电针对大鼠局灶性脑缺血后神经元损伤保护作用的研究
许能贵 易 玮等
△许能贵易玮马勤耘许冠荪朱舜丽陈全珠(安徽中医学院针灸经络研究所,合肥230038)
摘要选择凝闭大鼠大脑中动脉致局灶性脑缺血为模型,观察电针对缺血区各指标的影响。结果:①造模60min后,局部脑血流量(rCBF)、超氧化物歧化酶(SOD)、单胺类神经递质均显著下降;脑组织水含量、丙二醛(MDA)、兴奋性氨基酸(EAA)中谷氨酸(Glu)和天门冬氨酸(Asp)明显升高。②电针10min后,上述指标均得到改善。提示电针可升高rCBF、SOD活性和中枢单胺类神经递质,降低MDA、Glu、Asp和脑组织的水含量,从而保护脑缺血后继发性神经元损伤。
主题词电针脑缺血/针灸疗法神经元/针灸效应
脑血管疾病是目前公认的人类三大致死疾病之一,其中缺血性脑血管疾病发病率在我国高达70%,国外高达80%以上。由于脑缺血后神经元损伤一旦达到不可逆阶段,就无法自然修复,后果严重,因而探讨其有效的防治措施和发病机理,是国内外医学研究的热点和重点。本实验选择凝闭大脑中动脉致大鼠局灶性脑缺血为模型,以rCBF、脑组织水含量、SOD、MDA、脑内EAA和单胺类神经递质等为指标,观察电针对其影响,并进一步探讨电针防治缺血性脑损伤的机理。
1材料和方法
1.1实验动物
选用健康Wistar大鼠,体重200～300 g,雌雄不拘,由安徽中医学院针灸经络研究所标准动物房提供。将动物随机分为假手术对照组、缺血组、缺血加电针组。
1.2模型建立
将动物用10%水合氯醛溶液,按400 mg/kg量腹腔麻醉,取右侧向上侧卧位固定,沿耳眼连线中点切开皮肤,分离颞肌,暴露颞骨作一骨窗,轻抬脑,暴露大脑中动脉,用烧红的不锈钢丝轻触大脑中动脉,使之凝闭,清创缝合伤口,待测各项指标。
假手术对照组:只作手术,不凝闭大脑中动脉。
缺血组:造模后60 min将大鼠迅速断头处死,取出大脑,然后按各指标所要求的部分进行分离切割,称重,备用。
缺血加电针组:在缺血60 min后,再电针"大椎"、"百会"穴10 min(穴位定位参照大鼠常用的针灸穴位琜1])。"大椎"穴在第七颈椎与第一胸椎间,背部正中;"百会"穴在顶骨正中。电针应用我所研制的PCE-A型程控电针仪,5～10次/s,疏密波,强度以大鼠轻度颤动为度,时间10 min。
1.3局部脑血流量测定
用笔者使用过的方法琜2]进行测定和计算。铂金丝电极从大鼠右侧颅骨打孔后插入。
1.4脑组织水含量测定
以干湿法琜3]测脑组织水含量。将断头取出的右侧额顶叶脑组织立即放在分析天平上称取湿脑重(wt),然后在100 ℃±2 ℃烤箱中烤至恒重,再称取干脑重。根据公式计算脑水分百分含量值:
1.5SOD活性及MDA含量测定
按实验程序将大鼠迅速断头取右侧额顶叶脑组织,以4 ℃生理盐水制成10%匀浆液,离心取上清液测定。SOD采用邻苯三酚自氧化法测定,试剂盒由武汉海军抗衰老研究中心提供。MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定,试剂盒由北京军事医学科学院提供。具体操作严格按试剂盒说明书进行。
1.6脑内兴奋性氨基酸含量测定
按实验程序,将大鼠断头处死,迅速取右侧额顶叶脑组织,称重,加4%磺基水杨酸5 ml匀浆,置高速冷冻离心机离心,10 min取上清液上机待测。用日立835-50型氨基酸分析仪测试EAA含量。微型计算机控制自动进样。数据用834数据处理机处理。
1.7中枢单胺类神经递质的测定
