猪瘟病毒结构蛋白的研究进展

    宋淑英++张泽辉++王庄++徐炜++闫明

    摘要：对猪瘟病毒结构蛋白进行了综述，进一步弄清了猪瘟病毒的结构，为猪瘟病毒的研究提供理论支撑。

    关键词：猪；猪瘟病毒；研究进展

    中图分类号：S852.65+1 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2015）12-0007-03

    猪瘟由猪瘟病毒（classical swine fever virus， CSFV）引起，是在猪间流行的一种重要传染病。患猪会出现运动失调、后肢无力、高热、皮肤出现出血点或出血斑等症状[1]。该病致死率高且难以清除，隐性感染或治愈猪通常会成为潜在感染源。在被感染猪的多个器官，如扁桃体、皮肤、淋巴、脾脏等，都能够检测出猪瘟病毒。据统计，我国每年因猪瘟而造成的损失高达100亿元以上[2]。

    猪瘟造成的危害巨大，而其病原致病性，主要是通过病毒基因组RNA所编码的蛋白实现的。研究表明，CSFV的基因组RNA主要由3部分组成，分别为3′非编码区（3′-untranslated region， 3′UTR）、5′非编码区（5′-untranslated region， 5′UTR）以及一个较大的开放阅读框（ORF）[3]。在ORF编码产生的蛋白中，结构蛋白与病毒致病、免疫，以及防控疫苗研制等方面关系最为密切。本对CSFV结构蛋白的研究进展进行介绍，为探明病毒致病机理，更好防控猪瘟提供理论依据。

    1 ORF

    CSFV的ORF位于病毒的5′UTR与3′UTR之间。病毒基因组RNA全长约为12.3 kB，其大部分为ORF。该ORF编码一个由3 898个氨基酸所构成的多聚蛋白（polyprotein，PPro）。该蛋白能够被宿主细胞的信号肽酶及病毒自身合成的蛋白酶所识别、加工[4]，进而被分解为12种蛋白质。按照编码各种蛋白质基因的顺序，12种蛋白分别为Npro、C、Erns（E0）、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B。其中C、Erns、E1及E2为病毒结构蛋白[5]，其余8种为非结构蛋白。结构蛋白与非结构蛋白共同作用，参与病毒复制、传播等过程。

    2 CSFV结构蛋白

    2.1 C蛋白

    CSFV C蛋白，也称核衣壳蛋白C。编码该蛋白的基因大小为192 bp，是由PPro经宿主细胞中的信号肽酶加工而成。构成该蛋白的氨基酸具有较强的亲水性。序列分析发现，组成该蛋白的多为带正电荷的精氨酸及赖氨酸残基，推测可能与基因组RNA结合作用有关[6]。最近的研究发现，C蛋白在黄病毒科中的丙型肝炎病毒中，具有基因转录调控因子的作用。C蛋白能够有效的抑制基因组中核糖体结合位点的活性，使病毒的复制、翻译过程受到抑制，降低病毒的增殖效率，呈现持续感染的状态。但C蛋白在CSFV中是否存在同样功能尚不清楚。

    2.2 Erns

    Erns蛋白存在于PPro的268～494位，由227个氨基酸残基构成，分子量为44～48 kDa之间。结构分析发现，该蛋白具有9个潜在的糖基化位点，在病毒粒子中，通常以同源二聚体的形成存在[7]，二聚体分子量约为100 kDa。被感染的细胞能够分泌大量的Erns蛋白。

    对Erns功能研究发现，该蛋白除是一种囊膜蛋白外，同时具有核糖核酸酶活性，对尿嘧啶具有较高专一性。在pH 6.0～6.5时活性最高，Mn2+与Zn2+为酶活性强抑制剂，Ca2+与Mg2+对其抑制作用较弱。该蛋白具有较高的热稳定性，50～60 ℃时活性最强，在65 ℃时仍能够保持75%的酶活性，而在37 ℃时的活性能够保持在86%左右[8]。

    Erns具有免疫抑制活性，同时具有一定神经毒性及抗蠕虫能力。蛋白的297位及346位氨基酸为酶活性必需氨基酸，该位点氨基酸发生突变后，Erns将失去核糖核酸酶活性，但仍能与相应抗体结合。研究表明，Erns的核糖核酸酶活性在CSFV复制过程中具有重要作用，与自然宿主长期带毒及隐性感染有关。体外试验发现，Erns对不同种属的淋巴细胞蛋白合成均有较强的抑制作用，尤其是对人、猪、羊和牛的淋巴细胞增殖，能够完全抑制其增殖[9]。在Erns蛋白346位的组氨酸对CSFV的致病性具有决定性作用，当该位点发生氨基酸突变时，病毒的致病力将完全消失，突变病毒虽能够在细胞中稳定传代，但产毒量显著降低。在病毒侵入细胞的过程中，Erns也发挥了重要作用。研究表明，Erns蛋白能够与位于细胞表面的膜蛋白相互作用。在猪肾细胞试验中发现，CSFV与肾细胞结合是通过Erns蛋白与细胞表面中的硫酸乙酰肝素相互作用而实现的[10]。

