表面等离子体共振生物传感器的构建及对柠檬黄的检测
徐坤等
摘要：建立了傅里叶表面等离子体共振传感器（FTsurface plasmon resonance，FTSPR）检测食品色素柠檬黄的方法。利用柠檬黄与柠檬黄小鼠单克隆抗体特异性结合的原理，将碳酰二亚胺盐酸盐法制备出的柠檬黄牛血清白蛋白偶联物成功结合到传感器芯片上，通过溶液竞争法检测柠檬黄。建立了标准曲线，获得检出限13 μg/L；研究了pH值对检测的影响，得到pH 7.4为适宜的体系酸度；回收实验、实际样品检测及干扰实验的结果表明， 本方法对柠檬黄有高选择性。与紫外检测方法相比较，FTSPR传感器检测柠檬黄方法表现出了选择性高和检出限低等优势。
关键词：表面等离子体共振传感器； 柠檬黄； 小鼠单克隆抗体； 饮料
1引言
食品色素广泛用于日常食品中。 合成色素由于颜色更加鲜艳，不易褪色，且价格较低而应用更广泛。但是， 合成色素中多含有RNNR键、苯环或氧杂蒽结构的化合物，使其安全性降低，使用受到限制。近几年由色素引发的食品安全事件都说明迫切需要建立灵敏的检测方法和手段。
柠檬黄是水溶性偶氮类合成色素，是被准许使用的最广泛的色素之一[1]，但是因其安全性， 使用量也受到了诸多限制。2007年英国南安普敦大学发表了一份关于食用人工色素对儿童发育影响的研究结果，发现包括酒石黄和日落黄在内的7种人工色素可能会使儿童智商下降5分。随后， 科学家们又对柠檬黄的危害进行进一步的研究，Kamel[2]和Soltan[3]分别对雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食柠檬黄， 发现柠檬黄与多动症、焦虑、沮丧等行为有直接因果关系，并使小鼠的肝脏和肾脏组织发生改变。 高浓度柠檬黄能使雄性小鼠精子畸形率增加，有一定的致突变性[4]。针对柠檬黄过量使用的危害，已经建立的检测方法有紫外可见光分光光度法[5，6]、荧光光谱法[7]、酶免疫联法[8]、高效液相色谱法[9]、电化学法[10]等。这些方法虽得到了很好的应用效果，但存在着操作繁琐、耗时长、用量大、灵敏度较低、特异性差等诸多缺点。表面等离子体共振传感器（SPR）作为一种选择性好，灵敏度高，免标记，能够实现实时、快速、在线检测等优点[11]，在食品安全方面得到了广泛的应用。Fernndez等[12]利用多通道SPR传感器在线监测了牛奶中的恩诺沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR传感器检测了食物中的霉菌毒素，同时利用金纳米扩大信号。本实验采用SPR生物传感器， 利用抗原抗体相互作用的原理[14]检测了实际样品中的柠檬黄，并与紫外检测的结果进行对比。 结果表明， SPR检测对柠檬黄有较高的选择性，并且检出限（ng级）较低。
2实验部分
2.1仪器与试剂
UV2450紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；FTSPR表面等离子体共振仪（美国Thermo公司）； RE52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；TGL20M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；KQ200KD型高功率数控超声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司），透析袋（27 mm，USA）。
柠檬黄（Tartrazine，TE，95%），牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，AR），巯基丙酸（Thiohydracrylic acid， MPA， AR），碳酰二亚胺盐酸盐（1Ethyl（3dimethyl aminopropyl）carbodiimide，EDC，98%），N羟基琥珀酰亚胺（NHydroxysuccinimide，NHS，AR），日落黄（>87%），胭脂红（AR），苏丹红I（AR），以上试剂均为上海晶纯试剂有限公司生产；小鼠柠檬黄单克隆抗体（北京瀚海生物试剂有限公司）， N，N二甲基甲酰胺（AR，天津市凯力达化工有限公司），盐酸乙醇胺（AR，东京化成工业株式会社），磷酸盐缓冲溶液（PBS），橙色饮料1和2购于市场。实验用水为双蒸水。
2.2实验方法
2.2.1柠檬黄的紫外光谱检测称取柠檬黄0.05 g，用PBS（0.02 mol/L）配成0.5 g/mL溶液，实验中进一步稀释。以PBS为参比，1 cm比色皿，在200～600 nm测定吸收光谱。配制一系列浓度梯度在λmax处测吸光度值，建立吸光度浓度的标准曲线。取适量橙色饮料1，在0 ℃， 12000 r/min离心30 min， 取上清液稀释5倍备用。
