北极参多肽酶解工艺优化
王迪+宋悦凡+刘舒+武龙+丛海花+谷越+汪秋宽
摘要：北极参（Cucumaria frondosa） 营养价值高，体壁质厚，有极高的开发成多肽产品的潜能。本文以北极参为原料，研究最优酶解工艺。基本成分测定结果显示，北极参蛋白质含量95.03%，脂肪1.76%，灰分247%。以酶解液中多肽得率为检测标准，通过枯草杆菌中性蛋白酶与风味蛋白酶组成复合酶进行酶解，通过单因素试验与正交试验，优化加酶量、酶解时间、温度与pH，确定最优酶解工艺；正交试验结果显示北极参的最优酶解工艺为：酶解温度为 50 ℃、pH为 8.0、料液比 1∶5、酶解时间为 5 h、加酶量为 2.09%，多肽得率为 15.38%；酶解产物的氨基酸组成结果表明氨基酸总量占干重约 85%；通过Sephadex G-50对北极参酶解液的多肽分子量进行分析，结果显示分子量范围在 1 080～12 052 Da。
关键词：北极参（Cucumaria frondosa） ；正交试验；酶解工艺
海参是海参纲的一种棘皮动物，从古至今一直被誉为名贵滋补食品、药材[1]，全世界大约有1 700多种不同海参，我国本土捕捞的可食用海参有20多种[2]。海参是典型的蛋白含量高、脂肪含量低、低糖、高营养价值的海产品[3]。对海参生物活性物质的研究发现海参富含多种生物活性物质[4]。其中的海参多肽具有良好的生物活性功能，食用起来安全，人体消化吸收容易，还能够提高机体免疫力等[5]。近些年来，对于海参多肽研究主要还是集中于工艺提取优化和机理活性，研究表明，海参小分子肽具有很多功能作用。殷廷[6]等对海参水煮液进行酶解，并用大孔树脂进行吸附试验，得到的三个多肽组分均存在良好的抗氧化活性。
北极参（Cucumaria frondosa）别名大西洋海参，体壁厚实、营养价值高，经济价值高，是开发多肽类产品的优质原料。Suwanmala[7]等发现北极参可提高小鼠体内SOD水平，在小鼠体内具有抗氧化作用。由于海参不同种质之间和捕捞海域的不同，使得海参在营养价值上差异较大，这困扰了海参多肽产品的生产者和消费者，为充分利用北极参这一营养优质、价格低廉的资源，本研究以多肽得率为指标，优化多肽酶解制备工艺，选用复合酶对北极参多肽酶解最优制备工艺参数进行初步研究，为增加北极参的高效利用和深度开发提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
北极参（水发）由大连水产企业提供；枯草杆菌中性蛋白酶、风味蛋白酶购自上海蓝季科技发展有限公司；蓝葡聚糖、杆菌肽、胰岛素、细胞色素c、胰凝乳蛋白购于索莱宝公司；乙腈、氨基酸分析试剂盒为色谱纯，Sephadex G-50凝胶购置于GE Healthcare Bio-Sciences AB；其它化學试剂均为分析纯。
721S分光光度计和TU-1810DAPC型紫外可见分光光度计，普析北京通用仪器有限责任公司；Elite-AAK 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），安捷伦1260高效液相色谱仪，安捷伦公司。
1.2实验方法
1.2.1海参基本成分测定蛋白质GB/T 5009.5-2010[8]；粗脂肪GB/T 5009.6-2003[9]；粗灰分GB/T 5009.4-2010[10]。
1.2.2海参酶解工艺优化以北极参为原料，将海参浸泡脱盐[11]，匀浆，酶解，灭菌，双缩脲法测定多肽含量。酶解分别以温度、pH、料液比、时间、加酶量（与底物重量之比）为实验因素，进行单因素和正交实验。
研究选择风味蛋白酶与枯草杆菌中性蛋白酶组成复合酶，酶比例为1∶3（酶活比）[12]。酶解单因素的条件选择如下。
1.2.2.1酶解反应温度的选定在料液比1∶3（g/mL）、酶解时间4 h、加酶量1.74%，pH为70时，酶解温度为45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃，测定上述酶解温度对多肽得率的影响。
1.2.2.2酶解反应pH的选定在料液比为1∶3（g/mL）、酶解温度50 ℃、酶解时间 4 h、加酶量为1.74%时，pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，测定上述pH对多肽得率的影响。
1.2.2.3酶解反应料液比的选定在酶解温度为50 ℃、酶解时间4 h、加酶量1.74%，pH为70时，料液比为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g/mL），测定上述料液比对多肽得率的影响。
1.2.2.4酶解反应时间的选定在料液比为1∶3（g/mL）、酶解温度50 ℃，加酶量为1.74%，pH为7.0时，酶解时间为3、4、5、6、7 h，测定上述酶解时间对多肽得率的影响。
1.2.2.5酶解反应加酶量的选定
在料液比1∶3（g/mL）、酶解温度为50 ℃、酶解时间4 h，pH为7.0时，加酶量为139%、174%、2.09%、2.44%、2.79%、314%，测定上述加酶量对多肽得率的影响。
1.2.3正交试验依据单因素实验结果正交试验设计见表1所示。
1.2.4北极参多肽含量测定使用三氟乙酸结合双缩脲法[13]，测定酶解液中多肽得率。5 mL北极参酶解上清液+5 mL的10%三氯乙酸，4 000转离心10 min，上清液多肽得率双缩脲法测定。标准品用牛血清蛋白，做标准曲线[14]。通过北极参酶解液中多肽浓度计算酶解液中多肽得率，多肽得率（百分比）等于北极参酶解液的体积与北极参酶解液中多肽浓度相乘后除以北极参中的蛋白质含量。
