基于发卡探针DNA/G—四链体模拟酶结构转化的高灵敏无标记荧光检测DNA
宋璐娜 张永花 +薄红艳 高强
摘 要 建立了基于目标DNA诱导的发卡探针DNA转化为G-四链体DNA过氧化物模拟酶的非标记荧光增强型DNA检测新体系。发卡探针DNA即分子信标探针由两部分构成，环状部分与目标DNA互补，茎部一端由一条富G序列构成。无目标DNA存在时，分子信标处于闭合状态，形成发卡结构； 富G序列由于部分处于杂交状态，无法形成G四链体。当目标DNA与发卡探针DNA杂交并打开发卡结构，富G序列解链并自发折叠成G-四链体结构。G-四链体结构与血红素结合形成DNA模拟酶，催化H2O2还原的同时将无荧光的底物10-乙酰基-3，7-二羟基吩恶嗪（ADHP）氧化成荧光产物。通过测量荧光信号，实现对目标DNA的定量检测。优化后的体系检测条件为pH 8.0， 10 mmol/L K+， 0.2 μmol/L Hemin， 50 μmol/L ADHP。在优化的条件下，目标DNA在0.005～1.0 nmol/L浓度范围内与体系荧光信号呈线性关系，检出限为3.0 pmol/L。本方法可以区分完全互补和单碱基错配的目标DNA。
关键词 荧光； DNA； 发卡探针； G-四链体模拟酶； 结构转化
1 引 言
近年来，DNA检测在临床诊断、基因变异识别、环境监测、食品安全以及生物学研究等领域的应用愈加广泛，显示出良好的应用前景，引起了研究者的广泛关注[1]。常见的DNA检测方法包括聚合酶链式反应 （PCR） 法[2]、质谱法[3]、光谱法[4]、色谱法[5]、电化学法[6]等。在光谱分析中，荧光法具有操作简单、检测快速、灵敏度高和选择好等优点，是DNA定量检测时应用最广泛的方法之一[7]。
分子信标（Molecular beacon，MB）是一种常用的特异性检测目标DNA或RNA的DNA探针[8]。常规的MB茎环结构的两端通常需要标记荧光基团和淬灭基团，在无目标物存在时闭合形成发卡式的茎环结构，淬灭基团通过荧光共振能量转移的方式淬灭发光基团发出的荧光。当目标DNA与MB的环状区特异杂交之后，闭合的茎环发卡结构被打开，发光基团因远离淬灭基团而发出荧光，根据荧光信号的强度来定量目标DNA。得益于发卡状茎环结构，基于MB的DNA检测方法通常具有较高的选择性和灵敏度，但标记过程较为复杂耗时。此外，目标DNA和MB荧光标记分子的1∶1的比例关系也严重制约了基于MB方法灵敏度的提高[9]。因此，开发高灵敏度的免标记MB逐渐引起研究者的关注[10]。
近年来，DNA过氧化物模拟酶（DNAzyme）因其表现出过氧化物酶的活性，且具有稳定性好、成本低、易合成、易修饰等优点而成为传感器信号放大研究的热点[11～13]。DNAzyme是富含G碱基的单链寡核苷酸在一定条件下折叠成G-四链体结构，再与血红素结合形成的复合物。利用DNAzyme的催化活性，可以实现多种物质的高灵敏度检测，如金属离子[14]、小分子[15]、蛋白质[16]和DNA[17]等。在大部分过氧化物模拟酶催化体系中，主要采用2，2-联氮基双（ 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 二铵盐（ ABTS） 做为酶底物，通过比色法定量[18]。虽然比色分析法简单，但检测实际样品时干扰较多且灵敏度较荧光法低。因而开发基于DNAzyme催化活性的荧光检测体系逐渐引起了研究者的兴趣[19]。
本研究设计了免标记的发卡式荧光DNA分子探针，当探针与目标DNA特异性杂交后，发卡结构被打开，探针DNA的一部分会自发形成G-四链体，在血红素存在时表现出过氧化物酶的活性。以无荧光的10-乙酰基-3，7-二羟基吩恶嗪（ADHP）为模拟酶底物，利用其氧化产物具有荧光的性质实现了高灵敏的DNA检测。2 实验部分
2.1 仪器与试剂
UV-2400PC紫外可见分光光度计（日本岛津工公司）； F-7000 荧光仪（日本日立公司）； MIR系列PCR仪（东胜创新公司）。
ADHP、30% H2O2、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、TritonX-100（Sigma-Aldrich公司）； 血红素（Hemin）、二甲基亚砜（DMSO）、醋酸钾（Alfa Aesar公司）； 实验用水均为超纯水（≥18.2 Ω·cm）。Tris-HAc（pH 8.0）缓冲液（10 mmol/L Tris，10 mmol/L HAc，0.05%（w/V）TritonX-100）。Hemin 用 DMSO 配成5 mol/L储备液，-20℃暗处保存。ADHP 用DMSO配成20 mmol/L储备液，冷冻保存。使用时用Tris-HAc （pH 8.0） 缓冲液稀释到所需浓度。