2.2.2制备柠檬黄半抗原采用紫外可见分光光度法检测， 平行测定3次。根据文献[15]， 利用EDC法将柠檬黄与牛血清白蛋白进行偶联。因柠檬黄分子中含有羧基，可通过中间物N羟琥珀酰亚胺（NHS）与蛋白质的氨基结合，形成蛋白质与小分子的偶联物。得到的偶联物用透析袋纯化至透析液为无色。将得到的TEBSA产物用紫外可见光分光光度法表征。
2.2.3SPR传感器检测柠檬黄 （1） 检测方法采用溶液竞争法检测柠檬黄：将分析物与对应的抗体混合，并流过固定分析物的传感器表面。保证抗体的量固定不变，这样响应信号与分析物浓度成正比。因为抗体会带着结合上的分析物再次结合到固定在传感器表面的分析物上，因此响应信号会放大。当平衡量的分析物和抗体混合时，只有未与分析物结合的抗体才会与传感器表面的分析物结合，因此响应信号与分析物浓度成反比关系。首先将MPA键合到芯片上，再用EDC/NHS活化羧基，然后将TEBSA偶联物键合到芯片上，利用溶液竞争法检测柠檬黄。（2） SPR传感器制备及再生在室温下将金片放入新配洗液（30% H2O2浓H2SO4，3∶7， V/V）中清洗2～3 min，取出用大量水冲洗，再用氮气吹干。将干净的芯片放入10 mmol/L MPA溶液中，在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反复冲洗，再将芯片放入EDC（0.2 mol/L）/NHS（0.05 mol/L）中活化1 h。取出用大量水冲洗，再将芯片转入TEBSA溶液（0.1 g/L，pH=7.4）中浸泡12 h，取出用水冲洗后，用氮气吹干备用。在室温下，将芯片放入预先配置好的洗液中浸泡10 min中，将芯片表面的结合物清除，浸泡过程中需要振荡3～5次。取出后用水冲洗，氮气吹干备用。
2.2.4FTSPR传感器检测柠檬黄将处理过的芯片安装入仪器，设定参数，PBS缓冲溶液作为流动缓冲液（所有实验用试液经0.45 μm孔径膜过滤和超声脱气处理），流速固定为1.20 mL/min，采集背景。背景采集完毕后，固定流速为0.2 mL/min，得到稳定的FTSPR基线。再通过流动泵将系列处理过的柠檬黄溶液引入流动池中，与固定在芯片上的TEBSA偶联物的传感器表面接触，自由抗体就会与芯片上的偶联物结合，FTSPR实时记录的波数变化达到稳定时，再通入PBS至信号稳定。
2.2.5样品准备及检测用PBS配制系列梯度浓度的柠檬黄溶液，根据所配样品的最大浓度选择所需要的抗体量（一般按抗体与柠檬黄1∶1混合），保证抗体相对于待测物是过量的。不同浓度柠檬黄溶液中加入相同量的抗体，经孵育处理后，通入FTSPR传感器。
分别取50 mL橙色饮料1和2， 用旋蒸器将水分全部蒸干，用PBS定容至100 mL，备用。稀释至适宜倍数，进行检测，分别平行测定3次。取适量500 μg/L柠檬黄溶液，用橙色饮料1稀释后，经孵育处理，通入FTSPR传感器检测，平行测定3次。
3结果与讨论
3.1紫外光谱检测柠檬黄结果分析
由图1可见，柠檬黄在426和257 nm处有吸收峰，在200 nm处有半吸收峰，426 nm为主吸收峰。 通过线性拟合得线性方程为A=59.3286c （g/L）+0.0421， R2=0.9934。可以作为样品中柠檬黄检测的依据。基于信噪比为3，得出方法的检出限为0.17 mg/L。
利用标准曲线可得橙色饮料1中柠檬黄含量为21.7 mg/L， 换算后为0.02 g/kg，低于食品添加剂使用卫生标准（GB27602007）[16]规定柠檬黄在饮料中最大使用量0.1 g/kg。
摘要：建立了傅里叶表面等离子体共振传感器（FTsurface plasmon resonance，FTSPR）检测食品色素柠檬黄的方法。利用柠檬黄与柠檬黄小鼠单克隆抗体特异性结合的原理，将碳酰二亚胺盐酸盐法制备出的柠檬黄牛血清白蛋白偶联物成功结合到传感器芯片上，通过溶液竞争法检测柠檬黄。建立了标准曲线，获得检出限13 μg/L；研究了pH值对检测的影响，得到pH 7.4为适宜的体系酸度；回收实验、实际样品检测及干扰实验的结果表明， 本方法对柠檬黄有高选择性。与紫外检测方法相比较，FTSPR传感器检测柠檬黄方法表现出了选择性高和检出限低等优势。
关键词：表面等离子体共振传感器； 柠檬黄； 小鼠单克隆抗体； 饮料
1引言
食品色素广泛用于日常食品中。 合成色素由于颜色更加鲜艳，不易褪色，且价格较低而应用更广泛。但是， 合成色素中多含有RNNR键、苯环或氧杂蒽结构的化合物，使其安全性降低，使用受到限制。近几年由色素引发的食品安全事件都说明迫切需要建立灵敏的检测方法和手段。
