），M9为赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus），M10为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。M4的比对结果为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），但其最高序列一致性为97%，需进一步验证。

利用MEGA 5.0软件，选取与菌株M1～M10同源性分析得分最高的9 个菌株构建系统发育树。由图2可知，除菌株M4位于单独的分支，其余9 株菌均与各自鉴定的菌种位于同一分支。

2.4 菌株的生理生化鉴定

由2.3节的分析结果可知，分离得到的10 株菌均为芽孢杆菌，因此选择BCL鉴定卡，通过VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪对菌株M1～M10进行生理生化特征鉴定。在16S rDNA基因序列同源性比对结果的基础上，结合生理生化鉴定得出各菌株的种属。由表4可知，M1为多黏类芽孢杆菌（P. polymyxa），M2为解糖类芽孢杆菌（P. glucanolyticus），M3为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens），M4为地衣芽孢杆菌

（B. licheniformis），M5为凝结芽孢杆菌（B. coagulans），M6为铫子短芽孢杆菌（B. choshinensis），M7为浸麻类芽孢杆菌（P. macerans），M8为蜡样芽孢杆菌

（B. cereus），M9为梭形赖氨酸芽孢杆菌（L. fusiformis），M10为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）。

2.5 不同杀菌温度乳化香肠中腐败菌的多样性变化分析

对不同杀菌温度乳化香肠样品贮藏期间分离得到的菌株进行反复纯化、对比分类并鉴定，得到各样品的主要腐败菌组成。由表5可知，5 种样品25 ℃贮藏过程中的主要腐败菌为芽孢杆菌，这可能与杀菌工艺与贮藏温度有关。原料肉中的一些常见腐败菌，如假单胞菌、肠杆菌等，其耐热性通常较差[21]，90 ℃以下的温度即可杀灭，而芽孢杆菌耐热性强，且常温流通及贮藏条件有利于芽孢杆菌的迅速增殖[27]。

随着杀菌温度的升高，不同样品的腐败菌菌相趋于简单。多黏类芽孢杆菌和解糖类芽孢杆菌主要存在于杀菌温度100 ℃以下的样品中；地衣芽孢杆菌仅存在于90 ℃杀菌样品中；凝结芽孢杆菌和浸麻类芽孢杆菌存在于105 ℃以下的杀菌样品中，这可能与其耐热性有关，即当杀菌温度超过某一值时将被完全杀灭；解淀粉芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌分别存在于杀菌温度低于105 ℃和110 ℃的样品中；铫子短芽孢杆菌和梭形赖氨酸芽孢杆菌仅分别存在于95 ℃和105 ℃杀菌样品中；除90 ℃杀菌样品外，其余样品中均分离到枯草芽孢杆菌，这种在较高杀菌温度样品中存在的腐败菌并未从低温杀菌样品中分离到的情况可能是由于样品中残留微生物的相互作用使不同杀菌温度样品中的优势菌种类和比例发生变化，如某些菌株的快速生长对其他微生物产生一定的抑制作用，导致其数量较少而未被检出[26]。

2.6 8 种防腐剂对腐败菌的抑菌能力分析

一般认为，菌体数量与培养基浊度成正比[25]。由图3

可知，亚硝酸钠仅在前6 h内对M5（凝结芽孢杆菌）的抑菌效果较好，6 h后菌体开始生长繁殖，亚硝酸钠对其他9 种腐败菌均未表现出抑菌作用。山梨酸钾对M1和M2 芽孢杆菌的抑菌作用较强，对M7和M8也有一定的抑制效果，但对其他6 种腐败菌无任何抑菌效果。除M3外，脱氢乙酸钠对各菌株均有一定程度的抑制作用。葡萄糖酸-δ-内酯对M5和M10的抑菌效果相对较差，但能够有效抑制其他几种腐败菌的生长。乳酸钠能够分别抑制M3在12 h内和M5在14 h内的生长，且能够抑制其他菌株24 h内的生长繁殖。双乙酸钠在12 h内抑制M5的生长，且能抑制其他菌株24 h内的生长繁殖。Nisin和ε-聚赖氨酸对10 株腐败菌的生长均表现出明显的抑制作用。