按实验程序,将大鼠断头处死,迅速取出全脑,分离各脑区(皮质部取右额顶叶部分皮质,约相当于半球的前1/3部分,脑干部取全脑干),立即冷冻,然后参照何美霞等方法琜4],用正丁醇、庚烷匀浆分离后提取,日本岛津-MPF-4型荧光分光光度计测定NE、DA和5-HT的含量。
2结果
2.1电针对rCBF、脑组织水含量、SOD和MDA含量的影响
造模致大鼠局灶性脑缺血60 min后,在缺血区,局部脑血流量有非常显著下降(P<0.01),脑组织水含量也明显增高(P<0.01),SOD活性显著下降(P<0.05),MDA含量明显升高(P<0.05)。而在缺血加电针组中,经过电针治疗10 min后,则rCBF显著升高(P<0.05),脑组织水含量明显下降,SOD活性明显增强(P<0.01),MDA含量则显著下降,和假手术组相比,差异均无显著性意义(P>0.05)。见表1、表2。
2.2电针对局灶性脑缺血大鼠EAA含量的影响
凝闭大脑中动脉致局灶性脑缺血60 min后,在缺血区,Glu和Asp均升高,和假手术对照组相比,差异有非常显著性意义(P<0.01)。给予电针10 min后,则Glu、Asp明显下降,和缺血组相比,差异具有显著性意义,和假手术组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。见表3。
2.3电针对局灶性脑缺血大鼠中枢单胺类神经递质的影响
局灶性脑缺血大鼠在缺血60 min后,缺血区(皮质部)都出现单胺类神经递质较假手术组的含量降低,以DA、5-HT下降最为明显(P<0.01),NE也有明显下降(P<0.05)。而在缺血加电针组中,则发现均有非常明显升高(P<0.01)。在非缺血区(脑干),造模后单胺类神经递质( 除DA外)无明显变化(P>0.05),但给予电针10 min后,则出现不同程度的升高趋势。见表4。
3讨论
缺血性脑损害的中心问题之一是氧和能量的耗竭。增加脑组织氧和血流的供应量,是防治缺血性脑损害的关键。实验结果证实,大鼠在局灶性脑缺血时,rCBF大幅度下降,但给予电针10 min后,则rCBF显著升至正常水平,和假手术组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。提示电针可改善脑血流量,阻止脑缺血后血流量的下降,从而保护缺血性脑神经元的损伤。这与电针调节脑血管运动平衡,使脑血流量增加、脑组织氧含量和能量代谢得到改善有关。
脑水肿是缺血性脑损伤的主要病理之一,因而减轻脑水肿是改善缺血性脑损伤的重要标志之一琜5]。实验观察到,局灶性脑缺血大鼠在造模60 min后,在缺血区脑组织水含量明显升高,电针10 min后脑组织水含量明显降低,提示电针可减轻脑水肿,从而保护缺血性脑损伤。
众多的研究证明琜6],氧自由基及其介导的脂质过氧化连锁反应是引起缺血性脑损伤的主要原因。脑缺血时由于大量氧自由基过耗了SOD,致使脑组织内SOD活性降低,清除自由基能力下降,蓄积过剩的自由基与脑组织生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化连锁反应,产生大量MDA,使脑组织生物膜结构与功能受到损伤,从而引起细胞损伤直至死亡。实验结果证实,在局灶性脑缺血大鼠的缺血区,SOD活性较假手术组明显下降,MDA含量显著升高。但在缺血加电针组中,给予电针治疗10 min,在缺血区脑组织中SOD活性明显增强,MDA含量也显著下降。提示电针可提高脑缺血后脑内SOD的活性,降低MDA含量,从而保护脑缺血神经元的损伤。