柠檬黄是水溶性偶氮类合成色素，是被准许使用的最广泛的色素之一[1]，但是因其安全性， 使用量也受到了诸多限制。2007年英国南安普敦大学发表了一份关于食用人工色素对儿童发育影响的研究结果，发现包括酒石黄和日落黄在内的7种人工色素可能会使儿童智商下降5分。随后， 科学家们又对柠檬黄的危害进行进一步的研究，Kamel[2]和Soltan[3]分别对雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食柠檬黄， 发现柠檬黄与多动症、焦虑、沮丧等行为有直接因果关系，并使小鼠的肝脏和肾脏组织发生改变。 高浓度柠檬黄能使雄性小鼠精子畸形率增加，有一定的致突变性[4]。针对柠檬黄过量使用的危害，已经建立的检测方法有紫外可见光分光光度法[5，6]、荧光光谱法[7]、酶免疫联法[8]、高效液相色谱法[9]、电化学法[10]等。这些方法虽得到了很好的应用效果，但存在着操作繁琐、耗时长、用量大、灵敏度较低、特异性差等诸多缺点。表面等离子体共振传感器（SPR）作为一种选择性好，灵敏度高，免标记，能够实现实时、快速、在线检测等优点[11]，在食品安全方面得到了广泛的应用。Fernndez等[12]利用多通道SPR传感器在线监测了牛奶中的恩诺沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR传感器检测了食物中的霉菌毒素，同时利用金纳米扩大信号。本实验采用SPR生物传感器， 利用抗原抗体相互作用的原理[14]检测了实际样品中的柠檬黄，并与紫外检测的结果进行对比。 结果表明， SPR检测对柠檬黄有较高的选择性，并且检出限（ng级）较低。
2实验部分
2.1仪器与试剂
UV2450紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；FTSPR表面等离子体共振仪（美国Thermo公司）； RE52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；TGL20M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；KQ200KD型高功率数控超声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司），透析袋（27 mm，USA）。
柠檬黄（Tartrazine，TE，95%），牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，AR），巯基丙酸（Thiohydracrylic acid， MPA， AR），碳酰二亚胺盐酸盐（1Ethyl（3dimethyl aminopropyl）carbodiimide，EDC，98%），N羟基琥珀酰亚胺（NHydroxysuccinimide，NHS，AR），日落黄（>87%），胭脂红（AR），苏丹红I（AR），以上试剂均为上海晶纯试剂有限公司生产；小鼠柠檬黄单克隆抗体（北京瀚海生物试剂有限公司）， N，N二甲基甲酰胺（AR，天津市凯力达化工有限公司），盐酸乙醇胺（AR，东京化成工业株式会社），磷酸盐缓冲溶液（PBS），橙色饮料1和2购于市场。实验用水为双蒸水。
2.2实验方法
2.2.1柠檬黄的紫外光谱检测称取柠檬黄0.05 g，用PBS（0.02 mol/L）配成0.5 g/mL溶液，实验中进一步稀释。以PBS为参比，1 cm比色皿，在200～600 nm测定吸收光谱。配制一系列浓度梯度在λmax处测吸光度值，建立吸光度浓度的标准曲线。取适量橙色饮料1，在0 ℃， 12000 r/min离心30 min， 取上清液稀释5倍备用。
2.2.2制备柠檬黄半抗原采用紫外可见分光光度法检测， 平行测定3次。根据文献[15]， 利用EDC法将柠檬黄与牛血清白蛋白进行偶联。因柠檬黄分子中含有羧基，可通过中间物N羟琥珀酰亚胺（NHS）与蛋白质的氨基结合，形成蛋白质与小分子的偶联物。得到的偶联物用透析袋纯化至透析液为无色。将得到的TEBSA产物用紫外可见光分光光度法表征。
2.2.3SPR传感器检测柠檬黄 （1） 检测方法采用溶液竞争法检测柠檬黄：将分析物与对应的抗体混合，并流过固定分析物的传感器表面。保证抗体的量固定不变，这样响应信号与分析物浓度成正比。因为抗体会带着结合上的分析物再次结合到固定在传感器表面的分析物上，因此响应信号会放大。当平衡量的分析物和抗体混合时，只有未与分析物结合的抗体才会与传感器表面的分析物结合，因此响应信号与分析物浓度成反比关系。首先将MPA键合到芯片上，再用EDC/NHS活化羧基，然后将TEBSA偶联物键合到芯片上，利用溶液竞争法检测柠檬黄。（2） SPR传感器制备及再生在室温下将金片放入新配洗液（30% H2O2浓H2SO4，3∶7， V/V）中清洗2～3 min，取出用大量水冲洗，再用氮气吹干。将干净的芯片放入10 mmol/L MPA溶液中，在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反复冲洗，再将芯片放入EDC（0.2 mol/L）/NHS（0.05 mol/L）中活化1 h。取出用大量水冲洗，再将芯片转入TEBSA溶液（0.1 g/L，pH=7.4）中浸泡12 h，取出用水冲洗后，用氮气吹干备用。在室温下，将芯片放入预先配置好的洗液中浸泡10 min中，将芯片表面的结合物清除，浸泡过程中需要振荡3～5次。取出后用水冲洗，氮气吹干备用。
