MSPD-GC/MS/MS检测发酵乳中氨基甲酸乙酯的含量
周鑫达 毕晓丽 张书芬
氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是发酵型食物天然产生的污染物，在发酵食物中广泛存在，被国际癌症研究机构评定为2A类对人体可能致癌的物质。发酵乳是人日常生活中常见的食品，发酵乳中的EC含量虽然不高，但仍存在一定的风险。现行的国家食品安全标准GB 5009.223- 2014《食品安全国家标准 食品中氨基甲酸乙酯的测定》和中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0285-2012《出口酒中氨基甲酸乙酯残留量检测方法 气相色谱-质谱法》主要是针对酒类产品和酱油中EC的检测，还无适用于发酵乳的标准，因此有必要建立对其中的EC含量进行监测的方法。本研究采用基质分散固相萃取（MSPD）结合气相色谱串联三重四级杆质谱 （GC- MS/MS）检测发酵乳中的氨基甲酸乙酯，具有快速、准确、高效，可满足日常检测的需求。
设备与材料
仪器设备。Thermo TSQ 8000 Evo/1310型气相色谱-质谱联用仪，梅特勒-托利多仪PL602E/02型电子天平，SRATORIUS CP225D型分析天平，湘仪TGL- 20M高速冷冻离心机，IKA VORTEX GENIUS 3涡旋混合仪，MILLI- Q超纯水机，Biotage TurboVap LV型氮吹仪，梅特勒-托利多仪Five Easy Plus 28型pH计。
主要试剂。氨基甲酸乙酯（EC）标准品：Dr. Ehernstorfer，纯度98.5%；氨基甲酸乙酯- D5（EC- D5）标准品：Dr.Ehernstorfer，纯度99.6%。乙酸乙酯（色谱纯），乙腈（色谱纯），盐酸（优级纯），氯化钠（分析纯），超纯水，N-丙基乙二胺（PSA）。
标准溶液配制。标准储备液的配制：分别称取折算纯度后的氨基甲酸乙酯和氨基甲酸乙酯- D5标准品10mg（精确到0.01mg）至10mL容量瓶中，乙腈溶解，定容，配置成1000mg/L的标准储备液，于- 18℃下避光保存。
标准使用液的配制：移取100μL氨基甲酸乙酯标准储备液，乙腈稀释至10mL，配制成10mg/L的标准使用液。移取10μL氨基甲酸乙酯- D5标准储备液，乙腈稀释至10mL，配制成1mg/L的标准使用液。
标准曲线用乙酸乙酯：乙腈（V：V=1：3）配制，氨基甲酸乙酯的質量浓度为：10，20，50， 100，200，500μg/L，内标质量浓度为50μg/ L。
实验方法
样品处理。移取约样品5g，加入100ng氨基甲酸乙酯- D5内标，涡旋混匀，用3mol/L的盐酸调节pH值为4.50±0.1左右，8000r/min，4℃冷冻离心5min，移取上清液于50mL离心管中。沉淀再次用5mL水振摇提取，离心后合并上清液，备用。
净化。备用液离心管中加入2g氯化钠、5mL乙酸乙酯，涡旋震荡5min，移取有机相层于10mL氮吹定量管中；水相再次用5mL乙酸乙酯提取，合并有机相。室温下氮吹至约0.5mL（不可吹干），用乙腈定容至2mL，加入200mg PSA，涡旋混匀，沉淀后取上清液过有机膜供仪器分析。
仪器条件。T h e rm o T S Q 8 1 0 0 E vo/1310三重四级杆气质联用仪，进样口温度230℃，不分流进样；色谱柱：TGWAXMS（30m×0.25mm×0.25μm），初始温度50℃，保持1min，再以8℃/min升温至180℃，保持0min，最后以30℃/min升温至240℃，保持5min；进样量2μL；高纯氦气（He）为载气，流速1.0mL/min，传输线温度250℃ ，离子源温度280℃ ，四级杆I温度150℃，四级杆II温度150℃；猝灭气（He）流速2.25mL/min，碰撞气（N2）流速1.5mL/min。电离方式：EI源，电离能量70eV，监测离子对m/z 62/44（16eV） 、m/z 62/45（20eV），m/ z 64/44（18eV） 、m/z 64/46（18eV）；溶剂延迟8min。
