超高效液相色谱法测定青藤散中青藤碱含量
王锐 李陈雪 胡月 郭玉岩 李永吉
摘要：目的 建立超高效液相色谱法（UPLC）测定青藤散中青藤碱含量的方法。方法 采用UPLC，色谱柱为ACQUITY UPLC HSS C18（2.1 mm×50 mm，1.8 ?m），流动相为乙腈-水-乙二胺（50∶50∶0.25），流速为0.2 mL/min，进样量为2 ?L，于检测波长283 nm处对青藤碱进行含量测定。结果 出峰时间在1 min左右，青藤碱在34.2～2188.0 ng范围内线性关系良好。结论 本研究所建立的方法简便快速、稳定可靠，可用于青藤散中青藤碱的含量测定。
关键词：青藤散；青藤碱；超高效液相色谱法；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.024
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）03-0089-03
Abstract： Objective To establish an UPLC method for the determination of sinomenine in Sinomenine External Applied Powder. Methods The UPLC method was carried out on a C18 column by using acetonitrile-water-ethylene diamine （50：50：0.25） as mobile phase. The flow rate was 0.2 mL/min； the sample quantity was 2 ?L； the detection wavelength was 283 nm. Results The peak time was within 1 min or so. The calibration curve of sinomenine was in the linear range of 34.2–2188.0 ng. Conclusion The method is simple， rapid， stable and reliable， which can be used for the determination of sinomenine in Sinomenine External Applied Powder.
Key words： Sinomenine External Applied Powder； sinomenine； UPLC； content determination
青藤散是以青风藤提取物青藤碱（sinomenine）为原料，以糊精等为辅料制备的治疗类风湿关节炎的外用经皮给药制剂。青藤碱是青风藤抗炎、镇痛、抗风湿作用的主要有效成分[1]。目前，青藤碱的含量测定大多采用高效液相色谱法（HPLC），流动相主要为甲醇-水，出峰时间在10 min左右，这就使进样周期延长，有可能出现样品稳定性存在差异等问题[2]。超高效液相色谱法（UPLC）的速度、灵敏度、分离度分别是HPLC的9、3、1.7倍，缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量，降低了分析成本[3]。本试验采用UPLC建立青藤散的质量控制方法，为青藤碱相关的制剂研发、质量控制提供依据。
1 仪器与试药
ACQUITY UPLC H-Class超高液相系统，（上海）Waters 公司，包括四元泵、TUV可变波长紫外检测器、Empower色谱工作站；AB265-S型分析天平，瑞士梅特勒，拓赫机电科技（上海）有限公司。
青藤散，课题组自制，批号20140310、20140311、20140312；青藤碱对照品，中国食品药品检定研究院，批号110774-200206；青藤碱原料药（纯度≥98%），成都曼斯特生物科技有限公司，批号12101704；乙腈（色谱纯），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；乙二胺，天津市启邦化工产品销售有限公司；水为屈臣氏蒸馏水；甲醇，西陇化工股份有限公司。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
取青藤碱对照品约34.20 mg，精密称定，加甲醇溶解，并定容至25 mL容量瓶中，作为对照品溶液，质量浓度为1.368 mg/mL。
2.2 色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS C18（2.1 mm×50 mm，1.8 ?m）；流动相：乙腈-水-乙二胺（50∶50∶0.25）；流速：0.2 mL/min；检测波长：283 nm；柱温：30 ℃；进样量：2 ?L。理论板数按青藤碱计算应不少于2000。取“2.1”项下对照品溶液2 ?L，注入UPLC仪，在上述色谱条件下测定，色谱图见图1。结果表明，在上述色谱条件下，青藤碱的出峰时间在1 min左右，且峰形尖锐良好。
2.3 供试品溶液的制备
取青藤散30 mg，精密称定，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，用0.45 ?m微孔滤膜过滤，取续滤液1 mL，置于2 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液2 ?L，注入UPLC仪，在“2.2”项色谱条件下测定，色谱图见图2。
2.4 线性关系考察