2.2.4FTSPR传感器检测柠檬黄将处理过的芯片安装入仪器，设定参数，PBS缓冲溶液作为流动缓冲液（所有实验用试液经0.45 μm孔径膜过滤和超声脱气处理），流速固定为1.20 mL/min，采集背景。背景采集完毕后，固定流速为0.2 mL/min，得到稳定的FTSPR基线。再通过流动泵将系列处理过的柠檬黄溶液引入流动池中，与固定在芯片上的TEBSA偶联物的传感器表面接触，自由抗体就会与芯片上的偶联物结合，FTSPR实时记录的波数变化达到稳定时，再通入PBS至信号稳定。
2.2.5样品准备及检测用PBS配制系列梯度浓度的柠檬黄溶液，根据所配样品的最大浓度选择所需要的抗体量（一般按抗体与柠檬黄1∶1混合），保证抗体相对于待测物是过量的。不同浓度柠檬黄溶液中加入相同量的抗体，经孵育处理后，通入FTSPR传感器。
分别取50 mL橙色饮料1和2， 用旋蒸器将水分全部蒸干，用PBS定容至100 mL，备用。稀释至适宜倍数，进行检测，分别平行测定3次。取适量500 μg/L柠檬黄溶液，用橙色饮料1稀释后，经孵育处理，通入FTSPR传感器检测，平行测定3次。
3结果与讨论
3.1紫外光谱检测柠檬黄结果分析
由图1可见，柠檬黄在426和257 nm处有吸收峰，在200 nm处有半吸收峰，426 nm为主吸收峰。 通过线性拟合得线性方程为A=59.3286c （g/L）+0.0421， R2=0.9934。可以作为样品中柠檬黄检测的依据。基于信噪比为3，得出方法的检出限为0.17 mg/L。
利用标准曲线可得橙色饮料1中柠檬黄含量为21.7 mg/L， 换算后为0.02 g/kg，低于食品添加剂使用卫生标准（GB27602007）[16]规定柠檬黄在饮料中最大使用量0.1 g/kg。
摘要：建立了傅里叶表面等离子体共振传感器（FTsurface plasmon resonance，FTSPR）检测食品色素柠檬黄的方法。利用柠檬黄与柠檬黄小鼠单克隆抗体特异性结合的原理，将碳酰二亚胺盐酸盐法制备出的柠檬黄牛血清白蛋白偶联物成功结合到传感器芯片上，通过溶液竞争法检测柠檬黄。建立了标准曲线，获得检出限13 μg/L；研究了pH值对检测的影响，得到pH 7.4为适宜的体系酸度；回收实验、实际样品检测及干扰实验的结果表明， 本方法对柠檬黄有高选择性。与紫外检测方法相比较，FTSPR传感器检测柠檬黄方法表现出了选择性高和检出限低等优势。
关键词：表面等离子体共振传感器； 柠檬黄； 小鼠单克隆抗体； 饮料
1引言
食品色素广泛用于日常食品中。 合成色素由于颜色更加鲜艳，不易褪色，且价格较低而应用更广泛。但是， 合成色素中多含有RNNR键、苯环或氧杂蒽结构的化合物，使其安全性降低，使用受到限制。近几年由色素引发的食品安全事件都说明迫切需要建立灵敏的检测方法和手段。
柠檬黄是水溶性偶氮类合成色素，是被准许使用的最广泛的色素之一[1]，但是因其安全性， 使用量也受到了诸多限制。2007年英国南安普敦大学发表了一份关于食用人工色素对儿童发育影响的研究结果，发现包括酒石黄和日落黄在内的7种人工色素可能会使儿童智商下降5分。随后， 科学家们又对柠檬黄的危害进行进一步的研究，Kamel[2]和Soltan[3]分别对雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食柠檬黄， 发现柠檬黄与多动症、焦虑、沮丧等行为有直接因果关系，并使小鼠的肝脏和肾脏组织发生改变。 高浓度柠檬黄能使雄性小鼠精子畸形率增加，有一定的致突变性[4]。针对柠檬黄过量使用的危害，已经建立的检测方法有紫外可见光分光光度法[5，6]、荧光光谱法[7]、酶免疫联法[8]、高效液相色谱法[9]、电化学法[10]等。这些方法虽得到了很好的应用效果，但存在着操作繁琐、耗时长、用量大、灵敏度较低、特异性差等诸多缺点。表面等离子体共振传感器（SPR）作为一种选择性好，灵敏度高，免标记，能够实现实时、快速、在线检测等优点[11]，在食品安全方面得到了广泛的应用。Fernndez等[12]利用多通道SPR传感器在线监测了牛奶中的恩诺沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR传感器检测了食物中的霉菌毒素，同时利用金纳米扩大信号。本实验采用SPR生物传感器， 利用抗原抗体相互作用的原理[14]检测了实际样品中的柠檬黄，并与紫外检测的结果进行对比。 结果表明， SPR检测对柠檬黄有较高的选择性，并且检出限（ng级）较低。
2实验部分
2.1仪器与试剂
UV2450紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；FTSPR表面等离子体共振仪（美国Thermo公司）； RE52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；TGL20M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；KQ200KD型高功率数控超声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司），透析袋（27 mm，USA）。