定性定量方法。定性方法：以m/z 62为EC母离子经裂解后得到的碎片离子m/z 44、m/ z 45，丰度比为100：49为参照，样品与标准品的保留时间一致，且碎片离子丰度比与标准品符合（允许±20%偏差），可确证为目标分析物。以m/z 64为EC- D5母离子经裂解后得到的碎片离子m/z 44、m/z 46，丰度比为100：67为参照，样品与标准品的保留时间一致，且碎片离子丰度比与标准品符合（允许±20%偏差），可确证为内标物。
定量方法：以m/z 62/44；m/z 64/44为定量离子对，内标法定量测定，纵坐标为丰度值比值，横坐标为系列浓度的标准溶液，建立标准工作曲线。
结果与分析
前处理条件选择。发酵乳中蛋白质、脂肪、糖类等含量较高，基质复杂、干扰较多，要测定其中的氨基甲酸乙酯需要先对样品进行净化处理，多数文献采用直接提取法和SPE固相萃取法前处理，本实验采用等电点沉淀-基质固相分散萃取法前处理。比较这三种方法，结果发现直接提取法杂质干扰较严重回收率较低，SPE固相萃取法与等电点沉淀-基质固相分散萃取法均能达到较好的净化效果，但回收率不高，所以考虑加入同位素内标以提高回收率及稳定性。其次SPE固相萃取法需要使用的有机试剂量大，固相萃取柱成本较高，操作步骤多，检测效率低。而等电点沉淀-基质固相分散萃取-内标法消耗试剂量小，成本低，检测效率高，所以选用等电点沉淀-基质固相分散萃取-内标法进行样品前处理实验。
质谱参数优化及标准曲线。运用AUTOSRM优化质谱参数，得到EC的特征母离子有m/z 44、62、74，EC- D5的特征母离子有m/z 44、64、74。选择丰度最大的m/z 62作为EC的母离子，m/z 64作为EC- D5的母离子，进行裂解能量优化实验，结果如图1所示。
从图1中可以看出，m/z 62离子在裂解能量为16eV的时候，能够得到丰度最大的子离子m/z 44，丰度比100：49。m/z 64离子在裂解能量为18eV的时候，能够得到丰度最大的子离子m/z 44，丰度比100：67，结果见图2。
所以选用m/z 62/44（16e V ） 、m/ z 62/45（20eV）和m/z 64/44（18eV） 、m/z 64/46（18eV）进行SRM监测扫描，SRM色谱图结果见图3。
在上述优化条件下，将系列标准溶液依次进样，内标法建立标准工作曲线，结果见图4。由图4可知，EC在10～500μg/L的范围内呈良好线性关系，标准曲线回归方程为y=0.02235x+0.0646，相关系数R2=0.9998。
检出限与回收率。标准工作曲线方程回归系数R2=0.9998。根据检出限定义单位时间内进入检测器的组分所产生的信号等于3倍基线噪声时的量。
称取六份发酵乳样品各5.0g，加标20μg/ kg，按照实验方法处理，上机分析。计算得到检出限浓度为1.25μg/L，折算为质量浓度为0.5μg/kg，数据结果见表1。
当加标量为20μg /kg时，回收率在93.6% ～104.5%之间，相对标准偏差RSD=4.1% ，具体数据见表2。
通过前处理条件筛选，采用等电点沉淀-基质固相分散萃取-内标法提取净化，气相色谱-串联质谱（GC- MS/MS）法测定发酵乳中的氨基甲酸乙酯含量的方法。相比其他方法该方法处理简单，有效较少杂质干扰，试剂用量少，回收率稳定。该方法的线性方程回归系数R2=0.9998，方法检出限0.5μg/kg，当加标量为20μg/kg时，回收率在93.6%～104.5%之间，相对标准偏差RSD =4.1%， 能满足发酵乳中氨基甲酸乙酯检测的需求。
氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是发酵型食物天然产生的污染物，在发酵食物中广泛存在，被国际癌症研究机构评定为2A类对人体可能致癌的物质。发酵乳是人日常生活中常见的食品，发酵乳中的EC含量虽然不高，但仍存在一定的风险。现行的国家食品安全标准GB 5009.223- 2014《食品安全国家标准 食品中氨基甲酸乙酯的测定》和中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0285-2012《出口酒中氨基甲酸乙酯残留量检测方法 气相色谱-质谱法》主要是针对酒类产品和酱油中EC的检测，还无适用于发酵乳的标准，因此有必要建立对其中的EC含量进行监测的方法。本研究采用基质分散固相萃取（MSPD）结合气相色谱串联三重四级杆质谱 （GC- MS/MS）检测发酵乳中的氨基甲酸乙酯，具有快速、准确、高效，可满足日常检测的需求。
设备与材料
仪器设备。Thermo TSQ 8000 Evo/1310型气相色谱-质谱联用仪，梅特勒-托利多仪PL602E/02型电子天平，SRATORIUS CP225D型分析天平，湘仪TGL- 20M高速冷冻离心机，IKA VORTEX GENIUS 3涡旋混合仪，MILLI- Q超纯水机，Biotage TurboVap LV型氮吹仪，梅特勒-托利多仪Five Easy Plus 28型pH计。
主要试剂。氨基甲酸乙酯（EC）标准品：Dr. Ehernstorfer，纯度98.5%；氨基甲酸乙酯- D5（EC- D5）标准品：Dr.Ehernstorfer，纯度99.6%。乙酸乙酯（色谱纯），乙腈（色谱纯），盐酸（优级纯），氯化钠（分析纯），超纯水，N-丙基乙二胺（PSA）。
标准溶液配制。标准储备液的配制：分别称取折算纯度后的氨基甲酸乙酯和氨基甲酸乙酯- D5标准品10mg（精确到0.01mg）至10mL容量瓶中，乙腈溶解，定容，配置成1000mg/L的标准储备液，于- 18℃下避光保存。
标准使用液的配制：移取100μL氨基甲酸乙酯标准储备液，乙腈稀释至10mL，配制成10mg/L的标准使用液。移取10μL氨基甲酸乙酯- D5标准储备液，乙腈稀释至10mL，配制成1mg/L的标准使用液。
标准曲线用乙酸乙酯：乙腈（V：V=1：3）配制，氨基甲酸乙酯的質量浓度为：10，20，50， 100，200，500μg/L，内标质量浓度为50μg/ L。
实验方法
样品处理。移取约样品5g，加入100ng氨基甲酸乙酯- D5内标，涡旋混匀，用3mol/L的盐酸调节pH值为4.50±0.1左右，8000r/min，4℃冷冻离心5min，移取上清液于50mL离心管中。沉淀再次用5mL水振摇提取，离心后合并上清液，备用。
净化。备用液离心管中加入2g氯化钠、5mL乙酸乙酯，涡旋震荡5min，移取有机相层于10mL氮吹定量管中；水相再次用5mL乙酸乙酯提取，合并有机相。室温下氮吹至约0.5mL（不可吹干），用乙腈定容至2mL，加入200mg PSA，涡旋混匀，沉淀后取上清液过有机膜供仪器分析。
仪器条件。T h e rm o T S Q 8 1 0 0 E vo/1310三重四级杆气质联用仪，进样口温度230℃，不分流进样；色谱柱：TGWAXMS（30m×0.25mm×0.25μm），初始温度50℃，保持1min，再以8℃/min升温至180℃，保持0min，最后以30℃/min升温至240℃，保持5min；进样量2μL；高纯氦气（He）为载气，流速1.0mL/min，传输线温度250℃ ，离子源温度280℃ ，四级杆I温度150℃，四级杆II温度150℃；猝灭气（He）流速2.25mL/min，碰撞气（N2）流速1.5mL/min。电离方式：EI源，电离能量70eV，监测离子对m/z 62/44（16eV） 、m/z 62/45（20eV），m/ z 64/44（18eV） 、m/z 64/46（18eV）；溶剂延迟8min。
