鱼虾中喹乙醇及其代谢标示物的同步检测
马瑞欣 苏欢欢 周凡 李雪萍 王晓静
摘要：建立了液相色谱-串联三重四极杆质谱（LC-MS/MS）同步检测鱼虾中的喹乙醇（OLA）及其代谢标示物3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）的方法。样品用0.1 mol/L的盐酸37 ℃水解16 h，水解液乙腈萃取，正己烷去脂，HLB固相萃取柱净化，LC-MS/MS分析，内标法定量。结果表明，OLA和MQCA在1.00～200 μg/L范围内呈良好线性，相关系数均在0.999以上，方法检出限为0.50 μg/kg，定量限为1.00 μg/kg。在1.00、2.00、10.0 μg/kg加标水平下，OLA平均回收率为84.5%～107.0%，MQCA平均回收率为74.0%～106.0%，相对标准偏差（RSD）均小于10%。该方法灵敏度高，操作简单，可适用于鱼虾肌中喹乙醇及其代谢标示物的同步检测。
关键词：喹乙醇;3-甲基喹噁啉-2-羧酸;液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）;鱼虾;同步检测
喹乙醇又名酰胺醇，商品名有快育诺、倍育诺、快育灵等，具有广谱抗菌和促进生长的双重作用。该药物曾被作为添加剂广泛用于畜、禽、鱼、虾饲料中[1]。喹乙醇在可食动物源性食品中的残留对人类有潜在的三致性[2-3]，其在美国和欧盟都被禁止用作饲料添加剂。2005版《中国兽药典》明确规定，喹乙醇被禁止用于家禽及水产养殖。2018年1月11日颁布的中华人民共和国农业部第2638号公告规定停止在食品动物中使用喹乙醇。3-甲基喹噁林-2-羧酸（MQCA）是喹乙醇主要代谢物之一，其在体内相对稳定，被定为喹乙醇在动物体内代谢的残留标示物[4]。
目前水产品中喹乙醇及其代谢标示物的定量检测方法主要有液相色谱法[5-7]、液相色谱-串联质谱法[8-11]。这些检测方法中OLA和MQCA的前处理和上机分析是分别进行的，不能通过前处理同时提取OLA和MQCA。关于OLA和MQCA同步检测的文章也有报道[12-13]，但由于MQCA与蛋白紧密结合，仅采用酸溶液提取很难将MQCA充分提取出来，而且水产品的酸提取液比较浑浊，直接通过固相萃取柱困难，造成可操作性差。液相色谱法使用紫外检测器或DAD检测器，检测水产品中的MQCA时干扰较大，灵敏度低且易出现假阳性。液相色谱—串联质谱选择性强、灵敏度高，在定性定量检测方面具有相当的优势，因此本文建立了液相色谱—串联质谱法同步测定鱼虾中的OLA和MQCA的方法，可对OLA和 MQCA同步进行前处理和检测，减少了实验步骤;同时对前处理方法进行了改进和优化，可操作性增强。
1材料与方法
1.1仪器、试剂与材料
LC-20AD液相色谱（日本岛津）;QTRAP 4500三重四极杆质谱仪（美国AB SCIEX ）;十万分之一电子天平（赛多利斯）;百分之一电子天平（赛多利斯）;SHA-B双功能数显恒温振荡器（上海梅香仪器有限公司）;平行蒸发仪（瑞士BUQI）;Milli-Q超纯水仪（美国Millipore）;TDZ5-WS离心机（湖南湘仪）;MS3涡旋混合器（IKA）;JYS-A8000绞肉机（九阳）。
喹乙醇（OLA，纯度97.89%，Dr. Ehrenstorfer）;喹乙醇-D4（OLA- D4，纯度（99.1±02）%，WiTEGA）; 3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA，纯度97.0%，Dr. Ehrenstorfer） ;3-甲基喹噁啉-2-羧酸-D4（MQCA-D4，纯度（100±2.0）%，BePure）。乙腈和甲醇（HPLC Grade，Merck）;甲酸（HPLC Grade，DIKMA）;盐酸（优级纯，北京化工厂）;氯化钠（GR，国药）;HLB固相萃取柱：3 mL，60 mg（waters）;滤膜：0.2 μm GHP（PALL），实验用水为超纯水。
1.2试样制备
鱼去鳞、去皮，沿脊背取肌肉部分;虾去头、壳，取肌肉部分，切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块后混匀，绞肉机绞碎，装入洁净容器中，密封，-18℃以下冷冻保存。
1.3样品前处理方法