精密量取青藤碱对照品溶液适量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成对照品质量分别为34.2、136.8、273.6、1094.4、1368.0、2188.0 ng的青藤碱对照品系列溶液。按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，分别以峰面积值为纵坐标、对照品质量（ng）为横坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，得回归方程Y=9452.6X+7639.1（r=0.999 7）。结果表明，青藤碱对照品质量在34.2～2188.0 ng范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
取高（1.368 0 mg/mL）、中（0.547 2 mg/mL）、低（0.017 1 mg/mL）3个浓度的对照品溶液，精密吸取2 μL，注入超高效液相色谱仪，连续进样6次，结果高、中、低浓度青藤碱峰面积RSD分别为1.38%、1.02%、0.75%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.6 重复性试验
取同一批的青藤碱原料药，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，记录色谱图，计算青藤碱峰面积的RSD，结果RSD=0.94%（n=6），表明本方法重复性良好。
2.7 稳定性试验
将供试品溶液放置于4 ℃冰箱中，精密量取同一容量瓶中的供试液溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样2 μL进行测定，结果青藤碱峰面积的RSD=1.31%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 加样回收率试验
精密称取已知量的样品9份，加入青藤碱对照品溶液0.1、0.3、0.5 mL各3份，按“2.3”项下操作进行测定，计算回收率，结果见表1，表明本方法回收率较好。
2.9 样品含量测定
取3批青藤散样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液后测定其中青藤碱的含量，结果见表2。
3 讨论
已有文献报道采用高效液相色谱法测定青藤碱的含量[4]。目前所使用的流动相系统大多可分为2大类：其一，采用甲醇-水为流动相，出峰时间一般在10 min左右[5]，使进样周期延长，试验效率大大降低；其二，采用甲醇-磷酸盐缓冲液为流动相，除了出峰时间长以外，缓冲盐对色谱柱的伤害大，若冲洗不干净极易堵塞柱子。
本试验选择更为精密、快速的UPLC进行测定，以乙腈-水为流动相进行分离。结果表明，以乙腈-水（50∶50）为流动相时，保留时间适宜。今后也可根据试验的不同要求调节流动相比例，以改变保留时间。
本试验对自制青藤散中的青藤碱进行了含量测定，所采用的方法快速、准确、灵敏度高、重复性好，对青藤碱其他剂型制剂（微乳、脂质体等）的质量控制也具有指导意义。
参考文献：
[1] 刘强，周莉玲，李锐，等.青藤碱的研究概况[J].中草药，1997，28（4）：247.
[2] 郭玉岩，李敏，史磊，等.HPLC法测定盐酸青藤外敷散中盐酸青藤碱含量[J].中国中医药信息杂志，2009，16（11）：42.
[3] 傅晓燕，黄巧玲.HPLC与UPLC法对比测定两种川芎药材中阿魏酸的含量[J].中药材，2011，34（7）：1070.
[4] 沙振方，孙文基.青风藤中青藤碱HPLC法测定[J].中药材，1989， 12（10）：34.
[5] 潘细贵，罗顺德，张先洲，等.高效液相色谱法测定青藤碱片中青藤碱的含量[J].时珍国医国药，2001，12（7）：593.
（收稿日期：2015-04-27；编辑：陈静）
摘要：目的 建立超高效液相色谱法（UPLC）测定青藤散中青藤碱含量的方法。方法 采用UPLC，色谱柱为ACQUITY UPLC HSS C18（2.1 mm×50 mm，1.8 ?m），流动相为乙腈-水-乙二胺（50∶50∶0.25），流速为0.2 mL/min，进样量为2 ?L，于检测波长283 nm处对青藤碱进行含量测定。结果 出峰时间在1 min左右，青藤碱在34.2～2188.0 ng范围内线性关系良好。结论 本研究所建立的方法简便快速、稳定可靠，可用于青藤散中青藤碱的含量测定。
关键词：青藤散；青藤碱；超高效液相色谱法；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.024
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）03-0089-03
Abstract： Objective To establish an UPLC method for the determination of sinomenine in Sinomenine External Applied Powder. Methods The UPLC method was carried out on a C18 column by using acetonitrile-water-ethylene diamine （50：50：0.25） as mobile phase. The flow rate was 0.2 mL/min； the sample quantity was 2 ?L； the detection wavelength was 283 nm. Results The peak time was within 1 min or so. The calibration curve of sinomenine was in the linear range of 34.2–2188.0 ng. Conclusion The method is simple， rapid， stable and reliable， which can be used for the determination of sinomenine in Sinomenine External Applied Powder.