    Erns蛋白能够刺激机体产生对CSFV的免疫能力。由于编码Erns蛋白的核苷酸序列保守性相对较高，因此Erns可作为免疫防控猪瘟的靶蛋白。Erns的抗原决定簇可分为3个区域，AR1，AR2及AR3。3个区域单独或共同都可以与感染CSFV的血清发生反应。对Erns蛋白高级结构研究发现，与其他核糖核酸酶不同，Erns具有一个C-端延伸区域、一个截短的N-端以及一个大的富含半胱氨酸的插入区域。其中C-端延伸区域和蛋白的跨膜定位有关[11]。

    2.3 E1

    E1蛋白是CSFV的囊膜糖蛋白，位于PPro的495～689位氨基酸之间，由195个氨基酸残基构成，蛋白骨架的分子量约为21.8 kDa。有3个潜在的N-糖基化位点。E1蛋白是由糖基化酶、宿主细胞的信号肽酶及蛋白水解酶共同加工、成熟的。E1和E2蛋白可以通过二硫键构成异源的二聚体。E1存在于病毒囊膜内，无法诱导机体产生CSFV中和抗体[5]。

    2.4 E2

    E2蛋白同样为病毒的囊膜糖蛋白，但与E1蛋白不同，E2是CSFV的主要保护性抗原蛋白。该蛋白由370个氨基酸残基构成，分子量约为41.5 kDa。蛋白位于PPro的690～1 060位氨基酸，存在5个潜在糖基化位点，每个位点都可以与分子量为2 kDu～3 kDa的低聚糖结合[12]。在蛋白N-端存在4个主要抗原位点，其上游为一段信号肽序列，C-端为一个由18个氨基酸组成的疏水侧链而构成的跨膜蛋白。E2蛋白同E1蛋白一样，通常以二聚体形式存在于CSFV感染的细胞表面及病毒粒子内。

    E2蛋白含有刺激产生病毒中和抗体的抗原决定簇，可刺激机体产生针对CSFV的中和抗体。研究发现，E2蛋白抗原区域均存在于蛋白的N-端和690～866位氨基酸残基区间，共包括4个部分，即A、B、C和D。而蛋白的其他区域不参与形成抗原表位构象。A区又可以分为3个亚区，A1，A2和A3。在这些区域中，A1，A2保守性较高，B、C、D及A3容易发生变异。A1，B和C区为中和性抗原表位。另外，在E2蛋白的羧基端995～998位处，是一个以YYEP为核心序列的线性表位，该表位在整个瘟病毒属中具有较高的同源性，为瘟病毒属所共有的抗原表位。保护性试验表明，由A，B，C，D 4个抗原区域中任一区域诱导的免疫反应，都能够使猪获得对CSFV强毒株的免疫能力[13]。

    位于E2蛋白829～837位的氨基酸序列在CSFV中具有较高的保守性，而与瘟病毒属中的其他病毒差异性则较大。因此可根据该段序列设计针对性的诊断及免疫试剂。而位于E2 N-端690～812位的123个氨基酸残基中，推测含有与IgG结合区域，该区域与其他瘟病毒无交叉反应[14]，可用于CSFV血清学检测。

    在E2蛋白中共有15个半胱氨酸，其中位于蛋白N-端的6个半胱氨酸在蛋白形成正确折叠构象中起重要作用。位于695和737位的半胱氨酸是B及C区与单抗结合的必需基团，而位于792、818及856位的半胱氨酸与A区及D区的抗体结合有关。因此推测，可将E2蛋白的抗原性分为两个相对独立的结构单元，一个由B区和C区构成的保守性相对较低的单元，另一个由A区和D区构成的高度保守单元。其中B区与C区通过2个靠近N-端的半胱氨酸形成的二硫键连接，A区与D区则通过其他3个半胱氨酸形成的2对二硫键连接[15]。

    E2蛋白与CSFV对宿主细胞的识别与吸附能力有关，能够决定病毒对细胞的感染倾向性。研究发现，E2蛋白能够与宿主细胞膜中的低密度脂蛋白受体结合。而对病毒结构蛋白E1、E2和Erns研究发现，当只存在E1和E2蛋白时，病毒就可以感染细胞，Erns为病毒感染的非必需蛋白。在结构蛋白中E2蛋白比较容易发生变异，而E2功能又与病毒感染以及抗体生成有关，因此E2的变异性，能够使CSFV对环境有较强的适应性，同时又能使免疫疫苗失效[11～13]。

    3 展望

    猪瘟病毒对养猪业造成巨大威胁，但其具体的致病机制仍不明确。目前，疫苗免疫仍是防控猪瘟最有效的方式之一。而随着对病毒基因组RNA及相关蛋白研究的不断深入，使探明病毒致病机制、有效防控猪瘟成为可能。在CSFV结构蛋白中，E2蛋白由于与免疫应答有关，对其结构及功能的研究比较深入。同时，随着对病毒其他结构蛋白和非结构蛋白的结构、功能的不断研究，防控猪瘟的思路和方法也将逐渐拓宽。

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