糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子和白细胞介素—1α的影响
蒿长英 陈明霞 马文斌 郭平 吕海波 刘晔 连增林
摘要：目的 探讨糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞EA.hy926中血管内皮细胞生长因子（VEGF）和白细胞介素（IL）-1α基因和蛋白表达的作用机制。方法 人脐静脉内皮细胞EA.hy926分为空白组、高糖组、全方组、部位1（苷类和黄酮类）组、部位2（有机酸类和多糖类）组和部位3（生物碱类）组。以D-葡萄糖干预细胞复制高糖模型，半定量RT-PCR检测糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导细胞中VEGF和IL-1α的基因表达；ELISA检测糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的细胞中VEGF和IL-1α的蛋白表达。结果 高糖导致EA.hy926细胞VEGF和IL-1α mRNA和蛋白表达显著升高（P<0.05）。糖网明目颗粒及其不同提取部位干预细胞后，VEGF和IL-1α基因和蛋白表达显著降低（P<0.05），变化幅度依次为：部位1>部位3>部位2。结论 糖网明目颗粒中苷类和黄酮类、生物碱类及有机酸类和多糖类调控高糖诱导的血管内皮细胞VEGF和IL-1α表达的作用强度依次减弱。
关键词：糖网明目颗粒；糖尿病视网膜病变；人脐静脉内皮细胞EA.hy926；血管内皮细胞生长因子；白细胞介素-1α
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）01-0056-04
Effects of Different Extracts of Tangwang Mingmu Granules on High Glucose Induced VEGF and IL-1α Expressions in Vascular Endothelial Cells HAO Chang-ying1， CHEN Ming-xia2， MA Wen-bin1， GUO Ping3， LV Hai-bo3， LIU Ye4， LIAN Zeng-lin4 （1. Beijing Red Sun Pharmaceutical Co.， Ltd.， Handian Group， Beijing 100103， China； 2. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China； 3. Beijing Handian Pharmaceutical Co.， Ltd， Handian Group， Beijing 100103， China； 4. Beijing Handian Academy of Chinese Medicine， Handian Group， Beijing 100103， China）
Abstract： Objective To observe the mechanism of action of different extracts of Tangwang Mingmu Granules on high glucose induced VEGF and IL-1α gene and protein expressions in vascular endothelial cells. Methods Human umbilical vein endothelial cells EA.hy926 were divided into six groups： blank， high glucose， Tangwang Mingmu Granules， extract 1 （glycoside and flavonoid）， extract 2 （organic acid and polysaccharides） and extract 3 （alkaloids） groups. High concentration glucose was used to establish the high glucose model in EA.hy926 cells. The expressions of VEGF and IL-1α mRNA were detected by semi-quantitative RT-PCR. The contents of VEGF and IL-1α protein were tested by ELISA. Results The gene expression and protein levels of VEGF and IL-1α were significantly up-regulated under the high glucose condition （P<0.05）. However， the above indicators were significantly reduced after the treatment of Tangwang Mingmu Granules. The activity of different parts of Tangwang Mingmu Granules was as follows： extract 1> extract 3> extract 2. Conclusion The action intensity of glycosides and flavonoids， alkaloids， organic acids and polysaccharides on VEGF and IL-1α expression in Tangwang Mingmu Granules weakens in sequence.