2.2 实验方法
将目标DNA样品溶液加入DNA探针溶液中，在室温下反应1 h，使探针发卡结构打开。加入适量Tris-HAc缓冲液（ pH 8.0 ）及血红素，在室温下反应40 min，以形成DNA过氧化物模拟酶体系。然后，将ADHP和H2O2溶液加入到溶液中，室温反应1 h。用荧光仪测定溶液荧光，激发波长为540 nm，发射波长为581 nm。
3 结果与讨论
3.1 检测原理
免标记荧光检测DNA的原理如图1所示。非标记的发卡型DNA探针的茎状部分一端是富含G碱基的序列，与分子信标另一端茎状部分互补。
无目标序列存在时，分子信标处于闭合状态形成发卡结构，富含G碱基的序列无法形成G-四链体。当加入目标DNA后，分子信标环状部分与目标DNA进行杂交导致发卡结构被打开，从而使富含G碱基的序列游离出来，在K+和Hemin作用下形成具有过氧化物酶活性的DNA模拟酶。当加入H2O2和底物ADHP，本身不发荧光的ADHP被氧化成具有荧光的物质，通过测量体系的荧光信号达到检测目标DNA的目的。这种免标记分子信标的优点在于不需要在DNA探针上标记荧光基团和猝灭基团，而且由于引入了过氧化物模拟酶的催化反应，放大了信号，提高了测定灵敏度。
3.2 可行性验证
首先，对检测原理的可行性进行了验证。如图2所示，在没有目标DNA 时，体系具有微弱的荧光（图2曲线a）。由于血红素自身具有类过氧化物酶活性，但是催化活性极低，这一微弱荧光可能来自于血红素催化ADHP氧化为荧光产物。加入目标DNA 后，体系荧光信号明显增强，并且荧光强度随目标DNA的浓度的升高而增大（图2曲线b和c），荧光信号与目标DNA浓度具有相关性。为了证明荧光信号确实来自DNA模拟酶的催化作用，考察了溶液中没有血红素和没有DNA探针时体系的荧光，结果如图2曲线d和e所示。在没有血红素的情况下，体系并未表现出任何荧光，表明单独存在的G-四链体DNA本身并不会催化ADHP氧化。当没有DNA探针时，体系表现出类似于没有目标DNA时的微弱的荧光，表明目标DNA和血红素共存物也不能有效地催化无荧光的ADHP氧化为荧光产物。以上实验结果表明，只有在目标DNA存在下，与探针结合打开探针DNA的发卡结构，探针DNA的富G部分在K+存在下折叠成G-四链体DNA，然后与血红素结合形成复合物，从而表现出明显的过氧化物酶活性[19]。
3.3 实验条件的优化
为了提高目标DNA检测的灵敏度，对缓冲溶液pH值、K+浓度、血红素的浓度以及荧光底物的浓度进行了优化，结果如图3所示。从图3A可见，当缓冲溶液pH值从6.5增大到9.0，体系荧光强度随着pH值的增加先增加后减少，当pH=8.0时，荧光强度最大。这可能是由于溶液的pH值影响过氧化物模拟酶的活性。从图3B和3C可见，模拟酶的催化活性受溶液中K+、Hemin浓度的影响，这主要是由于K+影响G-四链体的折叠，而Hemin是模拟酶催化活性的核心[15]，二者浓度都对模拟酶的活性有较大影响。当K+浓度为10 mmol/L，Hemin浓度为0.2 μmol/L时，体系荧光强度达到最大值。从图3D可见，随着荧光底物ADHP的浓度的增加，荧光强度不断增大，当ADHP浓度为50 μmol/L时，体系荧光强度达到稳定值。综上所述，优化的检测体系溶液组成为： pH 8.0， 10 mmol/L K+， 0.2 μmol/L Hemin， 50 μmol/L ADHP。
3.4 工作曲线和检出限
在优化的实验条件下，考察了体系的荧光强度和目标DNA浓度的关系。结果如图4所示，荧光强度随目标DNA浓度增加而增大。荧光强度和目标DNA浓度在5×10
12～1×10
9 mol/L范围内呈良好的线性关系（图4B），线性方程F=1.26+0.047c （pmol/L），相关系数r=0.954。依据信噪比为3（S/N=3），确定体系检出限为 3.0 pmol/L。本方法对DNA的检测限优于文献[20～24]，证明本方法具有很高的灵敏度。
3.5 方法的选择性
发卡型DNA探针的最大特点在于其较高的单碱基变异区分能力。为了考察新型分子信标探针对完全互补和碱基错配的DNA序列的区分能力，将体系用于含单碱基错配、两碱基错配和非互补DNA序列的检测，结果如图5所示。相对于完全互补的目标DNA序列产生的荧光信号，单碱基错配DNA只产生了弱的荧光信号， 两碱基变异的DNA的荧光信号只有完全互补序列信号的十分之一， 非互补随机序列的目标DNA几乎没有引起体系荧光强度的变化。上述结果表明， 体系具有较高的单碱基区分能力，可以区分完全互补和碱基错配的DNA序列，具有较好的选择性。4 结 论