结合不同杀菌温度乳化香肠中腐败菌的多样性分析，由于90、95、100 ℃杀菌样品中均分离得到菌株M5，而nisin和ε-聚赖氨酸对M5的抑菌效果最好，同时可以有效抑制这3 种杀菌温度产品中的其他腐败菌，因此可以作为这3 种杀菌温度产品的抑菌剂。根据105、110 ℃杀菌样品中的腐败菌种类，可以根据生产需求选择Nisin、ε-聚赖氨酸、乳酸钠和双乙酸钠4 种抑菌剂。

ε-聚赖氨酸是由赖氨酸单体通过ε-酰胺键形成的多肽，可以完全被人体消化吸收，是一种新型的天然食品添加剂，抑菌谱广，对革兰氏阴性细菌具有非常好的抑菌效果，在国外已广泛应用于酸乳、方便食品及肉制品中，国内应用还相对较少[28-29]。本研究发现，ε-聚赖氨酸对分离得到的10 株腐败菌抑菌效果明显，其可以应用于不同杀菌温度的肉制品保鲜领域，具有广阔的前景。Nisin是目前应用非常广泛的一种生物防腐剂，它对本研究中10 株芽孢杆菌均具有良好的抑菌效果，與李伟丽等[30]的报道一致，且它与ε-聚赖氨酸共同使用具有协同增效作用[31]。

3 结论

采用90、95、100、105、110 ℃ 5 种温度对塑料肠衣灌装的乳化香肠进行杀菌，杀菌时间均为20 min。结果表明，90、95、100、105、110 ℃杀菌样品分别在常温（25 ℃）贮藏11、18、50、88、110 d时，其菌落总数测定结果超出了GB 2726—2016《食品安全国家标准熟肉制品》[23]中的相关规定。5 种样品中共分离得到10 株腐败菌，分别为M1多黏类芽孢杆菌、M2解糖类芽孢杆菌、M3解淀粉芽孢杆菌、M4地衣芽孢杆菌、M5凝结芽孢杆菌、M6铫子短芽孢杆菌、M7浸麻类芽孢杆菌、M8蜡样芽孢杆菌、M9梭形赖氨酸芽孢杆菌和M10枯草芽孢杆菌。随着杀菌温度的升高，从不同样品的贮藏过程中分离得到的腐败菌菌相也趋于简单。90 ℃杀菌样品中分离出的腐败菌包括M1～M5、M7和M8；95 ℃杀菌样品中的腐败菌包括M1、M2、M5～M7和M10；100 ℃杀菌样品中的腐败菌包括M3、M5、M7、M8和M10；105 ℃杀菌样品中的腐败菌包括M8～M10；110 ℃杀菌样品中的腐败菌仅有M10。8 种常见抑菌剂对这10 株腐败菌表现出不同的抑菌效力，其中Nisin和ε-聚赖氨酸对10 株腐败菌均具有明显的抑菌作用；葡萄糖酸-δ-内酯、乳酸钠和双乙酸钠对多数菌株的抑菌效果良好；山梨酸钾、亚硝酸钠和脱氢乙酸钠选择性地对个别菌株表现出一定的抑制作用。结合不同杀菌温度乳化香肠的腐败菌菌相分析结果，90、95、100 ℃杀菌样品可以选择Nisin和ε-聚赖氨酸作为抑菌剂；105、110 ℃杀菌样品可以根据生产需求选择Nisin、

ε-聚赖氨酸、乳酸钠和双乙酸钠4 种抑菌剂。

微生物的生长繁殖是影响熟肉制品货架期的决定性因素，本研究探究了杀菌温度对乳化香肠腐败菌群的影响与靶向抑制，为乳化香肠及其他熟肉制品中主要腐败菌的靶向抑制及产品货架期的进一步延长提供理论参考。有关这些微生物菌株的致腐能力以及肉制品中不同组分与抑菌剂的相互作用及其对腐败菌耐热性的影响等还需进一步开展研究。

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