尺寸排阻色谱电感耦合等离子体质谱联用测定功能饮料、多维片及奶粉中维生素B12
刘德晔 谷静等
摘要 建立了固相微萃取（SPE）柱净化，尺寸排阻色谱电感耦合等离子体质谱（SECICPMS）联用测定功能饮料、多维片和婴儿奶粉中维生素B12含量的方法，方法检出限为 0.4 μg/L，维生素B12在1.0～150 μg/L范围内线性良好，回归系数R>0.999。实验表明，乙腈作为维生素B12标准品溶剂可改善维生素B12的色谱行为，用乙腈作为SPE柱洗脱液比甲醇效果好。在婴儿奶粉的前处理过程中，三氯甲烷作为蛋白沉淀剂得到的维生素B12回收率较高。功能饮料、多维片和3种婴儿奶粉的检测结果与商品标示值接近，相对标准偏差RSD均小于 5%（n=6），功能饮料、多维片的平均加标回收率为97%和90%，5种奶粉的平均加标回收率范围为88%～92%，表明本方法能够满足日常分析的要求。
关键词 尺寸排阻色谱，电感耦合等离子体质谱，维生素B12，婴儿奶粉
1引言
维生素B12是一族含钴的维生素，又称钴胺素，根据取代基的不同可分为氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺，高等动物无法自身合成钴胺素，只能从食物中摄取，钴胺素在红细胞生成、神经系统发育及某些蛋白质的合成的过程中产生重要作用。钴胺素中甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺均不稳定，添加于保健品和婴儿奶粉中的钴胺素为人工合成的氰钴胺[1～3]，氰钴胺是以钴为中心的配合物，其分子量为1355.4，含钴量为4.3%。中国国家标准规定婴儿奶粉中必须添加维生素B12， 其含量范围经换算后为10～72 ng/g， 市售婴儿奶粉维生素B12添加量集中在10～20 ng/g[4]。
目前，保健品中维生素B12测定国标方法为液相色谱法（HPLC）[5]，但HPLC方法因灵敏度较低，只适用于维生素B12含量较高的保健品的测定，无法实际测得含量在 ng/g级婴儿奶粉中的维生素B12[6～8]，因此中国国家标准方法采用复杂且耗时的微生物法[9]测定。近年来，一些色谱质谱联用技术（LCMS）尝试测定传统方法较难检测的维生素B12[10]。Luo等[11]等利用酶消解的方法消除了保健品和奶粉中蛋白质，再用LCMS测得了维生素B12的含量，色谱保留时间约为9 min， 方法检出限为2 ng/g，但基质干扰较为严重。Raju等[12]采用溶解离心取清液的方式提取早餐谷物和多维片中的维生素B12， 再由基于C18柱的HPLCICPMS联用测定，保留时间为9 min，方法检出限小于1 ng/g。Yang等[13]采用微波辅助萃取的方式提取保健品中的维生素B12，再由基于C18柱的HPLCICPMS定量测定，保留时间为9 min。Baker等[14]采用CEICPMS联用的方法研究了各种钴胺素的色谱行为。Guggisberg等[15]用免疫亲和柱富集HPLC检测的方法测定了肉类食品中维生素B12的含量，富集后的检出限为2 ng/g。
近年来，色谱电感耦合等离子质谱联用技术在食品、生物材料、环境等领域有有广泛的应用[16～20]，它结合了色谱的高效分离优势和电感耦合等离子体质谱的高灵敏度和低干扰的优点，除了用于形态分析， 还可用于传统方法难测得的痕量组分的测定。本实验采用固相微萃取柱富集SECICPMS联用测定功能饮料、多维片和婴儿奶粉中的人为添加的维生素B12。与传统国标法相比， 本方法取样量小、试剂人工消耗少、周期短，尤其对奶粉的测定具有独特优势，与基于C18柱的HPLCICPMS联用的方法相比，本方法不需要会影响雾化效率的高浓度甲醇作为流动相，灵敏度高，峰型尖锐， 分析时间短，分析了文献未尝试较难测定的奶粉样品[11，12]。随着色谱电感耦合等离子体质谱联用技术的普及，基于SECHPLCMS测定维生素B12的方法会得到广泛的应用。
2实验部分
2.1仪器与试剂