定性定量方法。定性方法：以m/z 62为EC母离子经裂解后得到的碎片离子m/z 44、m/ z 45，丰度比为100：49为参照，样品与标准品的保留时间一致，且碎片离子丰度比与标准品符合（允许±20%偏差），可确证为目标分析物。以m/z 64为EC- D5母离子经裂解后得到的碎片离子m/z 44、m/z 46，丰度比为100：67为参照，样品与标准品的保留时间一致，且碎片离子丰度比与标准品符合（允许±20%偏差），可确证为内标物。
定量方法：以m/z 62/44；m/z 64/44为定量离子对，内标法定量测定，纵坐标为丰度值比值，横坐标为系列浓度的标准溶液，建立标准工作曲线。
结果与分析
前处理条件选择。发酵乳中蛋白质、脂肪、糖类等含量较高，基质复杂、干扰较多，要测定其中的氨基甲酸乙酯需要先对样品进行净化处理，多数文献采用直接提取法和SPE固相萃取法前处理，本实验采用等电点沉淀-基质固相分散萃取法前处理。比较这三种方法，结果发现直接提取法杂质干扰较严重回收率较低，SPE固相萃取法与等电点沉淀-基质固相分散萃取法均能达到较好的净化效果，但回收率不高，所以考虑加入同位素内标以提高回收率及稳定性。其次SPE固相萃取法需要使用的有机试剂量大，固相萃取柱成本较高，操作步骤多，检测效率低。而等电点沉淀-基质固相分散萃取-内标法消耗试剂量小，成本低，检测效率高，所以选用等电点沉淀-基质固相分散萃取-内标法进行样品前处理实验。
质谱参数优化及标准曲线。运用AUTOSRM优化质谱参数，得到EC的特征母离子有m/z 44、62、74，EC- D5的特征母离子有m/z 44、64、74。选择丰度最大的m/z 62作为EC的母离子，m/z 64作为EC- D5的母离子，进行裂解能量优化实验，结果如图1所示。
从图1中可以看出，m/z 62离子在裂解能量为16eV的时候，能够得到丰度最大的子离子m/z 44，丰度比100：49。m/z 64离子在裂解能量为18eV的时候，能够得到丰度最大的子离子m/z 44，丰度比100：67，结果见图2。
所以选用m/z 62/44（16e V ） 、m/ z 62/45（20eV）和m/z 64/44（18eV） 、m/z 64/46（18eV）进行SRM监测扫描，SRM色谱图结果见图3。
在上述优化条件下，将系列标准溶液依次进样，内标法建立标准工作曲线，结果见图4。由图4可知，EC在10～500μg/L的范围内呈良好线性关系，标准曲线回归方程为y=0.02235x+0.0646，相关系数R2=0.9998。
检出限与回收率。标准工作曲线方程回归系数R2=0.9998。根据检出限定义单位时间内进入检测器的组分所产生的信号等于3倍基线噪声时的量。
称取六份发酵乳样品各5.0g，加标20μg/ kg，按照实验方法处理，上机分析。计算得到检出限浓度为1.25μg/L，折算为质量浓度为0.5μg/kg，数据结果见表1。
当加标量为20μg /kg时，回收率在93.6% ～104.5%之间，相对标准偏差RSD=4.1% ，具体数据见表2。
通过前处理条件筛选，采用等电点沉淀-基质固相分散萃取-内标法提取净化，气相色谱-串联质谱（GC- MS/MS）法测定发酵乳中的氨基甲酸乙酯含量的方法。相比其他方法该方法处理简单，有效较少杂质干扰，试剂用量少，回收率稳定。该方法的线性方程回归系数R2=0.9998，方法检出限0.5μg/kg，当加标量为20μg/kg时，回收率在93.6%～104.5%之间，相对标准偏差RSD =4.1%， 能满足发酵乳中氨基甲酸乙酯检测的需求。