建立了高灵敏度、选择性荧光检测DNA的体系。设计了免标记的发卡型DNA分子探针，其特点在于当DNA探针发卡结构与目标DNA结合而打开后，探针序列的一部分会自发形成G-四链体，在血红素存在时表现出类过氧化物酶的活性。以无荧光的ADHP为模拟酶底物，利用其氧化产物具有荧光的性质实现了高灵敏度DNA检测。DNA模拟酶催化反应的引入，提高了检测的灵敏度，具有较高的灵敏度和较低的检出限（3.0 pmol/L）。本体系具有较好的选择性，可以区分完全互补和单碱基错配的DNA序列。
References
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10 GUO Qiu-Ping， ZHAO Xia-Yu， XIE Qin， WANG Ke-Min， WAN Jun， YUAN Bao-Yin， TAN Yu-Yu. Chem. J. Chinese Universies， 2014， 35（8）： 1646-1651
郭秋平， 赵下雨， 谢 琴， 王柯敏， 万 俊， 袁宝银， 谭誉宇. 高等学校化学学报， 2014， 35（8）： 1646-1651
11 Zhang Y F， Li B X， Jin Y. Analyst， 2011， 136（16）： 3268-3273
12 Wang F A， Freage L， Orbach R， Willner I. Anal. Chem.， 2013， 85（17）： 8196-8203
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段娜娜， 王 娜， 杨 薇， 孔德明. 分析化学， 2014， 42（10）： 1414-1420
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摘 要 建立了基于目标DNA诱导的发卡探针DNA转化为G-四链体DNA过氧化物模拟酶的非标记荧光增强型DNA检测新体系。发卡探针DNA即分子信标探针由两部分构成，环状部分与目标DNA互补，茎部一端由一条富G序列构成。无目标DNA存在时，分子信标处于闭合状态，形成发卡结构； 富G序列由于部分处于杂交状态，无法形成G四链体。当目标DNA与发卡探针DNA杂交并打开发卡结构，富G序列解链并自发折叠成G-四链体结构。G-四链体结构与血红素结合形成DNA模拟酶，催化H2O2还原的同时将无荧光的底物10-乙酰基-3，7-二羟基吩恶嗪（ADHP）氧化成荧光产物。通过测量荧光信号，实现对目标DNA的定量检测。优化后的体系检测条件为pH 8.0， 10 mmol/L K+， 0.2 μmol/L Hemin， 50 μmol/L ADHP。在优化的条件下，目标DNA在0.005～1.0 nmol/L浓度范围内与体系荧光信号呈线性关系，检出限为3.0 pmol/L。本方法可以区分完全互补和单碱基错配的目标DNA。
关键词 荧光； DNA； 发卡探针； G-四链体模拟酶； 结构转化
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本研究设计了免标记的发卡式荧光DNA分子探针，当探针与目标DNA特异性杂交后，发卡结构被打开，探针DNA的一部分会自发形成G-四链体，在血红素存在时表现出过氧化物酶的活性。以无荧光的10-乙酰基-3，7-二羟基吩恶嗪（ADHP）为模拟酶底物，利用其氧化产物具有荧光的性质实现了高灵敏的DNA检测。2 实验部分
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2.2 实验方法
将目标DNA样品溶液加入DNA探针溶液中，在室温下反应1 h，使探针发卡结构打开。加入适量Tris-HAc缓冲液（ pH 8.0 ）及血红素，在室温下反应40 min，以形成DNA过氧化物模拟酶体系。然后，将ADHP和H2O2溶液加入到溶液中，室温反应1 h。用荧光仪测定溶液荧光，激发波长为540 nm，发射波长为581 nm。
3 结果与讨论
3.1 检测原理
免标记荧光检测DNA的原理如图1所示。非标记的发卡型DNA探针的茎状部分一端是富含G碱基的序列，与分子信标另一端茎状部分互补。