LC20AB液相色谱仪（日本岛津公司），BioSeps2000尺寸排阻色谱柱可分离0.87～300 kDa的物质（美国菲罗门公司）；X7电感耦合等离子体质谱仪及其工作站（美国Thermal）；色谱与ICPMS用Peek管相连，电子触发采集数据；绘图软件OriginPro 7.0；MilliQ Gradient超纯水净化器（美国Millipore）；318型离心机（美国Sigma公司）；0.22 μm有机滤膜（中国楚定科技公司）；OASIS HLB C18 SPE柱（3 mL，60 mg，美国Waters公司）。
钴标准溶液1000 mg/L（美国Spex公司）；维生素B12（氰钴胺，美国SigmaAldrich公司）；NaH2PO4， Na2HPO4， HCl和NaOH均为分析纯，乙腈、甲醇均为色谱纯；功能饮料、多维片、5个奶粉样品采集于商场的品牌奶粉（编号1～5），所采集样品已注明添加的维生素B12为氰钴胺。
2.2SEC色谱条件以及ICPMS条件
2.2.1SEC色谱条件ICPMS在无加氧装置的情况下不耐受有机流动相，因此本实验流动相为无机磷酸缓冲盐，但高浓度的磷酸缓冲盐会使采样锥和截取锥口处沉积盐分，选择低浓度磷酸盐有利于保护仪器，最终实验采用10 mmol/L磷酸盐溶液作为流动相，流速为0.7 mL/min。
通常，高容量的定量环有利于提高灵敏度，但实验在洗脱SPE柱时采用了有机溶剂，而进样液中大量有机溶剂会使ICPMS熄火，考察20， 50 ，100和200 μL的定量环后， 确定50 μL试液不会使ICPMS熄灭，实验采用50 μL定量环。
2.2.2ICPMS条件选择Co59作为定量同位素，经调谐仪器主要参数如表1所示。
摘要 建立了固相微萃取（SPE）柱净化，尺寸排阻色谱电感耦合等离子体质谱（SECICPMS）联用测定功能饮料、多维片和婴儿奶粉中维生素B12含量的方法，方法检出限为 0.4 μg/L，维生素B12在1.0～150 μg/L范围内线性良好，回归系数R>0.999。实验表明，乙腈作为维生素B12标准品溶剂可改善维生素B12的色谱行为，用乙腈作为SPE柱洗脱液比甲醇效果好。在婴儿奶粉的前处理过程中，三氯甲烷作为蛋白沉淀剂得到的维生素B12回收率较高。功能饮料、多维片和3种婴儿奶粉的检测结果与商品标示值接近，相对标准偏差RSD均小于 5%（n=6），功能饮料、多维片的平均加标回收率为97%和90%，5种奶粉的平均加标回收率范围为88%～92%，表明本方法能够满足日常分析的要求。
关键词 尺寸排阻色谱，电感耦合等离子体质谱，维生素B12，婴儿奶粉
1引言
维生素B12是一族含钴的维生素，又称钴胺素，根据取代基的不同可分为氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺，高等动物无法自身合成钴胺素，只能从食物中摄取，钴胺素在红细胞生成、神经系统发育及某些蛋白质的合成的过程中产生重要作用。钴胺素中甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺均不稳定，添加于保健品和婴儿奶粉中的钴胺素为人工合成的氰钴胺[1～3]，氰钴胺是以钴为中心的配合物，其分子量为1355.4，含钴量为4.3%。中国国家标准规定婴儿奶粉中必须添加维生素B12， 其含量范围经换算后为10～72 ng/g， 市售婴儿奶粉维生素B12添加量集中在10～20 ng/g[4]。
目前，保健品中维生素B12测定国标方法为液相色谱法（HPLC）[5]，但HPLC方法因灵敏度较低，只适用于维生素B12含量较高的保健品的测定，无法实际测得含量在 ng/g级婴儿奶粉中的维生素B12[6～8]，因此中国国家标准方法采用复杂且耗时的微生物法[9]测定。近年来，一些色谱质谱联用技术（LCMS）尝试测定传统方法较难检测的维生素B12[10]。Luo等[11]等利用酶消解的方法消除了保健品和奶粉中蛋白质，再用LCMS测得了维生素B12的含量，色谱保留时间约为9 min， 方法检出限为2 ng/g，但基质干扰较为严重。Raju等[12]采用溶解离心取清液的方式提取早餐谷物和多维片中的维生素B12， 再由基于C18柱的HPLCICPMS联用测定，保留时间为9 min，方法检出限小于1 ng/g。Yang等[13]采用微波辅助萃取的方式提取保健品中的维生素B12，再由基于C18柱的HPLCICPMS定量测定，保留时间为9 min。Baker等[14]采用CEICPMS联用的方法研究了各种钴胺素的色谱行为。Guggisberg等[15]用免疫亲和柱富集HPLC检测的方法测定了肉类食品中维生素B12的含量，富集后的检出限为2 ng/g。