柠檬黄（Tartrazine，TE，95%），牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，AR），巯基丙酸（Thiohydracrylic acid， MPA， AR），碳酰二亚胺盐酸盐（1Ethyl（3dimethyl aminopropyl）carbodiimide，EDC，98%），N羟基琥珀酰亚胺（NHydroxysuccinimide，NHS，AR），日落黄（>87%），胭脂红（AR），苏丹红I（AR），以上试剂均为上海晶纯试剂有限公司生产；小鼠柠檬黄单克隆抗体（北京瀚海生物试剂有限公司）， N，N二甲基甲酰胺（AR，天津市凯力达化工有限公司），盐酸乙醇胺（AR，东京化成工业株式会社），磷酸盐缓冲溶液（PBS），橙色饮料1和2购于市场。实验用水为双蒸水。
2.2实验方法
2.2.1柠檬黄的紫外光谱检测称取柠檬黄0.05 g，用PBS（0.02 mol/L）配成0.5 g/mL溶液，实验中进一步稀释。以PBS为参比，1 cm比色皿，在200～600 nm测定吸收光谱。配制一系列浓度梯度在λmax处测吸光度值，建立吸光度浓度的标准曲线。取适量橙色饮料1，在0 ℃， 12000 r/min离心30 min， 取上清液稀释5倍备用。
2.2.2制备柠檬黄半抗原采用紫外可见分光光度法检测， 平行测定3次。根据文献[15]， 利用EDC法将柠檬黄与牛血清白蛋白进行偶联。因柠檬黄分子中含有羧基，可通过中间物N羟琥珀酰亚胺（NHS）与蛋白质的氨基结合，形成蛋白质与小分子的偶联物。得到的偶联物用透析袋纯化至透析液为无色。将得到的TEBSA产物用紫外可见光分光光度法表征。
2.2.3SPR传感器检测柠檬黄 （1） 检测方法采用溶液竞争法检测柠檬黄：将分析物与对应的抗体混合，并流过固定分析物的传感器表面。保证抗体的量固定不变，这样响应信号与分析物浓度成正比。因为抗体会带着结合上的分析物再次结合到固定在传感器表面的分析物上，因此响应信号会放大。当平衡量的分析物和抗体混合时，只有未与分析物结合的抗体才会与传感器表面的分析物结合，因此响应信号与分析物浓度成反比关系。首先将MPA键合到芯片上，再用EDC/NHS活化羧基，然后将TEBSA偶联物键合到芯片上，利用溶液竞争法检测柠檬黄。（2） SPR传感器制备及再生在室温下将金片放入新配洗液（30% H2O2浓H2SO4，3∶7， V/V）中清洗2～3 min，取出用大量水冲洗，再用氮气吹干。将干净的芯片放入10 mmol/L MPA溶液中，在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反复冲洗，再将芯片放入EDC（0.2 mol/L）/NHS（0.05 mol/L）中活化1 h。取出用大量水冲洗，再将芯片转入TEBSA溶液（0.1 g/L，pH=7.4）中浸泡12 h，取出用水冲洗后，用氮气吹干备用。在室温下，将芯片放入预先配置好的洗液中浸泡10 min中，将芯片表面的结合物清除，浸泡过程中需要振荡3～5次。取出后用水冲洗，氮气吹干备用。
2.2.4FTSPR传感器检测柠檬黄将处理过的芯片安装入仪器，设定参数，PBS缓冲溶液作为流动缓冲液（所有实验用试液经0.45 μm孔径膜过滤和超声脱气处理），流速固定为1.20 mL/min，采集背景。背景采集完毕后，固定流速为0.2 mL/min，得到稳定的FTSPR基线。再通过流动泵将系列处理过的柠檬黄溶液引入流动池中，与固定在芯片上的TEBSA偶联物的传感器表面接触，自由抗体就会与芯片上的偶联物结合，FTSPR实时记录的波数变化达到稳定时，再通入PBS至信号稳定。
2.2.5样品准备及检测用PBS配制系列梯度浓度的柠檬黄溶液，根据所配样品的最大浓度选择所需要的抗体量（一般按抗体与柠檬黄1∶1混合），保证抗体相对于待测物是过量的。不同浓度柠檬黄溶液中加入相同量的抗体，经孵育处理后，通入FTSPR传感器。
分别取50 mL橙色饮料1和2， 用旋蒸器将水分全部蒸干，用PBS定容至100 mL，备用。稀释至适宜倍数，进行检测，分别平行测定3次。取适量500 μg/L柠檬黄溶液，用橙色饮料1稀释后，经孵育处理，通入FTSPR传感器检测，平行测定3次。
3结果与讨论
3.1紫外光谱检测柠檬黄结果分析
由图1可见，柠檬黄在426和257 nm处有吸收峰，在200 nm处有半吸收峰，426 nm为主吸收峰。 通过线性拟合得线性方程为A=59.3286c （g/L）+0.0421， R2=0.9934。可以作为样品中柠檬黄检测的依据。基于信噪比为3，得出方法的检出限为0.17 mg/L。
利用标准曲线可得橙色饮料1中柠檬黄含量为21.7 mg/L， 换算后为0.02 g/kg，低于食品添加剂使用卫生标准（GB27602007）[16]规定柠檬黄在饮料中最大使用量0.1 g/kg。