Glu和Asp是中枢神经系统内含量最高、分布最广泛的EAA类神经递质。现代研究证实琜7],EAA在缺氧、缺血、持续癫痫、脑外伤等所致急性神经元损伤中起着关键性作用。正常情况下,细胞外EAA的浓度受神经元和胶质细胞的高摄取系统所控制,不会积累到致神经元损伤的浓度。在上述几种病理情况下,细胞外EAA浓度由于神经元释放增加,重摄取减少和死亡细胞内EAA大量溢出而大幅度增加。实验结果证实,大鼠在局灶性脑缺血的缺血区,Glu、Asp均有非常显著性升高,给予电针督脉经"大椎"、"百会"穴10 min后,缺血区脑组织内Glu、Asp均有非常明显降低,和缺血组相比,差异具有非常显著性意义(P<0.01),和假手术对照组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。提示,电针可通过降低缺血区脑组织中的EAA,从而保护脑缺血后继发神经元的损伤。
多数的实验表明琜8],在脑缺血期,脑内单胺类递质的含量降低,认为含量降低的原因是受损伤的神经轴索或神经末梢突触对单胺类递质的贮存和摄取功能减弱或丧失,大量的神经递质释放进入突触间隙和脑实质中,并向血管周围弥散,故脑中的含量下降。对脑血管疾病患者检测血、尿及脑脊液中单胺类神经递质的升高现象也证明了这一点。结果与多数报道相似,大鼠在局灶性脑缺血后,缺血区(皮质部)的NE、DA和5-HT的含量均降低,而在非缺血区(脑干部)则含量变化不明显。给予电针刺激10 min后,则发现在缺血区,可使NE、DA和5-HT非常明显地上升直至接近正常水平。提示电针可升高中枢单胺类神经递质,纠正脑缺血后单胺类神经递质的代谢紊乱,从而保护脑缺血性损害。在实验中还发现,在局灶性脑缺血大鼠的非缺血区(脑干)部位,除DA外,NE和5-HT的含量无明显改变,但电针10 min后,其含量均有不同程度的升高。过去在针刺镇痛研究中有过结果相一致的类似报道琜9],但在本实验中,这一结果是否有利于促进保护脑缺血性损害尚有待进一步研究。但不管怎样,作为一种针刺治疗或调整的效应来讲,应该是有积极作用的。
本实验电针穴位选用督脉经穴,是基于中医学中的奇经对整个经络系统具有组合统率作用,督脉是奇经八脉主体之一,是人体诸阳经之总汇,其所属穴位主治适应症相当广泛,历代医家多有"病变在脑,首取督脉"之说,多年的针灸临床证明,以督脉经穴为主,治疗缺血性中风,疗效较好。
5参考文献
1林文注.实验针灸学.上海:上海科学技术出版社,1994:286
2许能贵,许冠荪,钟平,等.电针督脉经穴对急性脑缺血大鼠一氧化氮及内皮素的影响.针刺研究,1996;21(3):18
3Kaniya T,et al.The Role of Bradykin in Mediating Ischemic Brain Edem a in Rats.Stroke,1993;24:371
4何美霞,可君,李志刚.脑组织中单胺类神经递质含量测定.河南医科大学学报,1996;31(1):113
5闵宝珍,杨世方,于占久.血液光量子疗法对局灶性脑缺血大鼠大脑皮层局部血流和脑水肿的影响.中国神经精神疾病杂志,1993;19(1):20
6张道杰,吴玉生,彭立义,等.SOD、MDA测定对补阳还五汤治疗早期缺血性中风疗效评估.新中医,1996;(5):117
7韩济生,关新民.医用神经生物学.武汉:武汉出版社,1996:126
8张昱.神经递质和脑卒中.中风与神经疾病杂志,1987;4(2):128
9韩济生.神经科学纲要.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1993:839(收稿日期:1999-04-21,齐淑兰发稿)