近年来，色谱电感耦合等离子质谱联用技术在食品、生物材料、环境等领域有有广泛的应用[16～20]，它结合了色谱的高效分离优势和电感耦合等离子体质谱的高灵敏度和低干扰的优点，除了用于形态分析， 还可用于传统方法难测得的痕量组分的测定。本实验采用固相微萃取柱富集SECICPMS联用测定功能饮料、多维片和婴儿奶粉中的人为添加的维生素B12。与传统国标法相比， 本方法取样量小、试剂人工消耗少、周期短，尤其对奶粉的测定具有独特优势，与基于C18柱的HPLCICPMS联用的方法相比，本方法不需要会影响雾化效率的高浓度甲醇作为流动相，灵敏度高，峰型尖锐， 分析时间短，分析了文献未尝试较难测定的奶粉样品[11，12]。随着色谱电感耦合等离子体质谱联用技术的普及，基于SECHPLCMS测定维生素B12的方法会得到广泛的应用。
2实验部分
2.1仪器与试剂
LC20AB液相色谱仪（日本岛津公司），BioSeps2000尺寸排阻色谱柱可分离0.87～300 kDa的物质（美国菲罗门公司）；X7电感耦合等离子体质谱仪及其工作站（美国Thermal）；色谱与ICPMS用Peek管相连，电子触发采集数据；绘图软件OriginPro 7.0；MilliQ Gradient超纯水净化器（美国Millipore）；318型离心机（美国Sigma公司）；0.22 μm有机滤膜（中国楚定科技公司）；OASIS HLB C18 SPE柱（3 mL，60 mg，美国Waters公司）。
钴标准溶液1000 mg/L（美国Spex公司）；维生素B12（氰钴胺，美国SigmaAldrich公司）；NaH2PO4， Na2HPO4， HCl和NaOH均为分析纯，乙腈、甲醇均为色谱纯；功能饮料、多维片、5个奶粉样品采集于商场的品牌奶粉（编号1～5），所采集样品已注明添加的维生素B12为氰钴胺。
2.2SEC色谱条件以及ICPMS条件
2.2.1SEC色谱条件ICPMS在无加氧装置的情况下不耐受有机流动相，因此本实验流动相为无机磷酸缓冲盐，但高浓度的磷酸缓冲盐会使采样锥和截取锥口处沉积盐分，选择低浓度磷酸盐有利于保护仪器，最终实验采用10 mmol/L磷酸盐溶液作为流动相，流速为0.7 mL/min。
通常，高容量的定量环有利于提高灵敏度，但实验在洗脱SPE柱时采用了有机溶剂，而进样液中大量有机溶剂会使ICPMS熄火，考察20， 50 ，100和200 μL的定量环后， 确定50 μL试液不会使ICPMS熄灭，实验采用50 μL定量环。
2.2.2ICPMS条件选择Co59作为定量同位素，经调谐仪器主要参数如表1所示。
摘要 建立了固相微萃取（SPE）柱净化，尺寸排阻色谱电感耦合等离子体质谱（SECICPMS）联用测定功能饮料、多维片和婴儿奶粉中维生素B12含量的方法，方法检出限为 0.4 μg/L，维生素B12在1.0～150 μg/L范围内线性良好，回归系数R>0.999。实验表明，乙腈作为维生素B12标准品溶剂可改善维生素B12的色谱行为，用乙腈作为SPE柱洗脱液比甲醇效果好。在婴儿奶粉的前处理过程中，三氯甲烷作为蛋白沉淀剂得到的维生素B12回收率较高。功能饮料、多维片和3种婴儿奶粉的检测结果与商品标示值接近，相对标准偏差RSD均小于 5%（n=6），功能饮料、多维片的平均加标回收率为97%和90%，5种奶粉的平均加标回收率范围为88%～92%，表明本方法能够满足日常分析的要求。
关键词 尺寸排阻色谱，电感耦合等离子体质谱，维生素B12，婴儿奶粉
1引言
维生素B12是一族含钴的维生素，又称钴胺素，根据取代基的不同可分为氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺，高等动物无法自身合成钴胺素，只能从食物中摄取，钴胺素在红细胞生成、神经系统发育及某些蛋白质的合成的过程中产生重要作用。钴胺素中甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺均不稳定，添加于保健品和婴儿奶粉中的钴胺素为人工合成的氰钴胺[1～3]，氰钴胺是以钴为中心的配合物，其分子量为1355.4，含钴量为4.3%。中国国家标准规定婴儿奶粉中必须添加维生素B12， 其含量范围经换算后为10～72 ng/g， 市售婴儿奶粉维生素B12添加量集中在10～20 ng/g[4]。