摘要：建立了傅里叶表面等离子体共振传感器（FTsurface plasmon resonance，FTSPR）检测食品色素柠檬黄的方法。利用柠檬黄与柠檬黄小鼠单克隆抗体特异性结合的原理，将碳酰二亚胺盐酸盐法制备出的柠檬黄牛血清白蛋白偶联物成功结合到传感器芯片上，通过溶液竞争法检测柠檬黄。建立了标准曲线，获得检出限13 μg/L；研究了pH值对检测的影响，得到pH 7.4为适宜的体系酸度；回收实验、实际样品检测及干扰实验的结果表明， 本方法对柠檬黄有高选择性。与紫外检测方法相比较，FTSPR传感器检测柠檬黄方法表现出了选择性高和检出限低等优势。
关键词：表面等离子体共振传感器； 柠檬黄； 小鼠单克隆抗体； 饮料
1引言
食品色素广泛用于日常食品中。 合成色素由于颜色更加鲜艳，不易褪色，且价格较低而应用更广泛。但是， 合成色素中多含有RNNR键、苯环或氧杂蒽结构的化合物，使其安全性降低，使用受到限制。近几年由色素引发的食品安全事件都说明迫切需要建立灵敏的检测方法和手段。
柠檬黄是水溶性偶氮类合成色素，是被准许使用的最广泛的色素之一[1]，但是因其安全性， 使用量也受到了诸多限制。2007年英国南安普敦大学发表了一份关于食用人工色素对儿童发育影响的研究结果，发现包括酒石黄和日落黄在内的7种人工色素可能会使儿童智商下降5分。随后， 科学家们又对柠檬黄的危害进行进一步的研究，Kamel[2]和Soltan[3]分别对雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食柠檬黄， 发现柠檬黄与多动症、焦虑、沮丧等行为有直接因果关系，并使小鼠的肝脏和肾脏组织发生改变。 高浓度柠檬黄能使雄性小鼠精子畸形率增加，有一定的致突变性[4]。针对柠檬黄过量使用的危害，已经建立的检测方法有紫外可见光分光光度法[5，6]、荧光光谱法[7]、酶免疫联法[8]、高效液相色谱法[9]、电化学法[10]等。这些方法虽得到了很好的应用效果，但存在着操作繁琐、耗时长、用量大、灵敏度较低、特异性差等诸多缺点。表面等离子体共振传感器（SPR）作为一种选择性好，灵敏度高，免标记，能够实现实时、快速、在线检测等优点[11]，在食品安全方面得到了广泛的应用。Fernndez等[12]利用多通道SPR传感器在线监测了牛奶中的恩诺沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR传感器检测了食物中的霉菌毒素，同时利用金纳米扩大信号。本实验采用SPR生物传感器， 利用抗原抗体相互作用的原理[14]检测了实际样品中的柠檬黄，并与紫外检测的结果进行对比。 结果表明， SPR检测对柠檬黄有较高的选择性，并且检出限（ng级）较低。
2实验部分
2.1仪器与试剂
UV2450紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；FTSPR表面等离子体共振仪（美国Thermo公司）； RE52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；TGL20M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；KQ200KD型高功率数控超声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司），透析袋（27 mm，USA）。
柠檬黄（Tartrazine，TE，95%），牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，AR），巯基丙酸（Thiohydracrylic acid， MPA， AR），碳酰二亚胺盐酸盐（1Ethyl（3dimethyl aminopropyl）carbodiimide，EDC，98%），N羟基琥珀酰亚胺（NHydroxysuccinimide，NHS，AR），日落黄（>87%），胭脂红（AR），苏丹红I（AR），以上试剂均为上海晶纯试剂有限公司生产；小鼠柠檬黄单克隆抗体（北京瀚海生物试剂有限公司）， N，N二甲基甲酰胺（AR，天津市凯力达化工有限公司），盐酸乙醇胺（AR，东京化成工业株式会社），磷酸盐缓冲溶液（PBS），橙色饮料1和2购于市场。实验用水为双蒸水。
2.2实验方法
2.2.1柠檬黄的紫外光谱检测称取柠檬黄0.05 g，用PBS（0.02 mol/L）配成0.5 g/mL溶液，实验中进一步稀释。以PBS为参比，1 cm比色皿，在200～600 nm测定吸收光谱。配制一系列浓度梯度在λmax处测吸光度值，建立吸光度浓度的标准曲线。取适量橙色饮料1，在0 ℃， 12000 r/min离心30 min， 取上清液稀释5倍备用。
2.2.2制备柠檬黄半抗原采用紫外可见分光光度法检测， 平行测定3次。根据文献[15]， 利用EDC法将柠檬黄与牛血清白蛋白进行偶联。因柠檬黄分子中含有羧基，可通过中间物N羟琥珀酰亚胺（NHS）与蛋白质的氨基结合，形成蛋白质与小分子的偶联物。得到的偶联物用透析袋纯化至透析液为无色。将得到的TEBSA产物用紫外可见光分光光度法表征。