△许能贵易玮马勤耘许冠荪朱舜丽陈全珠(安徽中医学院针灸经络研究所,合肥230038)
摘要选择凝闭大鼠大脑中动脉致局灶性脑缺血为模型,观察电针对缺血区各指标的影响。结果:①造模60min后,局部脑血流量(rCBF)、超氧化物歧化酶(SOD)、单胺类神经递质均显著下降;脑组织水含量、丙二醛(MDA)、兴奋性氨基酸(EAA)中谷氨酸(Glu)和天门冬氨酸(Asp)明显升高。②电针10min后,上述指标均得到改善。提示电针可升高rCBF、SOD活性和中枢单胺类神经递质,降低MDA、Glu、Asp和脑组织的水含量,从而保护脑缺血后继发性神经元损伤。
主题词电针脑缺血/针灸疗法神经元/针灸效应
脑血管疾病是目前公认的人类三大致死疾病之一,其中缺血性脑血管疾病发病率在我国高达70%,国外高达80%以上。由于脑缺血后神经元损伤一旦达到不可逆阶段,就无法自然修复,后果严重,因而探讨其有效的防治措施和发病机理,是国内外医学研究的热点和重点。本实验选择凝闭大脑中动脉致大鼠局灶性脑缺血为模型,以rCBF、脑组织水含量、SOD、MDA、脑内EAA和单胺类神经递质等为指标,观察电针对其影响,并进一步探讨电针防治缺血性脑损伤的机理。
1材料和方法
1.1实验动物
选用健康Wistar大鼠,体重200～300 g,雌雄不拘,由安徽中医学院针灸经络研究所标准动物房提供。将动物随机分为假手术对照组、缺血组、缺血加电针组。
1.2模型建立
将动物用10%水合氯醛溶液,按400 mg/kg量腹腔麻醉,取右侧向上侧卧位固定,沿耳眼连线中点切开皮肤,分离颞肌,暴露颞骨作一骨窗,轻抬脑,暴露大脑中动脉,用烧红的不锈钢丝轻触大脑中动脉,使之凝闭,清创缝合伤口,待测各项指标。
假手术对照组:只作手术,不凝闭大脑中动脉。
缺血组:造模后60 min将大鼠迅速断头处死,取出大脑,然后按各指标所要求的部分进行分离切割,称重,备用。
缺血加电针组:在缺血60 min后,再电针"大椎"、"百会"穴10 min(穴位定位参照大鼠常用的针灸穴位琜1])。"大椎"穴在第七颈椎与第一胸椎间,背部正中;"百会"穴在顶骨正中。电针应用我所研制的PCE-A型程控电针仪,5～10次/s,疏密波,强度以大鼠轻度颤动为度,时间10 min。
1.3局部脑血流量测定
用笔者使用过的方法琜2]进行测定和计算。铂金丝电极从大鼠右侧颅骨打孔后插入。
1.4脑组织水含量测定
以干湿法琜3]测脑组织水含量。将断头取出的右侧额顶叶脑组织立即放在分析天平上称取湿脑重(wt),然后在100 ℃±2 ℃烤箱中烤至恒重,再称取干脑重。根据公式计算脑水分百分含量值:
1.5SOD活性及MDA含量测定
按实验程序将大鼠迅速断头取右侧额顶叶脑组织,以4 ℃生理盐水制成10%匀浆液,离心取上清液测定。SOD采用邻苯三酚自氧化法测定,试剂盒由武汉海军抗衰老研究中心提供。MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定,试剂盒由北京军事医学科学院提供。具体操作严格按试剂盒说明书进行。
1.6脑内兴奋性氨基酸含量测定
按实验程序,将大鼠断头处死,迅速取右侧额顶叶脑组织,称重,加4%磺基水杨酸5 ml匀浆,置高速冷冻离心机离心,10 min取上清液上机待测。用日立835-50型氨基酸分析仪测试EAA含量。微型计算机控制自动进样。数据用834数据处理机处理。
1.7中枢单胺类神经递质的测定