1.2.5北极参酶解液氨基酸组成分析衍生使用安捷伦氨基酸检测试剂盒进行，安捷伦1260高效液相色谱仪分析检测。柱温，27 ℃；检测器二极管阵列；检测波长，360 nm/4 nm；流动相流速：1.2 mL/min；进样量：10 μL。流动相A，50%乙腈溶液；流动相B，0.05 mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液（pH 6.4～6.8）加入1%N，N二甲基甲酰胺[14]。进样时的流动相梯度A设定0 min，84%→4.3 min，69%→9.5 min，64%→17 min，45%→28 min，35%→34 min，0%→36 min，0%→38 min，84%。
1.2.6北极参酶解液分子量分布分析以杆菌肽（1 423 Da），胰岛素（5 500 Da），细胞色素c（12 384 Da），胰凝乳蛋白（25 000 Da）为标准品，通过Sephadex G-50凝胶层析分析酶解液中分子量分布。
1.2.7数据处理采用Excel软件对每一试验三次平行数据结果进行分析比较。
2结果与分析
2.1北极参基本成分
由表2可见北极参是一种高蛋白，低脂肪的健康食品；与王磊等[15]对东海海参体壁的营养成分分析比较发现，粗蛋白含量为71.74%和王远红[16]研究三种不同西沙群岛海参科的海参蛋白质含量均在70%左右，脂肪均在1%左右，本实验北极参蛋白含量高达95% 均高于这几种海参，粗脂肪含量也较低，北极参中黏多糖含量未检出（检测方法参考郑艾初等[17]），其原因可能与前期水发工艺有关。
2.2北极参酶解工艺优化
2.2.1酶解温度对酶解液中多肽得率的影响酶解温度对北极参酶解液中多肽得率影响在图1显示。从图1中可看出，在酶解温度低于60 ℃时，北极参酶解液多肽含量随着温度升高而升高，60 ℃时多肽含量达最高值，当酶解温度高于60 ℃时，多肽含量急剧下降。分析原因，酶属于一种特殊的蛋白质，当温度没有达到其最适温度时，随温度上升得率不断增加，在达到最适温度后，再不断地升高温度，只会引起酶活的急剧下降，多肽得率也随之下降[18]。在酶促反应中温度是重要因素。在试验过程中过度偏离最适温度，将无法达到预期效果。
2.2.2pH值对酶解液中多肽得率的影响pH值对酶解液多肽得率的影响在图2显示，由于酶的特殊性，pH的改变会造成酶的失活[18]。由图2可见，北极参酶解pH值越高，酶解液中多肽含量越高。风味蛋白酶最适pH值在6.5左右，枯草杆菌中性蛋白酶最适pH 在7.0左右[19]，参考实验室其它海参研究结果[20]并与梁杰[21]等人对海参蛋白肽制备工艺的研究比较，发现偏碱性条件酶解效果更优，所以，添加pH 8进行正交试验。
2.2.3料液比对酶解液多肽得率影响料液比对多肽得率的影响在图3显示。如图3中可见，北极参在料液比在1∶2～1∶4的范围内波动时，酶解液多肽得率随着水比例的上升而上升；料液比大于1∶4后，多肽得率变化趋势趋于平缓。当料液中水比重在逐渐增加时，底物与酶接触面积便会减少，酶解反应随之变慢，反应速率降低。因此料液比选在1∶4。
2.2.4酶解时间对酶解液中多肽得率的影响酶解时间对酶解液中多肽得率的影响在图4中显示。如图4中可见，北极参随着时间的增加，多肽得率先上升后下降，4 h時达到顶峰值。此现象出现可能由于酶进一步将多肽转变成氨基酸，所以引起得率下降。酶解反应时间为4 h最优。
图4酶解时间对北极参酶解液多肽得率的影响
2.2.5加酶量对酶解液多肽得率的影响加酶量对酶解液多肽含量的影响在图5显示。加酶量对酶解液多肽得率的影响随底物性质的变化而变化。低于最佳加酶量，酶浓度低，使得水解不完全，过高又将造成水解过度，比较侯付景[22]等对海地瓜酶解工艺研究研究结果，加酶量在2%左右为最佳，比较本文数据1.74%与2.09% 加酶量多肽得率并无太大差别，所以选择北极参的最适加酶量为2.09%。
2.2.6酶解条件正交试验优化
根据表3可得出，实验最优组合为A1B4C4D4E4，即酶解温度为45 ℃、pH值为8.0、料液比1∶5、酶解时间为6 h、加酶量为2.79%，在该条件多肽得率为1477%；通过极差分析得知，各因素影响酶解过程的主次顺序是C（料液比）>A（酶解温度）> B（pH值）>D（酶解时间）>E（加酶量）。所以理论最优组合为A2B4C4D3E2，即酶解温度为50 ℃、pH值为80、料液比1∶5、酶解时间为5 h、加酶量为2.09%。
由表4经过验证实验，得出最优酶解工艺为最优酶解工艺为A2B4C4D3E2，即酶解温度为50 ℃、pH值为8.0、料液比1∶5、酶解时间为5 h、加酶量为2.09%。正交结果表明，酶解料液比和温度为酶解反应中重要因素，杨颖等[20]对于加拿大红参的研究也证实酶解温度是显著影响因素，因此在生产中应严格控制温度及加水量，以确保酶解效果。苏永昌[23]等以地瓜参为原料进行酶解工艺的研究，其优化条件与本文相差无几，但多肽得率低于本研究结果，分析原因可能是本研究使用了复合酶，而苏永康选用的为单一中性蛋白酶，这也说明单一酶酶解结果不如复合酶酶解结果好。
2.3北极参酶解液氨基酸组成
由表5可知，北极参酶解液中的氨基酸含量丰富，必需氨基酸总量为21 081.54 mg/100 g，占氨基酸总量的24.6%，本文四种呈味氨基酸占氨基酸总量的42.1%，比袁文鹏[24]研究仿刺参中酶解提取物必须氨基酸和呈味氨基酸都高。有报道表明，许多哺乳动物生长都离不开精氨酸[25]，比较李亚娴[14]等对澳洲秃参酶解液的研究，北极参酶解液精氨酸含量远高于澳洲秃参酶解液中精氨酸含量。Seifter[26]等人研究表明，精氨酸能够促进创伤的愈合。北极刺参氨基酸含量丰富，适合各类人群食用，尤其是儿童和创伤病人。研究表明该北极参酶解产物有进一步开发成为海参多肽产品和海参调味产品的潜力。