Key words： Tangwang Mingmu Granules； diabetic retinopathy； human umbilical vein endothelial cells EA.hy926； VEGF； IL-1α
糖网明目颗粒用于治疗糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）。本课题前期研究结果表明，糖网明目颗粒能明显改善糖尿病大鼠视网膜微血管病理学状态，降低血管生成相关因子的蛋白和基因水平[1-2]。本实验采用血管内皮细胞高糖模型，进一步探讨糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞EA.hy926中血管内皮细胞生长因子（VEGF）和白细胞介素-1α（IL-1α）基因和蛋白表达的作用机制。
1 实验材料
1.1 细胞
人脐静脉内皮细胞EA.hy 926购于中国科学院上海细胞库。
1.2 药物及提取部位
糖网明目颗粒处方由女贞子、乌梅、黄连、密蒙花、肉桂、黄芪、益母草组成，所用饮片购于安国市萌露中药饮片有限公司，经北京汉典中医研究院刘晔老师鉴定，均符合2010年版《中华人民共和国药典》标准。糖网明目颗粒提取物和不同提取部位由北京汉典中医研究院有限公司提供，采取醇提、水提相结合方法，将各饮片中的主要药效物质充分提取，最后经喷雾干燥制成提取物。其中，部位1为黄芪、女贞子、密蒙花提取物，主要含苷类和黄酮类物质；部位2为乌梅、肉桂提取物，主要含有机酸和多糖类物质；部位3为益母草、黄连提取物，主要含生物碱类物质。
1.3 主要试剂与仪器
胎牛血清（FBS），Hyclone，SH30070.03；高糖DMEM培养液，Hyclone，SH30022.01B；0.25%胰蛋白酶，Hyclone，SH30042.01B；DMSO，Amresco，0231）；青链霉素混合液，Solarbio，P1400-100；C8661-25G；RT-PCR试剂盒（TaKaRa，RR019A），ELISA试剂盒（北京鑫方程生物技术有限公司）。MCO-175二氧化碳培养箱（SANYO），BDS200倒置相差显微镜（奥特光学），DPL-ⅡA型喷雾制粒仪（重庆精工制药机械有限责任公司），BIOMATE型紫外可见分光光度计（Thermo），GE4852型PCR仪（杭州柏恒科技有限公司），JY600电泳仪（北京君意东方电子设备有限公司），ChampGel 5000型全自动凝胶成像系统（北京赛智创业科技有限公司），MULTLSKAN MK3酶标仪（Thermo）。
2 实验方法
2.1 细胞培养及药物干预
EA.hy926细胞第3代经胰酶消化，用普通培养液（含10%FBS、1×105 U/L青霉素、100 mg/L硫酸链霉素的高糖DMEM培养液）稀释成2.5×104/mL的细胞悬液，将3×106个细胞接种于25 cm2培养瓶中，普通培养液培养24 h后空白组换用普通培养液、高糖组换用D-葡萄糖培养液体外模拟EA.hy926细胞高糖模型，全方组换用D-葡萄糖+糖网明目颗粒培养液，部位1组换用D-葡萄糖+部位1培养液，部位2组换用D-葡萄糖+部位2培养液，部位3组换用D-葡萄糖+部位3培养液，继续培养24 h后提取总RNA。
糖网明目颗粒培养液制备：精密称定糖网明目颗粒提取物0.444 4 g至50 mL离心管中，于超净台内加无血清高糖DMEM培养液至40 mL，涡旋震荡使药物溶解，静置30 min后混匀，5000 r/min离心20 min，吸取上清液，用0.45 μm滤器无菌条件下过滤，加入4.44 mL FBS，混匀制成贮存液，封口，于4 ℃冰箱内保存备用。此时，贮存液含糖网明目颗粒提取物浓度为10 mg/mL，含10%FBS。临用时将贮存液梯度稀释至所需浓度2.5 mg/mL。其中，各提取部位按照其所占处方比例、提取率折算，相当于全方剂量，工作液配制方法同糖网明目颗粒全方。
D-葡萄糖培养液的制备：精密称定D-葡萄糖0.459 0 g至36 mL高糖DMEM培养液中，混匀溶解，过滤，加4 mL FBS，混匀，4 ℃封口保存。此时含葡萄糖100 mmol/L，10%FBS。临用时用相应液体稀释至40 mmol/L，混匀，进行细胞干预。
2.2 高糖细胞相关基因表达检测
细胞分组及药物干预同“2.1”项。药物干预24 h后，按照试剂盒说明书提取总RNA，以紫外分光光度法测定其浓度，检测其质量。按照试剂盒说明书进行反转录PCR反应，条件为：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，35个循环后转为4 ℃保存。以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测上述反应产物，用Lane ID凝胶图像分析软件对PCR产物进行半定量分析测定，基因表达水平以β-actin为参比。PCR引物由北京赛百盛公司合成，详见表1。