按实验程序,将大鼠断头处死,迅速取出全脑,分离各脑区(皮质部取右额顶叶部分皮质,约相当于半球的前1/3部分,脑干部取全脑干),立即冷冻,然后参照何美霞等方法琜4],用正丁醇、庚烷匀浆分离后提取,日本岛津-MPF-4型荧光分光光度计测定NE、DA和5-HT的含量。
2结果
2.1电针对rCBF、脑组织水含量、SOD和MDA含量的影响
造模致大鼠局灶性脑缺血60 min后,在缺血区,局部脑血流量有非常显著下降(P<0.01),脑组织水含量也明显增高(P<0.01),SOD活性显著下降(P<0.05),MDA含量明显升高(P<0.05)。而在缺血加电针组中,经过电针治疗10 min后,则rCBF显著升高(P<0.05),脑组织水含量明显下降,SOD活性明显增强(P<0.01),MDA含量则显著下降,和假手术组相比,差异均无显著性意义(P>0.05)。见表1、表2。
2.2电针对局灶性脑缺血大鼠EAA含量的影响
凝闭大脑中动脉致局灶性脑缺血60 min后,在缺血区,Glu和Asp均升高,和假手术对照组相比,差异有非常显著性意义(P<0.01)。给予电针10 min后,则Glu、Asp明显下降,和缺血组相比,差异具有显著性意义,和假手术组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。见表3。
2.3电针对局灶性脑缺血大鼠中枢单胺类神经递质的影响局灶性脑缺血大鼠在缺血60 min后,缺血区(皮质部)都出现单胺类神经递质较假手术组的含量降低,以DA、5-HT下降最为明显(P<0.01),NE也有明显下降(P<0.05)。而在缺血加电针组中,则发现均有非常明显升高(P<0.01)。在非缺血区(脑干),造模后单胺类神经递质( 除DA外)无明显变化(P>0.05),但给予电针10 min后,则出现不同程度的升高趋势。见表4。
3讨论
缺血性脑损害的中心问题之一是氧和能量的耗竭。增加脑组织氧和血流的供应量,是防治缺血性脑损害的关键。实验结果证实,大鼠在局灶性脑缺血时,rCBF大幅度下降,但给予电针10 min后,则rCBF显著升至正常水平,和假手术组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。提示电针可改善脑血流量,阻止脑缺血后血流量的下降,从而保护缺血性脑神经元的损伤。这与电针调节脑血管运动平衡,使脑血流量增加、脑组织氧含量和能量代谢得到改善有关。
脑水肿是缺血性脑损伤的主要病理之一,因而减轻脑水肿是改善缺血性脑损伤的重要标志之一琜5]。实验观察到,局灶性脑缺血大鼠在造模60 min后,在缺血区脑组织水含量明显升高,电针10 min后脑组织水含量明显降低,提示电针可减轻脑水肿,从而保护缺血性脑损伤。
众多的研究证明琜6],氧自由基及其介导的脂质过氧化连锁反应是引起缺血性脑损伤的主要原因。脑缺血时由于大量氧自由基过耗了SOD,致使脑组织内SOD活性降低,清除自由基能力下降,蓄积过剩的自由基与脑组织生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化连锁反应,产生大量MDA,使脑组织生物膜结构与功能受到损伤,从而引起细胞损伤直至死亡。实验结果证实,在局灶性脑缺血大鼠的缺血区,SOD活性较假手术组明显下降,MDA含量显著升高。但在缺血加电针组中,给予电针治疗10 min,在缺血区脑组织中SOD活性明显增强,MDA含量也显著下降。提示电针可提高脑缺血后脑内SOD的活性,降低MDA含量,从而保护脑缺血神经元的损伤。