目前，保健品中维生素B12测定国标方法为液相色谱法（HPLC）[5]，但HPLC方法因灵敏度较低，只适用于维生素B12含量较高的保健品的测定，无法实际测得含量在 ng/g级婴儿奶粉中的维生素B12[6～8]，因此中国国家标准方法采用复杂且耗时的微生物法[9]测定。近年来，一些色谱质谱联用技术（LCMS）尝试测定传统方法较难检测的维生素B12[10]。Luo等[11]等利用酶消解的方法消除了保健品和奶粉中蛋白质，再用LCMS测得了维生素B12的含量，色谱保留时间约为9 min， 方法检出限为2 ng/g，但基质干扰较为严重。Raju等[12]采用溶解离心取清液的方式提取早餐谷物和多维片中的维生素B12， 再由基于C18柱的HPLCICPMS联用测定，保留时间为9 min，方法检出限小于1 ng/g。Yang等[13]采用微波辅助萃取的方式提取保健品中的维生素B12，再由基于C18柱的HPLCICPMS定量测定，保留时间为9 min。Baker等[14]采用CEICPMS联用的方法研究了各种钴胺素的色谱行为。Guggisberg等[15]用免疫亲和柱富集HPLC检测的方法测定了肉类食品中维生素B12的含量，富集后的检出限为2 ng/g。
近年来，色谱电感耦合等离子质谱联用技术在食品、生物材料、环境等领域有有广泛的应用[16～20]，它结合了色谱的高效分离优势和电感耦合等离子体质谱的高灵敏度和低干扰的优点，除了用于形态分析， 还可用于传统方法难测得的痕量组分的测定。本实验采用固相微萃取柱富集SECICPMS联用测定功能饮料、多维片和婴儿奶粉中的人为添加的维生素B12。与传统国标法相比， 本方法取样量小、试剂人工消耗少、周期短，尤其对奶粉的测定具有独特优势，与基于C18柱的HPLCICPMS联用的方法相比，本方法不需要会影响雾化效率的高浓度甲醇作为流动相，灵敏度高，峰型尖锐， 分析时间短，分析了文献未尝试较难测定的奶粉样品[11，12]。随着色谱电感耦合等离子体质谱联用技术的普及，基于SECHPLCMS测定维生素B12的方法会得到广泛的应用。
2实验部分
2.1仪器与试剂
LC20AB液相色谱仪（日本岛津公司），BioSeps2000尺寸排阻色谱柱可分离0.87～300 kDa的物质（美国菲罗门公司）；X7电感耦合等离子体质谱仪及其工作站（美国Thermal）；色谱与ICPMS用Peek管相连，电子触发采集数据；绘图软件OriginPro 7.0；MilliQ Gradient超纯水净化器（美国Millipore）；318型离心机（美国Sigma公司）；0.22 μm有机滤膜（中国楚定科技公司）；OASIS HLB C18 SPE柱（3 mL，60 mg，美国Waters公司）。
钴标准溶液1000 mg/L（美国Spex公司）；维生素B12（氰钴胺，美国SigmaAldrich公司）；NaH2PO4， Na2HPO4， HCl和NaOH均为分析纯，乙腈、甲醇均为色谱纯；功能饮料、多维片、5个奶粉样品采集于商场的品牌奶粉（编号1～5），所采集样品已注明添加的维生素B12为氰钴胺。
2.2SEC色谱条件以及ICPMS条件
2.2.1SEC色谱条件ICPMS在无加氧装置的情况下不耐受有机流动相，因此本实验流动相为无机磷酸缓冲盐，但高浓度的磷酸缓冲盐会使采样锥和截取锥口处沉积盐分，选择低浓度磷酸盐有利于保护仪器，最终实验采用10 mmol/L磷酸盐溶液作为流动相，流速为0.7 mL/min。
通常，高容量的定量环有利于提高灵敏度，但实验在洗脱SPE柱时采用了有机溶剂，而进样液中大量有机溶剂会使ICPMS熄火，考察20， 50 ，100和200 μL的定量环后， 确定50 μL试液不会使ICPMS熄灭，实验采用50 μL定量环。