2.3 高糖细胞相关蛋白表达检测
细胞分组及药物干预同“2.1”项。药物干预24 h后，吸取细胞上清液至预冷的1.5 mL无菌EP管中，同组混匀，封口，-80 ℃保存备用。标准品按照说明书稀释好5个梯度，各梯度每孔加样量均为50 μL。分别设空白孔、待测样品孔，每组3个复孔。向待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL，混匀。封板膜封板后于37 ℃温育30 min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液重复洗5次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μL。封板膜封板后37 ℃温育30 min，如前法重复洗5次，拍干。每孔先加入50 μL显色剂A，再加入50 μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应。于450 nm波长处依序测各孔吸光度值（OD值）。以标准物浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子基因表达的影响
实验结果显示，血管内皮细胞高糖诱导24 h后，VEGF基因表达水平显著上调（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组、部位1组和部位3组VEGF基因表达水平显著下调（P<0.05），作用强弱顺序为：部位1组>全方组>部位3组；而部位2组显著上调（P <0.05）。提示在抑制因高糖导致的血管内皮细胞VEGF基因表达上调方面，糖网明目颗粒中部位1与部位3发挥了主要作用，而部位2未发挥与糖网明目颗粒全方相同的抑制作用。结果见图1。
4.2 糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子蛋白表达的影响
实验结果显示，血管内皮细胞高糖诱导24 h后，VEGF蛋白表达水平显著增高（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组、部位1组和部位3组VEGF蛋白表达水平显著下降（P<0.05），作用强弱为：部位1组>全方组>部位3组；而部位2组显著上调（P<0.05）。提示在抑制因高糖导致的血管内皮细胞VEGF蛋白表达方面，糖网明目颗粒中部位1和部位3发挥了主要作用，而部位2则未发挥与糖网明目颗粒全方相同的抑制作用。结果见图2。
4.3 糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的血管内皮细胞中白细胞介素-1α基因表达的影响
实验结果显示，血管内皮细胞高糖诱导24 h后，IL-1α基因表达水平显著上调（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组及各部位组IL-1α基因表达水平均显著下调（P<0.05），作用强弱为：部位1组>部位3组>部位2组>全方组。提示在抑制由于高糖导致的血管内皮细胞IL-1α基因表达方面，糖网明目颗粒各部位作用强度为：部位1>部位3>部位2。结果见图3。
β-actin
图3 各组血管内皮细胞IL-1α基因表达（—x±s，n=3）
4.4 糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的血管内皮细胞中白细胞介素-1α蛋白表达的影响
实验结果显示，血管内皮细胞高糖诱导24 h后，IL-1α蛋白表达水平升高（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组及各部位组IL-1α蛋白表达水平均显著下调（P<0.05），作用强弱为：全方组>部位1组>部位3组>部位2组。提示，在抑制由于高糖导致的血管内皮细胞IL-1α蛋白升高方面，糖网明目颗粒各部位的作用强度为：部位1>部位3>部位2。结果见图4。
5 讨论
