中华鳖暗温室养殖水体理化因子及微生物多样性分析
常晓 张菊 张艳芹 闫保国 管越强
摘 要：暗温室是中华鳖（Pelodiscus sinensis）人工养殖的主要方式之一。为阐明中华鳖暗温室养殖过程中高氮水体和低氮水体中微生物多样性及其与环境因子的关系，在河北省鹿泉中华鳖暗温室养殖池挑选了总氮浓度较高的池塘和总氮浓度较低的池塘进行了水体理化因子监测和微生物多样性对比分析。水体理化因子检测结果显示两种水体的温度均在30 ℃左右，pH值为7左右，符合中华鳖的养殖要求。两种水体的溶解氧为0.25 mg/L左右。高氮水体的总氮、氨氮、亚硝态氮、硝态氮的浓度相较于低氮水体均比较高。高氮与低氮水体在各分类水平上的优势菌群均存在差异，低氮水体绿屈扰菌门（Chloroflexi）占据主要优势，而高氮水体中变形菌门（Proteobacteria）占主要优势，属水平层次上低氮水体中的优势菌为束缚杆菌属（Haliscomenobacter）、亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）。高氮水体多核杆菌属（Polynucleobacter）、亮杆菌属（Leucobacter）占据优势地位，两种水体物种丰富度及相似度存在差异。结果表明高氮与低氮水体不仅在总氮和无机氮浓度上差别较大，微生物多样性也存在明显差距，微生物区系不同可能是造成氮浓度差异的原因之一。
关键词：中华鳖（Pelodiscus sinensis）;微生物多样性;暗温室养殖;理化因子;环境调控
中华鳖口感鲜美，含有丰富的蛋白质、维生素以及微量元素，是一种高蛋白低脂肪的食物原料，长期以来一直被视为珍品，市场需求高涨[1]。中华鳖现有养殖模式主要有日光棚集约化养殖、暗温室高密度养殖、日光棚+暗温室两段式养殖、仿生态养殖等[2]。高密度的暗温室养殖养殖密度大、产量高，优点是光线较弱，中华鳖互相撕咬现象明显减少，缺点是水体中残饵和粪便积累，养殖水体污染严重，患病几率增加。本实验通过对河北省鹿泉中华鳖暗温室高氮和低氮养殖水体进行水质理化参数监测和微生物多样性分析，阐明水体环境参数和微生物区系组成，为改善养殖水体水质特别是减少氮源污染，实现中华鳖健康养殖提供参考依据。
1 材料和方法
1.1 样品采集
分别取中华鳖良种场暗温室两个池塘养殖水体样品，总氮浓度较高的养殖池塘，记为H-N，总氮浓度较低的养殖池塘，记为L-N。分别在两个池塘的左、中、右位置取水，每个池塘取3个水样，用于水质监测和微生物多样性分析。
1.2 水体理化因子分析
现场采样过程中，采用YSI pH100A便携式酸度计测定pH值，采用YSI DO200便携式溶氧仪测定溶解氧浓度。水样带回实验室测定总氮、氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮等化学指标。总氮采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法进行测定，氨氮采用纳氏试剂-分光光度法进行测定，亚硝酸盐采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法进行测定，硝酸盐采用紫外分光光度法进行测定[3]。
1.3 水体微生物多样性分析
1.3.1 样品处理 过滤前静置分离悬浮颗粒，用20 μm大孔径滤膜预过滤一遍，再用0.22 μm微孔滤膜进行抽滤，水样过滤之后，将微生物富集的滤膜装在50 mL离心管中，在-80 ℃冰箱中保存。
1.3.2 DNA提取、PCR和高通量测序 水体微生物多样性由上海派森诺生物科技股份有限公司进行测定。提取总DNA，采用NanoDrop 2000超微量分光光度计对DNA进行浓度和质量检测，设计简并引物：520F：5-barcode+AYTGGGYDTAAAGNG-3， 802R： 5-TACNVGGGTATCTAATCC-3扩增细菌16S rRNA V4区 （C，T = Y; G，A，T = D; A，C，G = V; A，C，G，T =N） 。PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并进行磁珠纯化回收。回收产物采用酶标仪Microplate reader（BioTek，FLx800）测定浓度，所用试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit。根據测定的浓度，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库，最后上机进行高通量测序。
1.3.3 测序数据的筛查与处理 运用QIIME 2软件切除序列的引物片段，弃去未匹配引物的序列。随后，通过QIIME 2软件调用DADA2进行质控、去噪、拼接、去嵌合体序列获取高质量的数据。
1.3.4 物种分类学注释 对于细菌或古菌的16S rRNA基因，默认选用Greengenes数据库。对于每个ASVs的特征序列或每个OTU的代表序列，在QIIME2软件中使用默认参数，使用预先训练好的Naive Bayes分类器进物种注释。