Glu和Asp是中枢神经系统内含量最高、分布最广泛的EAA类神经递质。现代研究证实琜7],EAA在缺氧、缺血、持续癫痫、脑外伤等所致急性神经元损伤中起着关键性作用。正常情况下,细胞外EAA的浓度受神经元和胶质细胞的高摄取系统所控制,不会积累到致神经元损伤的浓度。在上述几种病理情况下,细胞外EAA浓度由于神经元释放增加,重摄取减少和死亡细胞内EAA大量溢出而大幅度增加。实验结果证实,大鼠在局灶性脑缺血的缺血区,Glu、Asp均有非常显著性升高,给予电针督脉经"大椎"、"百会"穴10 min后,缺血区脑组织内Glu、Asp均有非常明显降低,和缺血组相比,差异具有非常显著性意义(P<0.01),和假手术对照组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。提示,电针可通过降低缺血区脑组织中的EAA,从而保护脑缺血后继发神经元的损伤。
多数的实验表明琜8],在脑缺血期,脑内单胺类递质的含量降低,认为含量降低的原因是受损伤的神经轴索或神经末梢突触对单胺类递质的贮存和摄取功能减弱或丧失,大量的神经递质释放进入突触间隙和脑实质中,并向血管周围弥散,故脑中的含量下降。对脑血管疾病患者检测血、尿及脑脊液中单胺类神经递质的升高现象也证明了这一点。结果与多数报道相似,大鼠在局灶性脑缺血后,缺血区(皮质部)的NE、DA和5-HT的含量均降低,而在非缺血区(脑干部)则含量变化不明显。给予电针刺激10 min后,则发现在缺血区,可使NE、DA和5-HT非常明显地上升直至接近正常水平。提示电针可升高中枢单胺类神经递质,纠正脑缺血后单胺类神经递质的代谢紊乱,从而保护脑缺血性损害。在实验中还发现,在局灶性脑缺血大鼠的非缺血区(脑干)部位,除DA外,NE和5-HT的含量无明显改变,但电针10 min后,其含量均有不同程度的升高。过去在针刺镇痛研究中有过结果相一致的类似报道琜9],但在本实验中,这一结果是否有利于促进保护脑缺血性损害尚有待进一步研究。但不管怎样,作为一种针刺治疗或调整的效应来讲,应该是有积极作用的。
本实验电针穴位选用督脉经穴,是基于中医学中的奇经对整个经络系统具有组合统率作用,督脉是奇经八脉主体之一,是人体诸阳经之总汇,其所属穴位主治适应症相当广泛,历代医家多有"病变在脑,首取督脉"之说,多年的针灸临床证明,以督脉经穴为主,治疗缺血性中风,疗效较好。
5参考文献
1林文注.实验针灸学.上海:上海科学技术出版社,1994:286
2许能贵,许冠荪,钟平,等.电针督脉经穴对急性脑缺血大鼠一氧化氮及内皮素的影响.针刺研究,1996;21(3):18
3Kaniya T,et al.The Role of Bradykin in Mediating Ischemic Brain Edem a in Rats.Stroke,1993;24:371
4何美霞,可君,李志刚.脑组织中单胺类神经递质含量测定.河南医科大学学报,1996;31(1):113
5闵宝珍,杨世方,于占久.血液光量子疗法对局灶性脑缺血大鼠大脑皮层局部血流和脑水肿的影响.中国神经精神疾病杂志,1993;19(1):20
6张道杰,吴玉生,彭立义,等.SOD、MDA测定对补阳还五汤治疗早期缺血性中风疗效评估.新中医,1996;(5):117
7韩济生,关新民.医用神经生物学.武汉:武汉出版社,1996:126
8张昱.神经递质和脑卒中.中风与神经疾病杂志,1987;4(2):128
9韩济生.神经科学纲要.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1993:839(收稿日期:1999-04-21,齐淑兰发稿)