DR是糖尿病微血管病变中主要的眼部并发症，其致盲的主要原因是由于新生血管引起反复的玻璃体出血和最终的牵引性视网膜脱离等一系列并发症[3]。高血糖是糖尿病最基本的病生理状态，亦是导致内皮功能紊乱的根本原因。糖尿病血管内皮细胞功能紊乱被认为是糖尿病血管并发症发生发展的起始步骤[4]。研究表明，高血糖通过氧化应激导致血管内皮细胞损伤和循环中内皮祖细胞数目下降且功能障碍，从而导致糖尿病伤口难以愈合、缺血心肌冠脉侧枝形成不良[5]。而VEGF是目前所知最强的内皮细胞选择性促有丝分裂肽和血管生成因子，与受体结合后，可刺激血管内皮细胞增殖及移行、细胞外基质变性，诱导新生血管的形成。其病理改变在本质上均是体内动态平衡的失调，血管刺激因素增强和/或抑制因素减少使两者平衡失调，最终引起新生血管生成。康氏等[6]临床观察显示，DR程度与血清VEGF含量直接正相关，提示血清VEGF含量测定可作为判定DR病变程度的参考指标。IL-1可能是视网膜炎症引起血视网膜屏障损害的重要因子，其可引起多核细胞和单核细胞向视网膜血管外迁移，血清蛋白向玻璃体内弥散及红细胞向玻璃体内渗漏等，造成视网膜血管内皮细胞间出现许多大裂隙，使血-视网膜屏障出现缺损，导致局部水肿、渗出、出血和细胞浸润，其对肿瘤坏死因子-α促进新生血管形成的效应也具有协同作用[7-8]。
本实验结果显示，糖网明目颗粒不同提取部位能不同程度地抑制高糖诱导的血管内皮细胞中VEGF和IL-1α基因和蛋白表达，其中以部位1作用最明显，部位3次之，部位2无此作用或作用不明显，这与DR发病机制和糖网明目颗粒组方规律一致。DR病机是气阴两虚，方中黄芪补气，女贞子补肝肾明目，密蒙花清热养肝、明目退翳，这3味药在方中比例较大，补气益肝肾，从根本上调理DR病程中之气阴两虚状态。另外，气虚致气血瘀滞；阴虚生热，煎熬津液，精亏液少，血黏不畅。方中益母草活血调经、利尿消肿，黄连清热燥湿、泻火解毒，而此2味药所含有的生物碱类物质如黄连素又有一定的抗炎作用，两者共用，能调理DR病程中阴虚夹热之瘀滞状态，改善DR病程中炎症反应。乌梅收敛生津止血，与黄芪配伍补气养血；肉桂补火助阳活血，与黄连配伍，水火既济，安神宁血，二者若单独使用，从本实验结果看药效不明显。
综上，在调控因高糖导致的血管内皮细胞VEGF和IL-1α基因和蛋白表达升高方面，糖网明目颗粒各部位作用强度为：部位1（苷类和黄酮类）>部位3（生物碱类）>部位2（有机酸和多糖类）。提示糖网明目颗粒及其不同提取物通过调控高糖状态下血管内皮细胞的VEGF和IL-1α基因和蛋白表达，从而抑制视网膜新生血管形成和改善视网膜局部水肿、渗出、出血和细胞浸润状态，进而达到防治DR的目的。
参考文献：
[1] 蒿长英，陈明霞，郭平，等.糖网明目颗粒对糖尿病大鼠视网膜病变的防治作用及机制研究[J].中国中医药信息杂志，2015，22（1）：62-66.
[2] 蒿长英，陈明霞，郭平，等.糖网明目颗粒提取物对缺氧/高糖状态下血管内皮细胞肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1α表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2015，22（8）：58-62.
[3] 朱洪丽.血管内皮细胞生长因子（VEGF）与增殖型糖尿病视网膜病变相关性的研究[D].沈阳：中国医科大学，2008.
[4] 刘慧，王小军，胡荣，等.星形胶质细胞[J].生理科学进展，2004，35（1）：86-91.
[5] PORTER J T， McCARTHY K D. Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals[J]. J Neurosci， 1996，16（16）：5073-5081.
[6] 康前雁，杨玉，王玉琴，等.糖尿病视网膜病变与血清VEGF含量的相关性[J].西安交通大学学报（医学版），2003，24（4）：392-393，402.
[7] KON C H， OCCLESTON N L， ANYLWARD G W， et al. Expression of vitreous cytokines in proliferative vitreoretinopathy：a pospective study[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1999，40：705-712.
[8] CLAUDIO L， MARTINEY J A， BROSNAN C F. Ultrastructural studies of the blood-retina barrier after exposure to interleukin-1 beta or tumor necrosis factor-alpha[J]. Lab Invest，1994，70：850-861.