1.3.5 α-多样性分析 多样性是指局部均匀生境下的物种在丰富度（richness）、多样性（diversity）和均匀度（evenness）等方面的指标[4]，也被称为生境内多样性，反映的是单个样品中的物种多样性。采用香农-威纳多样性指数（Shannon-Wiener diversity index）、辛普森多样性指数（Simpson diversity index）、Chao1指数、Pielou均匀度指数（Pielou evenness index）和覆盖率（Coverage）对6个样品中微生物的α-多样性进行比较和分析[5]。样品中的群落多样性用香农-威纳多样性指数[6]和辛普森指数估算，样品中的物种总数（OTU数目的指数）用Chao1[7]算法估计，样品中群落的均匀度用Pielou均匀度指数估算，用样品文库的覆盖率[8]评价测序结果的真实性。
1.3.5 物种差异分析及标志物种 为了探究微生物群落组成上的差异（即β-多样性），了解微生物群的差异主要是由哪些物种的差异分布所导致的，借助ASV/OTU维恩图、物种组成热图、LEfSe分析等方法来进行分析，进一步展示样品间的物种差异。
2 结果与分析
2.1 水体理化因子检测结果
水体的现场水质监测结果显示，低氮水体温度为30.0 ℃，pH值为7，溶解氧为0.25 mg/L，高氮水体温度为30.1 ℃，pH值为7，溶解氧为024 mg/L。实验室检测结果显示高氮水体总氮、氨氮、亚硝态氮和硝态氮的浓度均高于低氮水体（表1）。
2.2 微生物多样性检测结果
2.2.1 物种分类学注释 通过与数据库Greengenes比对，进行物种注释，可得到分类学注释结果统计表（表2）并对不同分类层级统计，分别对应各样本中能分类至界、门、纲、目、科、属、种的OTU数。发现低氮养殖池中LN-1只能分类到界的OTU数为11个，分类到门的OTU数为4个，分类到纲水平上的OTU数为55个，以此类推。
2.2.2 物种组成分析 将每个注释上的物种归类于不同的分类水平，并将OTU在不同样品中的序列数进行整理分析，不同样本在各分类水平所含有的分类单元的数目（表3）。LN-1样本包含有22个门、43个纲、90个目、125个科、161个属和47个种，以此类推。
根据物种组成结果分析，可得到各样本在门、纲、目、科、属水平上最大丰度排名前二十的物种，生成物种组成柱状图（图1，见封三）。以便直观查看各样本在不同分类水平上，相对丰度较高的物种及其比例（表4）。2.2.3 α-多样性分析
样品的覆盖度（Coverage）相同，均为0.99，说明测定结果能够代表样品的真实情况。低氮水体中香农-威纳指数（Shannon-Weiner Index）和辛普森指数（Simpson index）相较于高氮池较高，即低氮池中的细菌群落多样性更为丰富。高氮水体的均匀度指数（Pielou index）比低氮水体高，说明高氮水体群落中个体分配上的均匀性比低氮水体高。低氮水体的Chao1指数相较于高氮水体较高，说明低氮水体细菌群落丰富度较高（表5）。2.2.4 水体菌群差异分析 为了进一步分析样品间菌群群落复杂度的差异，分别做主坐标分析（Principal coordinates analysis，PCoA）和 UPGMA 聚类树分析（如图2和图3）。由主坐标分析可以看出代表低氮和高氮养殖水体平行样品的三个点距离相近而两组样品间距离较远，说明低氮池和高氮池中平行样品间的群落组成相似，而低氮和高氮养殖池间群落组成差异较大。UPGMA 聚类树分支长度越短代表两样品越相似，低氮和高氮养殖池三个平行样品之间的相似度较高，而两个养殖池间的群落差异较大。
2.2.5 基于OTUs的维恩图分析 为了解不同的样本组间有哪些物种是共有的，哪些是独有的，分析不同样本之间共有、特有的OTUs得到以下维恩图（图4）。可以看出低氮池特有的1 776个OTUs，高氮池特有1 240个OTUs，低氮池和高氮池共有296个OTUs，表明低氮养殖池的物种丰富程度高，并且低氮养殖池与高氮养殖池的物种差异较大。2.2.6 物种组成热图 为了比较样本间的物种组成差异，实现对各样本的物种丰度分布趋势的了解，使用属水平的分类单元组成作为分析对象，使用平均丰度前20位的属的丰度数据绘制热图（图5，见封三）。红色色块代表该属在该样本中的丰度较其他样本高，蓝色色块代表该属在该样本中的丰度较其他样本低。结果显示在属水平上，高氮水体与低氮水体的前20位物种丰度差异较大。透明球菌属（Perlucidibaca）、亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）、纤毛菌属（Leptothrix）等在低氮养殖池丰度较高，而在高氮养殖池丰度较低。亮杆菌属（Leucobacter）、金黄杆菌属（Chryseobacterium）、多核杆菌属（Polynucleobacter）等在高氮养殖水体中丰度较高。高氮与低氮两种养殖水体的氮浓度存在差异可能与水体中某些微生物特别是具有硝化反硝化功能的微生物的丰度相关。
2.2.7 LEfSe分析 为了寻找分组之间稳健的差异物种，即标志物种（biomarker），采用LEfSe （LDA Effect Size）进行分析，生成组间丰度柱状图（圖6），用以展示标志物种在不同分组样品中的具体分布情况。亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）、Ellin6067、mle1_7均属于亚硝化单胞菌科，并且都只在低氮池中有分布，在高氮养殖池中均未发现存在。芽孢杆菌属（Bacillus）在低氮池中的丰度比在高氮池的丰度高。气单胞菌属（Aeromonas）在高氮池中的丰度比在低氮池中的丰度高，柠檬酸杆菌属（Citrobacter）只在高氮池中有分布，在低氮池中未发现柠檬酸杆菌属（Citrobacter）的存在。