2.2.2ICPMS条件选择Co59作为定量同位素，经调谐仪器主要参数如表1所示。
摘要 建立了固相微萃取（SPE）柱净化，尺寸排阻色谱电感耦合等离子体质谱（SECICPMS）联用测定功能饮料、多维片和婴儿奶粉中维生素B12含量的方法，方法检出限为 0.4 μg/L，维生素B12在1.0～150 μg/L范围内线性良好，回归系数R>0.999。实验表明，乙腈作为维生素B12标准品溶剂可改善维生素B12的色谱行为，用乙腈作为SPE柱洗脱液比甲醇效果好。在婴儿奶粉的前处理过程中，三氯甲烷作为蛋白沉淀剂得到的维生素B12回收率较高。功能饮料、多维片和3种婴儿奶粉的检测结果与商品标示值接近，相对标准偏差RSD均小于 5%（n=6），功能饮料、多维片的平均加标回收率为97%和90%，5种奶粉的平均加标回收率范围为88%～92%，表明本方法能够满足日常分析的要求。
关键词 尺寸排阻色谱，电感耦合等离子体质谱，维生素B12，婴儿奶粉
1引言
维生素B12是一族含钴的维生素，又称钴胺素，根据取代基的不同可分为氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺，高等动物无法自身合成钴胺素，只能从食物中摄取，钴胺素在红细胞生成、神经系统发育及某些蛋白质的合成的过程中产生重要作用。钴胺素中甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺均不稳定，添加于保健品和婴儿奶粉中的钴胺素为人工合成的氰钴胺[1～3]，氰钴胺是以钴为中心的配合物，其分子量为1355.4，含钴量为4.3%。中国国家标准规定婴儿奶粉中必须添加维生素B12， 其含量范围经换算后为10～72 ng/g， 市售婴儿奶粉维生素B12添加量集中在10～20 ng/g[4]。
目前，保健品中维生素B12测定国标方法为液相色谱法（HPLC）[5]，但HPLC方法因灵敏度较低，只适用于维生素B12含量较高的保健品的测定，无法实际测得含量在 ng/g级婴儿奶粉中的维生素B12[6～8]，因此中国国家标准方法采用复杂且耗时的微生物法[9]测定。近年来，一些色谱质谱联用技术（LCMS）尝试测定传统方法较难检测的维生素B12[10]。Luo等[11]等利用酶消解的方法消除了保健品和奶粉中蛋白质，再用LCMS测得了维生素B12的含量，色谱保留时间约为9 min， 方法检出限为2 ng/g，但基质干扰较为严重。Raju等[12]采用溶解离心取清液的方式提取早餐谷物和多维片中的维生素B12， 再由基于C18柱的HPLCICPMS联用测定，保留时间为9 min，方法检出限小于1 ng/g。Yang等[13]采用微波辅助萃取的方式提取保健品中的维生素B12，再由基于C18柱的HPLCICPMS定量测定，保留时间为9 min。Baker等[14]采用CEICPMS联用的方法研究了各种钴胺素的色谱行为。Guggisberg等[15]用免疫亲和柱富集HPLC检测的方法测定了肉类食品中维生素B12的含量，富集后的检出限为2 ng/g。
近年来，色谱电感耦合等离子质谱联用技术在食品、生物材料、环境等领域有有广泛的应用[16～20]，它结合了色谱的高效分离优势和电感耦合等离子体质谱的高灵敏度和低干扰的优点，除了用于形态分析， 还可用于传统方法难测得的痕量组分的测定。本实验采用固相微萃取柱富集SECICPMS联用测定功能饮料、多维片和婴儿奶粉中的人为添加的维生素B12。与传统国标法相比， 本方法取样量小、试剂人工消耗少、周期短，尤其对奶粉的测定具有独特优势，与基于C18柱的HPLCICPMS联用的方法相比，本方法不需要会影响雾化效率的高浓度甲醇作为流动相，灵敏度高，峰型尖锐， 分析时间短，分析了文献未尝试较难测定的奶粉样品[11，12]。随着色谱电感耦合等离子体质谱联用技术的普及，基于SECHPLCMS测定维生素B12的方法会得到广泛的应用。
2实验部分
2.1仪器与试剂