（收稿日期：2015-04-14）
（修回日期：2015-10-21；编辑：华强）
摘要：目的 探讨糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞EA.hy926中血管内皮细胞生长因子（VEGF）和白细胞介素（IL）-1α基因和蛋白表达的作用机制。方法 人脐静脉内皮细胞EA.hy926分为空白组、高糖组、全方组、部位1（苷类和黄酮类）组、部位2（有机酸类和多糖类）组和部位3（生物碱类）组。以D-葡萄糖干预细胞复制高糖模型，半定量RT-PCR检测糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导细胞中VEGF和IL-1α的基因表达；ELISA检测糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的细胞中VEGF和IL-1α的蛋白表达。结果 高糖导致EA.hy926细胞VEGF和IL-1α mRNA和蛋白表达显著升高（P<0.05）。糖网明目颗粒及其不同提取部位干预细胞后，VEGF和IL-1α基因和蛋白表达显著降低（P<0.05），变化幅度依次为：部位1>部位3>部位2。结论 糖网明目颗粒中苷类和黄酮类、生物碱类及有机酸类和多糖类调控高糖诱导的血管内皮细胞VEGF和IL-1α表达的作用强度依次减弱。
关键词：糖网明目颗粒；糖尿病视网膜病变；人脐静脉内皮细胞EA.hy926；血管内皮细胞生长因子；白细胞介素-1α
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）01-0056-04
Effects of Different Extracts of Tangwang Mingmu Granules on High Glucose Induced VEGF and IL-1α Expressions in Vascular Endothelial Cells HAO Chang-ying1， CHEN Ming-xia2， MA Wen-bin1， GUO Ping3， LV Hai-bo3， LIU Ye4， LIAN Zeng-lin4 （1. Beijing Red Sun Pharmaceutical Co.， Ltd.， Handian Group， Beijing 100103， China； 2. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China； 3. Beijing Handian Pharmaceutical Co.， Ltd， Handian Group， Beijing 100103， China； 4. Beijing Handian Academy of Chinese Medicine， Handian Group， Beijing 100103， China）
Abstract： Objective To observe the mechanism of action of different extracts of Tangwang Mingmu Granules on high glucose induced VEGF and IL-1α gene and protein expressions in vascular endothelial cells. Methods Human umbilical vein endothelial cells EA.hy926 were divided into six groups： blank， high glucose， Tangwang Mingmu Granules， extract 1 （glycoside and flavonoid）， extract 2 （organic acid and polysaccharides） and extract 3 （alkaloids） groups. High concentration glucose was used to establish the high glucose model in EA.hy926 cells. The expressions of VEGF and IL-1α mRNA were detected by semi-quantitative RT-PCR. The contents of VEGF and IL-1α protein were tested by ELISA. Results The gene expression and protein levels of VEGF and IL-1α were significantly up-regulated under the high glucose condition （P<0.05）. However， the above indicators were significantly reduced after the treatment of Tangwang Mingmu Granules. The activity of different parts of Tangwang Mingmu Granules was as follows： extract 1> extract 3> extract 2. Conclusion The action intensity of glycosides and flavonoids， alkaloids， organic acids and polysaccharides on VEGF and IL-1α expression in Tangwang Mingmu Granules weakens in sequence.