2.2.3SPR传感器检测柠檬黄 （1） 检测方法采用溶液竞争法检测柠檬黄：将分析物与对应的抗体混合，并流过固定分析物的传感器表面。保证抗体的量固定不变，这样响应信号与分析物浓度成正比。因为抗体会带着结合上的分析物再次结合到固定在传感器表面的分析物上，因此响应信号会放大。当平衡量的分析物和抗体混合时，只有未与分析物结合的抗体才会与传感器表面的分析物结合，因此响应信号与分析物浓度成反比关系。首先将MPA键合到芯片上，再用EDC/NHS活化羧基，然后将TEBSA偶联物键合到芯片上，利用溶液竞争法检测柠檬黄。（2） SPR传感器制备及再生在室温下将金片放入新配洗液（30% H2O2浓H2SO4，3∶7， V/V）中清洗2～3 min，取出用大量水冲洗，再用氮气吹干。将干净的芯片放入10 mmol/L MPA溶液中，在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反复冲洗，再将芯片放入EDC（0.2 mol/L）/NHS（0.05 mol/L）中活化1 h。取出用大量水冲洗，再将芯片转入TEBSA溶液（0.1 g/L，pH=7.4）中浸泡12 h，取出用水冲洗后，用氮气吹干备用。在室温下，将芯片放入预先配置好的洗液中浸泡10 min中，将芯片表面的结合物清除，浸泡过程中需要振荡3～5次。取出后用水冲洗，氮气吹干备用。
2.2.4FTSPR传感器检测柠檬黄将处理过的芯片安装入仪器，设定参数，PBS缓冲溶液作为流动缓冲液（所有实验用试液经0.45 μm孔径膜过滤和超声脱气处理），流速固定为1.20 mL/min，采集背景。背景采集完毕后，固定流速为0.2 mL/min，得到稳定的FTSPR基线。再通过流动泵将系列处理过的柠檬黄溶液引入流动池中，与固定在芯片上的TEBSA偶联物的传感器表面接触，自由抗体就会与芯片上的偶联物结合，FTSPR实时记录的波数变化达到稳定时，再通入PBS至信号稳定。
2.2.5样品准备及检测用PBS配制系列梯度浓度的柠檬黄溶液，根据所配样品的最大浓度选择所需要的抗体量（一般按抗体与柠檬黄1∶1混合），保证抗体相对于待测物是过量的。不同浓度柠檬黄溶液中加入相同量的抗体，经孵育处理后，通入FTSPR传感器。
分别取50 mL橙色饮料1和2， 用旋蒸器将水分全部蒸干，用PBS定容至100 mL，备用。稀释至适宜倍数，进行检测，分别平行测定3次。取适量500 μg/L柠檬黄溶液，用橙色饮料1稀释后，经孵育处理，通入FTSPR传感器检测，平行测定3次。
3结果与讨论
3.1紫外光谱检测柠檬黄结果分析
由图1可见，柠檬黄在426和257 nm处有吸收峰，在200 nm处有半吸收峰，426 nm为主吸收峰。 通过线性拟合得线性方程为A=59.3286c （g/L）+0.0421， R2=0.9934。可以作为样品中柠檬黄检测的依据。基于信噪比为3，得出方法的检出限为0.17 mg/L。
利用标准曲线可得橙色饮料1中柠檬黄含量为21.7 mg/L， 换算后为0.02 g/kg，低于食品添加剂使用卫生标准（GB27602007）[16]规定柠檬黄在饮料中最大使用量0.1 g/kg。
摘要：建立了傅里叶表面等离子体共振传感器（FTsurface plasmon resonance，FTSPR）检测食品色素柠檬黄的方法。利用柠檬黄与柠檬黄小鼠单克隆抗体特异性结合的原理，将碳酰二亚胺盐酸盐法制备出的柠檬黄牛血清白蛋白偶联物成功结合到传感器芯片上，通过溶液竞争法检测柠檬黄。建立了标准曲线，获得检出限13 μg/L；研究了pH值对检测的影响，得到pH 7.4为适宜的体系酸度；回收实验、实际样品检测及干扰实验的结果表明， 本方法对柠檬黄有高选择性。与紫外检测方法相比较，FTSPR传感器检测柠檬黄方法表现出了选择性高和检出限低等优势。
关键词：表面等离子体共振传感器； 柠檬黄； 小鼠单克隆抗体； 饮料
1引言
食品色素广泛用于日常食品中。 合成色素由于颜色更加鲜艳，不易褪色，且价格较低而应用更广泛。但是， 合成色素中多含有RNNR键、苯环或氧杂蒽结构的化合物，使其安全性降低，使用受到限制。近几年由色素引发的食品安全事件都说明迫切需要建立灵敏的检测方法和手段。
柠檬黄是水溶性偶氮类合成色素，是被准许使用的最广泛的色素之一[1]，但是因其安全性， 使用量也受到了诸多限制。2007年英国南安普敦大学发表了一份关于食用人工色素对儿童发育影响的研究结果，发现包括酒石黄和日落黄在内的7种人工色素可能会使儿童智商下降5分。随后， 科学家们又对柠檬黄的危害进行进一步的研究，Kamel[2]和Soltan[3]分别对雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食柠檬黄， 发现柠檬黄与多动症、焦虑、沮丧等行为有直接因果关系，并使小鼠的肝脏和肾脏组织发生改变。 高浓度柠檬黄能使雄性小鼠精子畸形率增加，有一定的致突变性[4]。针对柠檬黄过量使用的危害，已经建立的检测方法有紫外可见光分光光度法[5，6]、荧光光谱法[7]、酶免疫联法[8]、高效液相色谱法[9]、电化学法[10]等。