LC20AB液相色谱仪（日本岛津公司），BioSeps2000尺寸排阻色谱柱可分离0.87～300 kDa的物质（美国菲罗门公司）；X7电感耦合等离子体质谱仪及其工作站（美国Thermal）；色谱与ICPMS用Peek管相连，电子触发采集数据；绘图软件OriginPro 7.0；MilliQ Gradient超纯水净化器（美国Millipore）；318型离心机（美国Sigma公司）；0.22 μm有机滤膜（中国楚定科技公司）；OASIS HLB C18 SPE柱（3 mL，60 mg，美国Waters公司）。
钴标准溶液1000 mg/L（美国Spex公司）；维生素B12（氰钴胺，美国SigmaAldrich公司）；NaH2PO4， Na2HPO4， HCl和NaOH均为分析纯，乙腈、甲醇均为色谱纯；功能饮料、多维片、5个奶粉样品采集于商场的品牌奶粉（编号1～5），所采集样品已注明添加的维生素B12为氰钴胺。
2.2SEC色谱条件以及ICPMS条件
2.2.1SEC色谱条件ICPMS在无加氧装置的情况下不耐受有机流动相，因此本实验流动相为无机磷酸缓冲盐，但高浓度的磷酸缓冲盐会使采样锥和截取锥口处沉积盐分，选择低浓度磷酸盐有利于保护仪器，最终实验采用10 mmol/L磷酸盐溶液作为流动相，流速为0.7 mL/min。
通常，高容量的定量环有利于提高灵敏度，但实验在洗脱SPE柱时采用了有机溶剂，而进样液中大量有机溶剂会使ICPMS熄火，考察20， 50 ，100和200 μL的定量环后， 确定50 μL试液不会使ICPMS熄灭，实验采用50 μL定量环。
2.2.2ICPMS条件选择Co59作为定量同位素，经调谐仪器主要参数如表1所示。
摘要 建立了固相微萃取（SPE）柱净化，尺寸排阻色谱电感耦合等离子体质谱（SECICPMS）联用测定功能饮料、多维片和婴儿奶粉中维生素B12含量的方法，方法检出限为 0.4 μg/L，维生素B12在1.0～150 μg/L范围内线性良好，回归系数R>0.999。实验表明，乙腈作为维生素B12标准品溶剂可改善维生素B12的色谱行为，用乙腈作为SPE柱洗脱液比甲醇效果好。在婴儿奶粉的前处理过程中，三氯甲烷作为蛋白沉淀剂得到的维生素B12回收率较高。功能饮料、多维片和3种婴儿奶粉的检测结果与商品标示值接近，相对标准偏差RSD均小于 5%（n=6），功能饮料、多维片的平均加标回收率为97%和90%，5种奶粉的平均加标回收率范围为88%～92%，表明本方法能够满足日常分析的要求。
关键词 尺寸排阻色谱，电感耦合等离子体质谱，维生素B12，婴儿奶粉
1引言
维生素B12是一族含钴的维生素，又称钴胺素，根据取代基的不同可分为氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺，高等动物无法自身合成钴胺素，只能从食物中摄取，钴胺素在红细胞生成、神经系统发育及某些蛋白质的合成的过程中产生重要作用。钴胺素中甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺均不稳定，添加于保健品和婴儿奶粉中的钴胺素为人工合成的氰钴胺[1～3]，氰钴胺是以钴为中心的配合物，其分子量为1355.4，含钴量为4.3%。中国国家标准规定婴儿奶粉中必须添加维生素B12， 其含量范围经换算后为10～72 ng/g， 市售婴儿奶粉维生素B12添加量集中在10～20 ng/g[4]。
目前，保健品中维生素B12测定国标方法为液相色谱法（HPLC）[5]，但HPLC方法因灵敏度较低，只适用于维生素B12含量较高的保健品的测定，无法实际测得含量在 ng/g级婴儿奶粉中的维生素B12[6～8]，因此中国国家标准方法采用复杂且耗时的微生物法[9]测定。近年来，一些色谱质谱联用技术（LCMS）尝试测定传统方法较难检测的维生素B12[10]。Luo等[11]等利用酶消解的方法消除了保健品和奶粉中蛋白质，再用LCMS测得了维生素B12的含量，色谱保留时间约为9 min， 方法检出限为2 ng/g，但基质干扰较为严重。Raju等[12]采用溶解离心取清液的方式提取早餐谷物和多维片中的维生素B12， 再由基于C18柱的HPLCICPMS联用测定，保留时间为9 min，方法检出限小于1 ng/g。Yang等[13]采用微波辅助萃取的方式提取保健品中的维生素B12，再由基于C18柱的HPLCICPMS定量测定，保留时间为9 min。Baker等[14]采用CEICPMS联用的方法研究了各种钴胺素的色谱行为。Guggisberg等[15]用免疫亲和柱富集HPLC检测的方法测定了肉类食品中维生素B12的含量，富集后的检出限为2 ng/g。