Key words： Sinomenine External Applied Powder； sinomenine； UPLC； content determination
青藤散是以青风藤提取物青藤碱（sinomenine）为原料，以糊精等为辅料制备的治疗类风湿关节炎的外用经皮给药制剂。青藤碱是青风藤抗炎、镇痛、抗风湿作用的主要有效成分[1]。目前，青藤碱的含量测定大多采用高效液相色谱法（HPLC），流动相主要为甲醇-水，出峰时间在10 min左右，这就使进样周期延长，有可能出现样品稳定性存在差异等问题[2]。超高效液相色谱法（UPLC）的速度、灵敏度、分离度分别是HPLC的9、3、1.7倍，缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量，降低了分析成本[3]。本试验采用UPLC建立青藤散的质量控制方法，为青藤碱相关的制剂研发、质量控制提供依据。
1 仪器与试药
ACQUITY UPLC H-Class超高液相系统，（上海）Waters 公司，包括四元泵、TUV可变波长紫外检测器、Empower色谱工作站；AB265-S型分析天平，瑞士梅特勒，拓赫机电科技（上海）有限公司。
青藤散，课题组自制，批号20140310、20140311、20140312；青藤碱对照品，中国食品药品检定研究院，批号110774-200206；青藤碱原料药（纯度≥98%），成都曼斯特生物科技有限公司，批号12101704；乙腈（色谱纯），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；乙二胺，天津市启邦化工产品销售有限公司；水为屈臣氏蒸馏水；甲醇，西陇化工股份有限公司。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
取青藤碱对照品约34.20 mg，精密称定，加甲醇溶解，并定容至25 mL容量瓶中，作为对照品溶液，质量浓度为1.368 mg/mL。
2.2 色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS C18（2.1 mm×50 mm，1.8 ?m）；流动相：乙腈-水-乙二胺（50∶50∶0.25）；流速：0.2 mL/min；检测波长：283 nm；柱温：30 ℃；进样量：2 ?L。理论板数按青藤碱计算应不少于2000。取“2.1”项下对照品溶液2 ?L，注入UPLC仪，在上述色谱条件下测定，色谱图见图1。结果表明，在上述色谱条件下，青藤碱的出峰时间在1 min左右，且峰形尖锐良好。
2.3 供试品溶液的制备
取青藤散30 mg，精密称定，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，用0.45 ?m微孔滤膜过滤，取续滤液1 mL，置于2 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液2 ?L，注入UPLC仪，在“2.2”项色谱条件下测定，色谱图见图2。
2.4 线性关系考察
精密量取青藤碱对照品溶液适量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成对照品质量分别为34.2、136.8、273.6、1094.4、1368.0、2188.0 ng的青藤碱对照品系列溶液。按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，分别以峰面积值为纵坐标、对照品质量（ng）为横坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，得回归方程Y=9452.6X+7639.1（r=0.999 7）。结果表明，青藤碱对照品质量在34.2～2188.0 ng范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
取高（1.368 0 mg/mL）、中（0.547 2 mg/mL）、低（0.017 1 mg/mL）3个浓度的对照品溶液，精密吸取2 μL，注入超高效液相色谱仪，连续进样6次，结果高、中、低浓度青藤碱峰面积RSD分别为1.38%、1.02%、0.75%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.6 重复性试验
取同一批的青藤碱原料药，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，记录色谱图，计算青藤碱峰面积的RSD，结果RSD=0.94%（n=6），表明本方法重复性良好。
2.7 稳定性试验
将供试品溶液放置于4 ℃冰箱中，精密量取同一容量瓶中的供试液溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样2 μL进行测定，结果青藤碱峰面积的RSD=1.31%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 加样回收率试验
精密称取已知量的样品9份，加入青藤碱对照品溶液0.1、0.3、0.5 mL各3份，按“2.3”项下操作进行测定，计算回收率，结果见表1，表明本方法回收率较好。
2.9 样品含量测定
取3批青藤散样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液后测定其中青藤碱的含量，结果见表2。
3 讨论
已有文献报道采用高效液相色谱法测定青藤碱的含量[4]。目前所使用的流动相系统大多可分为2大类：其一，采用甲醇-水为流动相，出峰时间一般在10 min左右[5]，使进样周期延长，试验效率大大降低；其二，采用甲醇-磷酸盐缓冲液为流动相，除了出峰时间长以外，缓冲盐对色谱柱的伤害大，若冲洗不干净极易堵塞柱子。
本试验选择更为精密、快速的UPLC进行测定，以乙腈-水为流动相进行分离。结果表明，以乙腈-水（50∶50）为流动相时，保留时间适宜。今后也可根据试验的不同要求调节流动相比例，以改变保留时间。
本试验对自制青藤散中的青藤碱进行了含量测定，所采用的方法快速、准确、灵敏度高、重复性好，对青藤碱其他剂型制剂（微乳、脂质体等）的质量控制也具有指导意义。
参考文献：
[1] 刘强，周莉玲，李锐，等.青藤碱的研究概况[J].中草药，1997，28（4）：247.
[2] 郭玉岩，李敏，史磊，等.HPLC法测定盐酸青藤外敷散中盐酸青藤碱含量[J].中国中医药信息杂志，2009，16（11）：42.
[3] 傅晓燕，黄巧玲.HPLC与UPLC法对比测定两种川芎药材中阿魏酸的含量[J].中药材，2011，34（7）：1070.
[4] 沙振方，孙文基.青风藤中青藤碱HPLC法测定[J].中药材，1989， 12（10）：34.
[5] 潘细贵，罗顺德，张先洲，等.高效液相色谱法测定青藤碱片中青藤碱的含量[J].时珍国医国药，2001，12（7）：593.
（收稿日期：2015-04-27；编辑：陈静）