2.2.8 菌群谢功能预测 PICRUSt能将16S rRNA基因序列在KEGG功能谱数据库中进行预测。代谢水平的结果（图7）所示6个分组，包括代谢（Metabolism）、遗传信息处理（Genetic Information Processing）、环境信息处理（Environmental Information Processing）、细胞进程（Cellular Processes）、生物体系统（Organismal Systems）和人类疾病（Human Diseases），每一类代谢通路又被进一步划分为多个等级。所有样品的平均丰度以新陈代谢（Metabolism）所集聚的菌群数量最多，而在该等级中又以碳水化合物（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代谢（Amino acid metabolism）的菌群为主，说明养殖池内有比较多的微生物参与分解了养殖水体中的糖类、有机氮等物质。
2.2.9 代谢通路差异分析 为了找出组间具有显著差异的代谢通路，构建组间差异代谢通路图。PWY-7084代谢通路在低氮池与高氮池两个分组中具有显著差异（P<0.001）。PWY-7084代谢通路为硝化与反硝化过程（图8），在两个养殖池中亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）对硝化与反硝化过程的贡献最大，而纵坐标为代谢通路的相对丰度，在低氮池的中亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）丰富度高于高氮池，硝化与反硝化过程主要发生在低氮池。3 讨论
采用扩增子高通量测序方法对暗温室中的高氮和低氮两种养殖水体细菌多样性进行了分析，并对水质理化参数进行监测。经調查，低氮池患病率明显低于高氮池，而产量高于高氮池。两种养殖水温较为恒定，均在30 ℃左右，pH 值为7左右，溶解氧仅为0.25 mg/L左右，高氮池中的各个含氮指标均相对较高，氮含量较高是高氮池内水体污染严重的重要体现，水中残饵以及代谢废物无法分解，导致养殖水体中的氨态氮、亚硝态氮和硝态氮浓度不断升高，养殖水体的水质严重恶化[9]，进而影响中华鳖进行正常的代谢活动，致使患病几率增加。虽然低氮水体的氮浓度指标相较于高氮池低，但与中华鳖温室养殖正常水质[10-11]相比仍偏高，推测是养殖密度大、换水率和频次偏低，导致有机物积累过多，由于好氧微生物需消耗大量的溶解氧，导致水中供氧不足，影响了氨氮氧化为亚硝态氮，进而氧化为硝态氮的需氧反应过程。
低氮养殖池与高氮养殖池相比在微生物多样性上存在差异，高氮池的微生物种数低于低氮池。暗温室透气性差且温度高，高蛋白饲料残余不能降解造成养殖水体发黑有臭味[12]，水体中富含有机氮和糖类，结果显示在低氮池中存在一些微生物起到降解有机氮和糖类的作用，进而起到降低水体含氮量和富营养化的作用。低氮池Chao1、香农威纳指数和辛普森指数均较高，说明低氮水体细菌群落丰富度较高，且微生物生物多样性也较高。
龟鳖传染病中危害最大的是红（白）底板病、肠炎病、白斑病、腐皮病、肺出血、疥疮病等细菌性传染病[13]。目前已经从患病中华鳖体内分离出致病菌有嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、普通变形杆菌（proteus vulgaris）等。在高氮池中发现气单胞菌属（Aeromonas）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）的存在且丰度较高，在低氮池中未检测到柠檬酸杆菌属（Citrobacter）的存在，气单胞菌属（Aeromonas）的丰度也比高氮池中低。推测高氮池中的中华鳖患病率高可能与其水体中的条件致病菌丰度较高密切相关。
养殖规模的逐渐扩大和养殖密度的增加，导致溶氧含量少，进而导致氨态氮无法转化，水体氮含量不断积累，造成水体严重恶化[14-15]。而微生物防治以其成本低，无再污染的优点应用甚广[16]。据国内外研究报道，在土壤、海底污泥、养殖池塘中通过分离和培养可得到具有硝化作用、反硝化作用以及同步硝化与反硝化过程的菌株，被应用于污水中，降氮效果明显[17-19]。越来越多具有降氮效果的细菌从环境中分离出来，李泳洪[20]等人分离出一株异养硝化-好氧反硝化细菌降氮效果明显，该菌属于芽孢杆菌属（Bacillus）。芽孢杆菌属（Bacillus）在低氮池中丰度较高，而在高氮池中丰度较低。亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）与硝化与反硝化过程密切相关，该属在低氮池中丰度较高，在高氮池中未发现其存在。推测低氮养殖池的氮含量相较于高氮养殖池较低是由于水体中具有降氮效果的细菌。养殖生产中可投放具有降解氨态氮、亚硝态氮和硝态氮的菌株，在暗温室养殖水体里可减少氮源污染，达到净化水质的作用，实现中华鳖健康养殖。