近年来，色谱电感耦合等离子质谱联用技术在食品、生物材料、环境等领域有有广泛的应用[16～20]，它结合了色谱的高效分离优势和电感耦合等离子体质谱的高灵敏度和低干扰的优点，除了用于形态分析， 还可用于传统方法难测得的痕量组分的测定。本实验采用固相微萃取柱富集SECICPMS联用测定功能饮料、多维片和婴儿奶粉中的人为添加的维生素B12。与传统国标法相比， 本方法取样量小、试剂人工消耗少、周期短，尤其对奶粉的测定具有独特优势，与基于C18柱的HPLCICPMS联用的方法相比，本方法不需要会影响雾化效率的高浓度甲醇作为流动相，灵敏度高，峰型尖锐， 分析时间短，分析了文献未尝试较难测定的奶粉样品[11，12]。随着色谱电感耦合等离子体质谱联用技术的普及，基于SECHPLCMS测定维生素B12的方法会得到广泛的应用。
2实验部分
2.1仪器与试剂
LC20AB液相色谱仪（日本岛津公司），BioSeps2000尺寸排阻色谱柱可分离0.87～300 kDa的物质（美国菲罗门公司）；X7电感耦合等离子体质谱仪及其工作站（美国Thermal）；色谱与ICPMS用Peek管相连，电子触发采集数据；绘图软件OriginPro 7.0；MilliQ Gradient超纯水净化器（美国Millipore）；318型离心机（美国Sigma公司）；0.22 μm有机滤膜（中国楚定科技公司）；OASIS HLB C18 SPE柱（3 mL，60 mg，美国Waters公司）。
钴标准溶液1000 mg/L（美国Spex公司）；维生素B12（氰钴胺，美国SigmaAldrich公司）；NaH2PO4， Na2HPO4， HCl和NaOH均为分析纯，乙腈、甲醇均为色谱纯；功能饮料、多维片、5个奶粉样品采集于商场的品牌奶粉（编号1～5），所采集样品已注明添加的维生素B12为氰钴胺。
2.2SEC色谱条件以及ICPMS条件
2.2.1SEC色谱条件ICPMS在无加氧装置的情况下不耐受有机流动相，因此本实验流动相为无机磷酸缓冲盐，但高浓度的磷酸缓冲盐会使采样锥和截取锥口处沉积盐分，选择低浓度磷酸盐有利于保护仪器，最终实验采用10 mmol/L磷酸盐溶液作为流动相，流速为0.7 mL/min。
通常，高容量的定量环有利于提高灵敏度，但实验在洗脱SPE柱时采用了有机溶剂，而进样液中大量有机溶剂会使ICPMS熄火，考察20， 50 ，100和200 μL的定量环后， 确定50 μL试液不会使ICPMS熄灭，实验采用50 μL定量环。
2.2.2ICPMS条件选择Co59作为定量同位素，经调谐仪器主要参数如表1所示。
摘要 建立了固相微萃取（SPE）柱净化，尺寸排阻色谱电感耦合等离子体质谱（SECICPMS）联用测定功能饮料、多维片和婴儿奶粉中维生素B12含量的方法，方法检出限为 0.4 μg/L，维生素B12在1.0～150 μg/L范围内线性良好，回归系数R>0.999。实验表明，乙腈作为维生素B12标准品溶剂可改善维生素B12的色谱行为，用乙腈作为SPE柱洗脱液比甲醇效果好。在婴儿奶粉的前处理过程中，三氯甲烷作为蛋白沉淀剂得到的维生素B12回收率较高。功能饮料、多维片和3种婴儿奶粉的检测结果与商品标示值接近，相对标准偏差RSD均小于 5%（n=6），功能饮料、多维片的平均加标回收率为97%和90%，5种奶粉的平均加标回收率范围为88%～92%，表明本方法能够满足日常分析的要求。
关键词 尺寸排阻色谱，电感耦合等离子体质谱，维生素B12，婴儿奶粉
1引言
维生素B12是一族含钴的维生素，又称钴胺素，根据取代基的不同可分为氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺，高等动物无法自身合成钴胺素，只能从食物中摄取，钴胺素在红细胞生成、神经系统发育及某些蛋白质的合成的过程中产生重要作用。钴胺素中甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺均不稳定，添加于保健品和婴儿奶粉中的钴胺素为人工合成的氰钴胺[1～3]，氰钴胺是以钴为中心的配合物，其分子量为1355.4，含钴量为4.3%。中国国家标准规定婴儿奶粉中必须添加维生素B12， 其含量范围经换算后为10～72 ng/g， 市售婴儿奶粉维生素B12添加量集中在10～20 ng/g[4]。