Key words： Tangwang Mingmu Granules； diabetic retinopathy； human umbilical vein endothelial cells EA.hy926； VEGF； IL-1α
糖网明目颗粒用于治疗糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）。本课题前期研究结果表明，糖网明目颗粒能明显改善糖尿病大鼠视网膜微血管病理学状态，降低血管生成相关因子的蛋白和基因水平[1-2]。本实验采用血管内皮细胞高糖模型，进一步探讨糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞EA.hy926中血管内皮细胞生长因子（VEGF）和白细胞介素-1α（IL-1α）基因和蛋白表达的作用机制。
1 实验材料
1.1 细胞
人脐静脉内皮细胞EA.hy 926购于中国科学院上海细胞库。
1.2 药物及提取部位
糖网明目颗粒处方由女贞子、乌梅、黄连、密蒙花、肉桂、黄芪、益母草组成，所用饮片购于安国市萌露中药饮片有限公司，经北京汉典中医研究院刘晔老师鉴定，均符合2010年版《中华人民共和国药典》标准。糖网明目颗粒提取物和不同提取部位由北京汉典中医研究院有限公司提供，采取醇提、水提相结合方法，将各饮片中的主要药效物质充分提取，最后经喷雾干燥制成提取物。其中，部位1为黄芪、女贞子、密蒙花提取物，主要含苷类和黄酮类物质；部位2为乌梅、肉桂提取物，主要含有机酸和多糖类物质；部位3为益母草、黄连提取物，主要含生物碱类物质。
1.3 主要试剂与仪器
胎牛血清（FBS），Hyclone，SH30070.03；高糖DMEM培养液，Hyclone，SH30022.01B；0.25%胰蛋白酶，Hyclone，SH30042.01B；DMSO，Amresco，0231）；青链霉素混合液，Solarbio，P1400-100；C8661-25G；RT-PCR试剂盒（TaKaRa，RR019A），ELISA试剂盒（北京鑫方程生物技术有限公司）。MCO-175二氧化碳培养箱（SANYO），BDS200倒置相差显微镜（奥特光学），DPL-ⅡA型喷雾制粒仪（重庆精工制药机械有限责任公司），BIOMATE型紫外可见分光光度计（Thermo），GE4852型PCR仪（杭州柏恒科技有限公司），JY600电泳仪（北京君意东方电子设备有限公司），ChampGel 5000型全自动凝胶成像系统（北京赛智创业科技有限公司），MULTLSKAN MK3酶标仪（Thermo）。
2 实验方法
2.1 细胞培养及药物干预
EA.hy926细胞第3代经胰酶消化，用普通培养液（含10%FBS、1×105 U/L青霉素、100 mg/L硫酸链霉素的高糖DMEM培养液）稀释成2.5×104/mL的细胞悬液，将3×106个细胞接种于25 cm2培养瓶中，普通培养液培养24 h后空白组换用普通培养液、高糖组换用D-葡萄糖培养液体外模拟EA.hy926细胞高糖模型，全方组换用D-葡萄糖+糖网明目颗粒培养液，部位1组换用D-葡萄糖+部位1培养液，部位2组换用D-葡萄糖+部位2培养液，部位3组换用D-葡萄糖+部位3培养液，继续培养24 h后提取总RNA。
糖网明目颗粒培养液制备：精密称定糖网明目颗粒提取物0.444 4 g至50 mL离心管中，于超净台内加无血清高糖DMEM培养液至40 mL，涡旋震荡使药物溶解，静置30 min后混匀，5000 r/min离心20 min，吸取上清液，用0.45 μm滤器无菌条件下过滤，加入4.44 mL FBS，混匀制成贮存液，封口，于4 ℃冰箱内保存备用。此时，贮存液含糖网明目颗粒提取物浓度为10 mg/mL，含10%FBS。临用时将贮存液梯度稀释至所需浓度2.5 mg/mL。其中，各提取部位按照其所占处方比例、提取率折算，相当于全方剂量，工作液配制方法同糖网明目颗粒全方。
D-葡萄糖培养液的制备：精密称定D-葡萄糖0.459 0 g至36 mL高糖DMEM培养液中，混匀溶解，过滤，加4 mL FBS，混匀，4 ℃封口保存。此时含葡萄糖100 mmol/L，10%FBS。临用时用相应液体稀释至40 mmol/L，混匀，进行细胞干预。
2.2 高糖细胞相关基因表达检测
细胞分组及药物干预同“2.1”项。药物干预24 h后，按照试剂盒说明书提取总RNA，以紫外分光光度法测定其浓度，检测其质量。按照试剂盒说明书进行反转录PCR反应，条件为：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，35个循环后转为4 ℃保存。以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测上述反应产物，用Lane ID凝胶图像分析软件对PCR产物进行半定量分析测定，基因表达水平以β-actin为参比。PCR引物由北京赛百盛公司合成，详见表1。