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Physico-chemical factors and microbial diversity analysis of water body in Chinese soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis dark greenhouse culture
CHANG Xiao1，ZHANG Ju1，ZHANG Yanqin1，YAN Baoguo2，GUAN Yueqiang1
（1.College of life sciences，Hebei University，Baoding 071002，China;2.Shijiazhuang Fisheries Technology Promotion Station，Shijiazhuang 050091，China）
Abstract：Dark greenhouse farming is one of the main methods of culture of Chinese soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis. In order to clarify physico-chemical index and the microbial diversity of aquaculture water， the water body of the high nitrogen （H-N） and lower nitrogen pond （L-N） in the dark greenhouse turtle farm in Luquan， Hebei Province were sampled， and the physic-chemical factors and microbial diversity of the water body was analyzed. The results showed that the temperature of the water was about 30? ℃ and pH value was about 7， which met the requirements of the turtle culture. The dissolved oxygen of the two kinds of aquaculture water was about 0.25 mg/L. The concentrations of total nitrogen and inorganic nitrogen in H-N water were higher than those in L-N water. In term of microbial diversity， the dominant flora between H-N and L-N water were differences at different taxons. At the phylum level， Chloroflexi was dominant in L-N water， while Proteobacteria was dominant in H-N water. At the genus level， the dominant genus in L-N water were Haliscomenobacter and Nitrosomonas，while Polynucleobacterium and Leucobacter were dominant in H-N water. There were differences in species richness and similarity between the two kinds of water. The results showed that the difference of total nitrogen and inorganic nitrogen concentration was significant between H-N and L-N water， and there was also a significant difference in microbial diversity. The different microbial flora might be one of the reason of the difference of nitrogen concentration in these two kinds of ponds.
Key words：Chinese soft-shelled turtle（Pelodiscus sinensis）;microbial diversity;dark greenhouse farming;physico-chemical factors;environmental modulation
（收稿日期：2020-12-04）