称取样品5.00 g（精确至0.01 g）于50 mL离心试管中，准确加入1.00 mg/L的混合内标中间液50 μL，涡旋混合均匀，加入15 mL 0.1 mol/L盐酸，涡旋混匀2 min ，置于37 ℃水浴避光振荡16 h，取出冷却至室温，加入5 g氯化钠，15 mL乙腈，涡旋振荡2 min，4 000 r/min离心5 min，取上层乙腈层至蒸发管中，再加入10 mL乙腈萃取一次，合并乙腈层，40 ℃蒸去乙腈。加入3 mL水洗涤蒸发管内壁残渣，溶液转入15 mL离心试管中，再用3 mL水洗涤一次，合并溶液。溶液中加入5 mL正己烷，涡旋振荡30 s，4 000 r/min离心5 min，棄去上层正己烷，再加入5 mL正己烷重复操作一次。下层溶液待净化。
HLB固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol/L盐酸活化后，加入待净化溶液， 不抽真空，让其在重力作用下自然通过固相萃取柱，用6 mL 5%甲醇水溶液淋洗，抽干，加入 3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10 mL试管中，40 ℃氮气吹干。加入1.00 mL水溶解，涡旋1 min，过0.22 μm滤膜后供液相色谱-串联质谱联用仪分析。
1.4液相色谱-串联质谱条件
液相色谱条件：色谱柱phenomenex Kinetex C18（100×2.1 mm， 2.6 μm），柱温40 ℃，流速0.5 mL/min，进样量5 μL，流动相A为0.15%（V/V）甲酸水溶液，B为0.15%（V/V）甲酸甲醇溶液。梯度洗脱程序：0～1 min，5%B;1～3 min，5%B～90%B;3～4 min，90%B;4～4.1 min，90%B～5%B;4.1～7 min，5%B。
质谱条件：电喷雾离子源（ESI），多反应扫描（MRM）正离子模式，喷雾电压5 500 V，气帘气30 PSi， 碰撞气Medium;温度550 ℃;雾化气：55 PSi;辅助加热气：55 PSi。质谱条件及参数见表1。表1多反应监测质谱条件及参数
1.5标准溶液配制
用十万分之一电子天平称取适量标准物质，用甲醇溶解并定容，配制成100 mg/L标准储备液，-18 ℃以下避光保存。分别取适量标准储备液，用甲醇分别稀释成1.00 mg/L的OLA和MQCA的混合标准中间液、1.00 mg/L的OLA- D4和MQCA-D4混合内标中间液，-18 ℃以下避光保存。
取混合标准中间液和混合内标中间液，用水稀释成1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100、200 μg /L的标准系列，内标为50.0 μg /L。
2结果与讨论
2.1样品前处理条件的建立
MQCA含有-COOH，易与蛋白质结合，可采用酸水解[7]、酶水解[9-11]、碱水解[14-17]的方法使MQCA游离出来。采用酸水解的方法可使MQCA保持分子形式，有利于后续步骤中MQCA和OLA进入乙腈层;OLA比较稳定，质谱图中子离子m/z 143.1和m/z 212.1信号比较强，干扰少，酸水解对OLA的提取和稳定性无明显影响。本文比较了 0.1 mol/L l、0.2 mol/L、2 mol/L的盐酸水解16 h后的检测结果，发现酸的浓度越高，有些样品（如对虾）水解过程中出现结块现象，质谱图中MQCA子离子m/z 144.9和m/z 142.9强度低、干扰大，造成回收率不稳定;而采用0.1 mol/L的HCl水解16 h后，样品成为均一的悬浊液， m/z 144.9和m/z 142.9信号较高，干扰小，回收率稳定。参考相关文献[18]，本实验确定水解条件为0.1 mol/L的盐酸，37℃水浴避光振荡16 h。
由于MQCA分子量小，离子碎片信息少，且LC-MS/MS检测时干扰多，本实验采用乙腈萃取、正己烷去脂和HLB固相萃取柱净化的方式对样品提取液进行净化。利用基质加标溶液对净化过程中使用淋洗液的种类、浓度和体积进行了试验，发现用水淋洗时OLA有损失，10%的甲醇淋洗时OLA和MQCA均损失较多，故采用5%甲醇进行淋洗。使用3 mL 5%甲醇淋洗后，对虾样品中MQCA的干扰峰仍较强，使用6 mL 5%甲醇淋洗后，干扰峰明显变弱，故使用6 mL 5%甲醇进行淋洗。试验发现3 mL甲醇能充分将OLA和MQCA洗脱下来，故最后洗脱采用3 mL甲醇。