2.3 高糖细胞相关蛋白表达检测
细胞分组及药物干预同“2.1”项。药物干预24 h后，吸取细胞上清液至预冷的1.5 mL无菌EP管中，同组混匀，封口，-80 ℃保存备用。标准品按照说明书稀释好5个梯度，各梯度每孔加样量均为50 μL。分别设空白孔、待测样品孔，每组3个复孔。向待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL，混匀。封板膜封板后于37 ℃温育30 min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液重复洗5次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μL。封板膜封板后37 ℃温育30 min，如前法重复洗5次，拍干。每孔先加入50 μL显色剂A，再加入50 μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应。于450 nm波长处依序测各孔吸光度值（OD值）。以标准物浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子基因表达的影响
实验结果显示，血管内皮细胞高糖诱导24 h后，VEGF基因表达水平显著上调（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组、部位1组和部位3组VEGF基因表达水平显著下调（P<0.05），作用强弱顺序为：部位1组>全方组>部位3组；而部位2组显著上调（P <0.05）。提示在抑制因高糖导致的血管内皮细胞VEGF基因表达上调方面，糖网明目颗粒中部位1与部位3发挥了主要作用，而部位2未发挥与糖网明目颗粒全方相同的抑制作用。结果见图1。
4.2 糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子蛋白表达的影响
实验结果显示，血管内皮细胞高糖诱导24 h后，VEGF蛋白表达水平显著增高（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组、部位1组和部位3组VEGF蛋白表达水平显著下降（P<0.05），作用强弱为：部位1组>全方组>部位3组；而部位2组显著上调（P<0.05）。提示在抑制因高糖导致的血管内皮细胞VEGF蛋白表达方面，糖网明目颗粒中部位1和部位3发挥了主要作用，而部位2则未发挥与糖网明目颗粒全方相同的抑制作用。结果见图2。
4.3 糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的血管内皮细胞中白细胞介素-1α基因表达的影响
实验结果显示，血管内皮细胞高糖诱导24 h后，IL-1α基因表达水平显著上调（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组及各部位组IL-1α基因表达水平均显著下调（P<0.05），作用强弱为：部位1组>部位3组>部位2组>全方组。提示在抑制由于高糖导致的血管内皮细胞IL-1α基因表达方面，糖网明目颗粒各部位作用强度为：部位1>部位3>部位2。结果见图3。
β-actin
图3 各组血管内皮细胞IL-1α基因表达（—x±s，n=3）
4.4 糖网明目颗粒不同提取部位对高糖诱导的血管内皮细胞中白细胞介素-1α蛋白表达的影响
实验结果显示，血管内皮细胞高糖诱导24 h后，IL-1α蛋白表达水平升高（P<0.05）；经药物干预24 h后，糖网明目颗粒全方组及各部位组IL-1α蛋白表达水平均显著下调（P<0.05），作用强弱为：全方组>部位1组>部位3组>部位2组。提示，在抑制由于高糖导致的血管内皮细胞IL-1α蛋白升高方面，糖网明目颗粒各部位的作用强度为：部位1>部位3>部位2。结果见图4。
5 讨论