目前，保健品中维生素B12测定国标方法为液相色谱法（HPLC）[5]，但HPLC方法因灵敏度较低，只适用于维生素B12含量较高的保健品的测定，无法实际测得含量在 ng/g级婴儿奶粉中的维生素B12[6～8]，因此中国国家标准方法采用复杂且耗时的微生物法[9]测定。近年来，一些色谱质谱联用技术（LCMS）尝试测定传统方法较难检测的维生素B12[10]。Luo等[11]等利用酶消解的方法消除了保健品和奶粉中蛋白质，再用LCMS测得了维生素B12的含量，色谱保留时间约为9 min， 方法检出限为2 ng/g，但基质干扰较为严重。Raju等[12]采用溶解离心取清液的方式提取早餐谷物和多维片中的维生素B12， 再由基于C18柱的HPLCICPMS联用测定，保留时间为9 min，方法检出限小于1 ng/g。Yang等[13]采用微波辅助萃取的方式提取保健品中的维生素B12，再由基于C18柱的HPLCICPMS定量测定，保留时间为9 min。Baker等[14]采用CEICPMS联用的方法研究了各种钴胺素的色谱行为。Guggisberg等[15]用免疫亲和柱富集HPLC检测的方法测定了肉类食品中维生素B12的含量，富集后的检出限为2 ng/g。
近年来，色谱电感耦合等离子质谱联用技术在食品、生物材料、环境等领域有有广泛的应用[16～20]，它结合了色谱的高效分离优势和电感耦合等离子体质谱的高灵敏度和低干扰的优点，除了用于形态分析， 还可用于传统方法难测得的痕量组分的测定。本实验采用固相微萃取柱富集SECICPMS联用测定功能饮料、多维片和婴儿奶粉中的人为添加的维生素B12。与传统国标法相比， 本方法取样量小、试剂人工消耗少、周期短，尤其对奶粉的测定具有独特优势，与基于C18柱的HPLCICPMS联用的方法相比，本方法不需要会影响雾化效率的高浓度甲醇作为流动相，灵敏度高，峰型尖锐， 分析时间短，分析了文献未尝试较难测定的奶粉样品[11，12]。随着色谱电感耦合等离子体质谱联用技术的普及，基于SECHPLCMS测定维生素B12的方法会得到广泛的应用。
2实验部分
2.1仪器与试剂
LC20AB液相色谱仪（日本岛津公司），BioSeps2000尺寸排阻色谱柱可分离0.87～300 kDa的物质（美国菲罗门公司）；X7电感耦合等离子体质谱仪及其工作站（美国Thermal）；色谱与ICPMS用Peek管相连，电子触发采集数据；绘图软件OriginPro 7.0；MilliQ Gradient超纯水净化器（美国Millipore）；318型离心机（美国Sigma公司）；0.22 μm有机滤膜（中国楚定科技公司）；OASIS HLB C18 SPE柱（3 mL，60 mg，美国Waters公司）。
钴标准溶液1000 mg/L（美国Spex公司）；维生素B12（氰钴胺，美国SigmaAldrich公司）；NaH2PO4， Na2HPO4， HCl和NaOH均为分析纯，乙腈、甲醇均为色谱纯；功能饮料、多维片、5个奶粉样品采集于商场的品牌奶粉（编号1～5），所采集样品已注明添加的维生素B12为氰钴胺。
2.2SEC色谱条件以及ICPMS条件
2.2.1SEC色谱条件ICPMS在无加氧装置的情况下不耐受有机流动相，因此本实验流动相为无机磷酸缓冲盐，但高浓度的磷酸缓冲盐会使采样锥和截取锥口处沉积盐分，选择低浓度磷酸盐有利于保护仪器，最终实验采用10 mmol/L磷酸盐溶液作为流动相，流速为0.7 mL/min。
通常，高容量的定量环有利于提高灵敏度，但实验在洗脱SPE柱时采用了有机溶剂，而进样液中大量有机溶剂会使ICPMS熄火，考察20， 50 ，100和200 μL的定量环后， 确定50 μL试液不会使ICPMS熄灭，实验采用50 μL定量环。
2.2.2ICPMS条件选择Co59作为定量同位素，经调谐仪器主要参数如表1所示。