乙腈萃取时，水解液中加入氯化钠，增加水溶液的密度，有助于水相和乙腈的分层。通过萃取，减少了水溶性杂质的干扰和乙腈蒸发过程中出现爆沸的情况。样品溶液经过乙腈萃取，水复溶，正己烷去脂处理后，溶液澄清，HLB柱净化时过柱通畅，柱子不会堵塞，进一步增强了实验的可操作性。
2.2流动相的选择
流动相中加入甲酸，可提高目标物子离子信号强度;加入乙酸铵对MQCA的m/z 142.9离子有增强作用，但对MQCA-D4的m/z 149.0和MQCA的m/z 144.9信号强度有明显抑制作用;采用梯度洗脱，可增加柱效和分离度。故选择015%甲酸水溶液和0.15%甲酸甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱。
2.3线性范围
OLA以OLA-D4为内标，MQCA以MQCA-D4为内标;以面积比为纵坐标，以浓度比为横坐标绘制校准曲线。由图1可以看出，OLA和MQCA在1.00 μg /L～200 μg/L范围内呈良好的线性，相关系数r大于0.999。标准溶液的OLA和MQCA多反应扫描质量色谱图见图2。
2.4检出限和定量限
实验选择草鱼、鲤鱼、金鳟、南美白对虾、中国对虾等空白样品，通过空白样品添加标准溶液制得0.50、1.00、2.00、10.0 μg/kg的加标样品，每个样品均采用四梯度三平行进行实验，按1.3进行前处理，1.4进行上机测试，标准曲线法进行定量。由表2和表3中数据可以看出，在0.50 μg/kg的添加量的情况下，信噪比大于等于3，但有些品种回收率低于70.0%，RSD大于15%，因此确定OLA和MQCA的检出限为0.50 μg/kg;在1.00 μg/kg添加量的情况下，OLA回收率在845%～107.0%之间，RSD≤7.6%;，MQCA回收率在77.1%～106.0%之间，RSD≤5.5%，因此确定OLA和MQCA的定量限为1.00 μg/kg。
2.5回收率
表2数据表明在1.00～10.0 μg/kg的添加范围内，OLA回收率在84.5%～107.0%之间，标准偏差RSD≤8.0%;批间标准偏差RSD≤91%，见表4。表3数据表明在1.00～10.0 μg/kg的添加范围内，MQCA回收率在740%～106.0%之间，标准偏差RSD≤9.9%;批间标准偏差RSD≤14%，见表5。典型样品的OLA和MQCA多反应扫描质量色谱图见图3和图4。
2.6实际样品检测
采用所建立的方法对市场上采集的罗非鱼、中国对虾、鲤鱼、草鱼、大菱鲆和南美白对虾6个品种共计32个样品进行检测，均未检出喹乙醇及其代谢标志物3-甲基喹噁啉-2-羧酸。
3結论
本文建立了鱼虾中喹乙醇和其代谢标志物3-甲基喹噁啉-2-羧酸同步检测的液相色谱—串联质谱方法，该方法喹乙醇和其代谢标志物3-甲基喹噁啉-2-羧酸的前处理步骤完全相同，实验前处理可操作性强，准确度、精密度和检出限等满足检测方法学的要求，可作为检测鱼虾中是否使用喹乙醇的定性、定量方法。
参考文献：
[1] 李兆新，耿霞，王红艳，等. 渔用饲料安全标准的研究[J].海洋水产研究，2005，26（3）：92-96.
[2] Zou J J， Chen Q， Tang S S， et al.Olaquindox-induced genotoxicity and oxidative DNA damage in human hepatoma G2（HepG2） cells[J].Mutation Research 2009 （676）：27-33.
[3] Yang Y， Jiang L P， She Y，et al.Olaquindox induces DNA damage via the lysosomal and mitochondrial pathway involving ROS production and p53 activation in HEK293 cells[J].Environmental Toxicology and Pharmacology，2015，40（3）：792-799.
[4]? Joint Expert Committee on Food Additives.FAO/WHO.Evaluation of Certain Veterinary Drug Residues in Food， Technical Series[R]. Geneva： World Health Organization. 1995：19.