北极参酶解液多肽分子量分布由图6所示。由图6可见北极参酶解液多肽分子量分布范围为1 088～12 052 Da，Perez-Vega JA等[27]在海参中发现一种分子量小于3 000 Da的多肽类物质具有较好的ACE（血管紧张素转换酶）抑制活性。王静等人[28]研究表明海参酶解液中小于3 000 Da分子量的多肽抗氧化活性十分显著。Zhou Xiaoqiu等人[29]仿刺参（Stichopus japonicus）水解，得到2 种分子量小于3 000 Da的低分子多肽，表明其具有治疗胃癌和乳腺癌的功效。北极参酶解液分子量主要集中分布在1 088～4 071 Da之间，这说明酶解液中多为9～34个氨基酸组成的多肽。
图6北极参酶解液多肽分子量分布曲线
3结论
北极参枯草杆菌中性蛋白酶和风味蛋白酶复合酶酶解优化条件为酶解温度为50 ℃、pH值为8.0、料液比1∶5、酶解时间为5 h、加酶量为209%，其酶解液中多肽得率达15.38%。北极参酶解液多肽分子量分布范围为1 088～12 052 Da，其具有进一步开发成多肽产品和调味料的潜力。
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Enzymic hydrolyzing technologies for preparation of polypeptides from Cucumaria frondosa
WANG Di ，SONG Yuefan，Liu Shu，WU Long，Cong Haihua，GU Yue，WANG Qiukuan
（College of Food Science and Technology，Dalian Ocean University，National Research and Development Branch Center for Seaweed Processing，Key Laboratory of Fishery Product Processing and Utilization of Liaoning Province，Dalian 116023，China）
Abstract： Cucumaria frondosa prossesses high nutritional value and quality. It has a huge potential for application in development of polypeptide products. In this study，the sea cucumber Cucumaria frondosa was used as raw material and the peptide amount produced as determining indicator to carry out the orthogonal test for optimizing enzymolytic factors by using the combined enzymes of subtilism and flavourzyme，which included the enzyme amount added，enzymolytic time，temperature and pH value based on the findings of single factor experiments. The analysis of approximate composition for the raw material showed that the protein content was 95.03%，the lipid content was 1.76% and the ash content was 2.47%. The results obtained by orthogonal test indicated that the yield of polypeptides was 15.38% at optimized enzymolytic hydrolyzing conditions as follows： the material and water ratio of 1∶5 at temperature of 50 ℃，pH value of 8.0 and the amount of enzyme added of 2.09% for hydrolyzing time of 5 h. The total amino acids were measured for 85% of the dry weight of the hydrolysate. The polypeptide molecular weight distribution of the hydrolyzing product was estimated among 1 080～12 052 Da by Sephadex G-50.
Key words：Cucumaria frondosa； orthogonal test；hydrolyzing technology
（收稿日期：2017-02-13）