无目标序列存在时，分子信标处于闭合状态形成发卡结构，富含G碱基的序列无法形成G-四链体。当加入目标DNA后，分子信标环状部分与目标DNA进行杂交导致发卡结构被打开，从而使富含G碱基的序列游离出来，在K+和Hemin作用下形成具有过氧化物酶活性的DNA模拟酶。当加入H2O2和底物ADHP，本身不发荧光的ADHP被氧化成具有荧光的物质，通过测量体系的荧光信号达到检测目标DNA的目的。这种免标记分子信标的优点在于不需要在DNA探针上标记荧光基团和猝灭基团，而且由于引入了过氧化物模拟酶的催化反应，放大了信号，提高了测定灵敏度。
3.2 可行性验证
首先，对检测原理的可行性进行了验证。如图2所示，在没有目标DNA 时，体系具有微弱的荧光（图2曲线a）。由于血红素自身具有类过氧化物酶活性，但是催化活性极低，这一微弱荧光可能来自于血红素催化ADHP氧化为荧光产物。加入目标DNA 后，体系荧光信号明显增强，并且荧光强度随目标DNA的浓度的升高而增大（图2曲线b和c），荧光信号与目标DNA浓度具有相关性。为了证明荧光信号确实来自DNA模拟酶的催化作用，考察了溶液中没有血红素和没有DNA探针时体系的荧光，结果如图2曲线d和e所示。在没有血红素的情况下，体系并未表现出任何荧光，表明单独存在的G-四链体DNA本身并不会催化ADHP氧化。当没有DNA探针时，体系表现出类似于没有目标DNA时的微弱的荧光，表明目标DNA和血红素共存物也不能有效地催化无荧光的ADHP氧化为荧光产物。以上实验结果表明，只有在目标DNA存在下，与探针结合打开探针DNA的发卡结构，探针DNA的富G部分在K+存在下折叠成G-四链体DNA，然后与血红素结合形成复合物，从而表现出明显的过氧化物酶活性[19]。
3.3 实验条件的优化
为了提高目标DNA检测的灵敏度，对缓冲溶液pH值、K+浓度、血红素的浓度以及荧光底物的浓度进行了优化，结果如图3所示。从图3A可见，当缓冲溶液pH值从6.5增大到9.0，体系荧光强度随着pH值的增加先增加后减少，当pH=8.0时，荧光强度最大。这可能是由于溶液的pH值影响过氧化物模拟酶的活性。从图3B和3C可见，模拟酶的催化活性受溶液中K+、Hemin浓度的影响，这主要是由于K+影响G-四链体的折叠，而Hemin是模拟酶催化活性的核心[15]，二者浓度都对模拟酶的活性有较大影响。当K+浓度为10 mmol/L，Hemin浓度为0.2 μmol/L时，体系荧光强度达到最大值。从图3D可见，随着荧光底物ADHP的浓度的增加，荧光强度不断增大，当ADHP浓度为50 μmol/L时，体系荧光强度达到稳定值。综上所述，优化的检测体系溶液组成为： pH 8.0， 10 mmol/L K+， 0.2 μmol/L Hemin， 50 μmol/L ADHP。
3.4 工作曲线和检出限
在优化的实验条件下，考察了体系的荧光强度和目标DNA浓度的关系。结果如图4所示，荧光强度随目标DNA浓度增加而增大。荧光强度和目标DNA浓度在5×10
12～1×10
9 mol/L范围内呈良好的线性关系（图4B），线性方程F=1.26+0.047c （pmol/L），相关系数r=0.954。依据信噪比为3（S/N=3），确定体系检出限为 3.0 pmol/L。本方法对DNA的检测限优于文献[20～24]，证明本方法具有很高的灵敏度。
3.5 方法的选择性
发卡型DNA探针的最大特点在于其较高的单碱基变异区分能力。为了考察新型分子信标探针对完全互补和碱基错配的DNA序列的区分能力，将体系用于含单碱基错配、两碱基错配和非互补DNA序列的检测，结果如图5所示。相对于完全互补的目标DNA序列产生的荧光信号，单碱基错配DNA只产生了弱的荧光信号， 两碱基变异的DNA的荧光信号只有完全互补序列信号的十分之一， 非互补随机序列的目标DNA几乎没有引起体系荧光强度的变化。上述结果表明， 体系具有较高的单碱基区分能力，可以区分完全互补和碱基错配的DNA序列，具有较好的选择性。4 结 论
建立了高灵敏度、选择性荧光检测DNA的体系。设计了免标记的发卡型DNA分子探针，其特点在于当DNA探针发卡结构与目标DNA结合而打开后，探针序列的一部分会自发形成G-四链体，在血红素存在时表现出类过氧化物酶的活性。以无荧光的ADHP为模拟酶底物，利用其氧化产物具有荧光的性质实现了高灵敏度DNA检测。DNA模拟酶催化反应的引入，提高了检测的灵敏度，具有较高的灵敏度和较低的检出限（3.0 pmol/L）。本体系具有较好的选择性，可以区分完全互补和单碱基错配的DNA序列。
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