[5]? 中華人民共和国农业部.水产品中喹乙醇残留量的测定 液相色谱法：SC/T 3019-2004[S].北京：中国农业出版社，2004：1-3.
[6]? 中华人民共和国农业部.水产品中喹乙醇代谢物残留量的测定 高效液相色谱法：农业部公告1077号公告-5-2008[S].北京：中国农业出版社，2008：1-5.
[7]? 中华人民共和国农业部.动物源食品中3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸残留量的测定：农业部781号公告-3-2006[S].北京：中国农业出版社，2006：1-6.
[8]? 吕海鸾，吴聪明，程林丽，等. 超高效液相色谱-串联质谱法检测畜产品和水产品中3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留[J].色谱，2012，30（1）：45-50.
[9]? 中华人民共和国认证认可监督管理委员会.出口动物源性食品中喹乙醇代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法：SN/T 0197-2014[S].北京：中国标准出版社，2014：1-6.
[10] 赵东豪，黎智广，杨金兰，等. 高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中残留的喹乙醇代谢物[J].分析实验室，2010，29（9）：19-22.
[11]? 中华人民共和国质量监督检验检疫总局.牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧、喹乙醇及代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法：GB/T 20746-2006[S]. 北京：中国标准出版社，2006：1-3.
[12]? 梅景良，吴聪明，程林丽，等. HPLCA法同步检测鲤鱼、对虾中喹乙醇与MQCA残留[J].海洋科学，2011，35（11）：42-47.
[13]? 郭霞，孙振中，戚隽渊，等. 南美白对虾中喹乙醇及其代谢物3-甲基-喹恶啉-2-羧酸残留的高校液相色谱-春联质谱检测[J].中国农业大学学报，2014，19（1）：156-160.
[14]? 陈永平，张素青，林黎明，等. 高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中的喹乙醇及其代谢物[J].理化检验（化学分册），2011，47（9）：1108-1110.
[15]? 余海霞，张小军，杨会成，等. 碱水解-高效液相色谱法测定草鱼组织中喹乙醇代谢物的残留[J]. 中国渔业质量与标准，2012，2（1）：67-69.
[16]? 王霄旸，张丽芳，薛飞群，等. 采用高效液相色谱-串联质谱法检测鲫鱼组织3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留[J].中国兽医科学，2007，37（08）：718-720.
[17]? 李二粉，张媚玉，马合勤，等. 液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中喹乙醇残留标示物3-甲基喹恶啉-2-羧酸[J]. 色谱，2018，36（5）：446-451.
[18]? 中华人民共和国质量监督检验检疫总局.河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中12种β-兴奋剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法：GB/T 22950-2008[S].北京：中国标准出版社，2008：1-6.
Simultaneous determination of olaquindox and its metabolic
marker in fish and shrimp
MA Ruixin1，2，SU Huanhuan1，2，ZHOU Fan1，2，LI Xueping1，2，WANG Xiaojing
（1.Hebei Provincial Center for Fisheries Technology Extension， Shijiazhuang 050035，China;
2.Hebei Inspection and Examination Center for Aquatic Products Quality， Shijiazhuang 050035，China）
Abstract：A liquid chromatography –tandem mass spectrometric method was developed to determine olaquindox （OLA） and its metabolic marker 3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid（MQCA）simultaneously in fish and shrimp . Sample was hydrolyzed with 0.1 mol/L hydrochloric acid for 16 h at 37 ℃， the hydrolytic solution was extracted with acetonitrile， defatted with n-hexane and purified with HLB solid-phase extraction cartridge， detected by liquid chromatography –tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）. The quantification was done by internal standard method. The analysts showed good linearity within the range 1.00～200 μg/L. The correlation coefficient （r） was greater than 0.999. The limit of detection was 0.50 μg/kg and the limit of quantitation was 1.00 μg/kg. At the three spiked levels of 1.0，2.0 and 10.0 μg/kg， the average recoveries of OLA were in range 845%～107.0% and MQCA in range 74.0%～106.0%. The relative standard deviations were below 10%. The proposed method is sensitive and easy to operate， it is suitable for detection of OLA and MQCA in fish and shrimp muscle tissues.
Key words：olaquindox （OLA）; 3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid （MQCA）; liquid chromatography –tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）; fish and shrimp
（收稿日期：2020-02-06）