DR是糖尿病微血管病变中主要的眼部并发症，其致盲的主要原因是由于新生血管引起反复的玻璃体出血和最终的牵引性视网膜脱离等一系列并发症[3]。高血糖是糖尿病最基本的病生理状态，亦是导致内皮功能紊乱的根本原因。糖尿病血管内皮细胞功能紊乱被认为是糖尿病血管并发症发生发展的起始步骤[4]。研究表明，高血糖通过氧化应激导致血管内皮细胞损伤和循环中内皮祖细胞数目下降且功能障碍，从而导致糖尿病伤口难以愈合、缺血心肌冠脉侧枝形成不良[5]。而VEGF是目前所知最强的内皮细胞选择性促有丝分裂肽和血管生成因子，与受体结合后，可刺激血管内皮细胞增殖及移行、细胞外基质变性，诱导新生血管的形成。其病理改变在本质上均是体内动态平衡的失调，血管刺激因素增强和/或抑制因素减少使两者平衡失调，最终引起新生血管生成。康氏等[6]临床观察显示，DR程度与血清VEGF含量直接正相关，提示血清VEGF含量测定可作为判定DR病变程度的参考指标。IL-1可能是视网膜炎症引起血视网膜屏障损害的重要因子，其可引起多核细胞和单核细胞向视网膜血管外迁移，血清蛋白向玻璃体内弥散及红细胞向玻璃体内渗漏等，造成视网膜血管内皮细胞间出现许多大裂隙，使血-视网膜屏障出现缺损，导致局部水肿、渗出、出血和细胞浸润，其对肿瘤坏死因子-α促进新生血管形成的效应也具有协同作用[7-8]。
本实验结果显示，糖网明目颗粒不同提取部位能不同程度地抑制高糖诱导的血管内皮细胞中VEGF和IL-1α基因和蛋白表达，其中以部位1作用最明显，部位3次之，部位2无此作用或作用不明显，这与DR发病机制和糖网明目颗粒组方规律一致。DR病机是气阴两虚，方中黄芪补气，女贞子补肝肾明目，密蒙花清热养肝、明目退翳，这3味药在方中比例较大，补气益肝肾，从根本上调理DR病程中之气阴两虚状态。另外，气虚致气血瘀滞；阴虚生热，煎熬津液，精亏液少，血黏不畅。方中益母草活血调经、利尿消肿，黄连清热燥湿、泻火解毒，而此2味药所含有的生物碱类物质如黄连素又有一定的抗炎作用，两者共用，能调理DR病程中阴虚夹热之瘀滞状态，改善DR病程中炎症反应。乌梅收敛生津止血，与黄芪配伍补气养血；肉桂补火助阳活血，与黄连配伍，水火既济，安神宁血，二者若单独使用，从本实验结果看药效不明显。
综上，在调控因高糖导致的血管内皮细胞VEGF和IL-1α基因和蛋白表达升高方面，糖网明目颗粒各部位作用强度为：部位1（苷类和黄酮类）>部位3（生物碱类）>部位2（有机酸和多糖类）。提示糖网明目颗粒及其不同提取物通过调控高糖状态下血管内皮细胞的VEGF和IL-1α基因和蛋白表达，从而抑制视网膜新生血管形成和改善视网膜局部水肿、渗出、出血和细胞浸润状态，进而达到防治DR的目的。
参考文献：
[1] 蒿长英，陈明霞，郭平，等.糖网明目颗粒对糖尿病大鼠视网膜病变的防治作用及机制研究[J].中国中医药信息杂志，2015，22（1）：62-66.
[2] 蒿长英，陈明霞，郭平，等.糖网明目颗粒提取物对缺氧/高糖状态下血管内皮细胞肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1α表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2015，22（8）：58-62.
[3] 朱洪丽.血管内皮细胞生长因子（VEGF）与增殖型糖尿病视网膜病变相关性的研究[D].沈阳：中国医科大学，2008.
[4] 刘慧，王小军，胡荣，等.星形胶质细胞[J].生理科学进展，2004，35（1）：86-91.
[5] PORTER J T， McCARTHY K D. Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals[J]. J Neurosci， 1996，16（16）：5073-5081.
[6] 康前雁，杨玉，王玉琴，等.糖尿病视网膜病变与血清VEGF含量的相关性[J].西安交通大学学报（医学版），2003，24（4）：392-393，402.
[7] KON C H， OCCLESTON N L， ANYLWARD G W， et al. Expression of vitreous cytokines in proliferative vitreoretinopathy：a pospective study[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1999，40：705-712.
[8] CLAUDIO L， MARTINEY J A， BROSNAN C F. Ultrastructural studies of the blood-retina barrier after exposure to interleukin-1 beta or tumor necrosis factor-alpha[J]. Lab Invest，1994，70：850-861.
（收稿日期：2015-04-14）
（修回日期：2015-10-21；编辑：华强）