这些方法虽得到了很好的应用效果，但存在着操作繁琐、耗时长、用量大、灵敏度较低、特异性差等诸多缺点。表面等离子体共振传感器（SPR）作为一种选择性好，灵敏度高，免标记，能够实现实时、快速、在线检测等优点[11]，在食品安全方面得到了广泛的应用。Fernndez等[12]利用多通道SPR传感器在线监测了牛奶中的恩诺沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR传感器检测了食物中的霉菌毒素，同时利用金纳米扩大信号。本实验采用SPR生物传感器， 利用抗原抗体相互作用的原理[14]检测了实际样品中的柠檬黄，并与紫外检测的结果进行对比。 结果表明， SPR检测对柠檬黄有较高的选择性，并且检出限（ng级）较低。
2实验部分
2.1仪器与试剂
UV2450紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；FTSPR表面等离子体共振仪（美国Thermo公司）； RE52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；TGL20M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；KQ200KD型高功率数控超声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司），透析袋（27 mm，USA）。
柠檬黄（Tartrazine，TE，95%），牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，AR），巯基丙酸（Thiohydracrylic acid， MPA， AR），碳酰二亚胺盐酸盐（1Ethyl（3dimethyl aminopropyl）carbodiimide，EDC，98%），N羟基琥珀酰亚胺（NHydroxysuccinimide，NHS，AR），日落黄（>87%），胭脂红（AR），苏丹红I（AR），以上试剂均为上海晶纯试剂有限公司生产；小鼠柠檬黄单克隆抗体（北京瀚海生物试剂有限公司）， N，N二甲基甲酰胺（AR，天津市凯力达化工有限公司），盐酸乙醇胺（AR，东京化成工业株式会社），磷酸盐缓冲溶液（PBS），橙色饮料1和2购于市场。实验用水为双蒸水。
2.2实验方法
2.2.1柠檬黄的紫外光谱检测称取柠檬黄0.05 g，用PBS（0.02 mol/L）配成0.5 g/mL溶液，实验中进一步稀释。以PBS为参比，1 cm比色皿，在200～600 nm测定吸收光谱。配制一系列浓度梯度在λmax处测吸光度值，建立吸光度浓度的标准曲线。取适量橙色饮料1，在0 ℃， 12000 r/min离心30 min， 取上清液稀释5倍备用。
2.2.2制备柠檬黄半抗原采用紫外可见分光光度法检测， 平行测定3次。根据文献[15]， 利用EDC法将柠檬黄与牛血清白蛋白进行偶联。因柠檬黄分子中含有羧基，可通过中间物N羟琥珀酰亚胺（NHS）与蛋白质的氨基结合，形成蛋白质与小分子的偶联物。得到的偶联物用透析袋纯化至透析液为无色。将得到的TEBSA产物用紫外可见光分光光度法表征。
2.2.3SPR传感器检测柠檬黄 （1） 检测方法采用溶液竞争法检测柠檬黄：将分析物与对应的抗体混合，并流过固定分析物的传感器表面。保证抗体的量固定不变，这样响应信号与分析物浓度成正比。因为抗体会带着结合上的分析物再次结合到固定在传感器表面的分析物上，因此响应信号会放大。当平衡量的分析物和抗体混合时，只有未与分析物结合的抗体才会与传感器表面的分析物结合，因此响应信号与分析物浓度成反比关系。首先将MPA键合到芯片上，再用EDC/NHS活化羧基，然后将TEBSA偶联物键合到芯片上，利用溶液竞争法检测柠檬黄。（2） SPR传感器制备及再生在室温下将金片放入新配洗液（30% H2O2浓H2SO4，3∶7， V/V）中清洗2～3 min，取出用大量水冲洗，再用氮气吹干。将干净的芯片放入10 mmol/L MPA溶液中，在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反复冲洗，再将芯片放入EDC（0.2 mol/L）/NHS（0.05 mol/L）中活化1 h。取出用大量水冲洗，再将芯片转入TEBSA溶液（0.1 g/L，pH=7.4）中浸泡12 h，取出用水冲洗后，用氮气吹干备用。在室温下，将芯片放入预先配置好的洗液中浸泡10 min中，将芯片表面的结合物清除，浸泡过程中需要振荡3～5次。取出后用水冲洗，氮气吹干备用。
2.2.4FTSPR传感器检测柠檬黄将处理过的芯片安装入仪器，设定参数，PBS缓冲溶液作为流动缓冲液（所有实验用试液经0.45 μm孔径膜过滤和超声脱气处理），流速固定为1.20 mL/min，采集背景。背景采集完毕后，固定流速为0.2 mL/min，得到稳定的FTSPR基线。再通过流动泵将系列处理过的柠檬黄溶液引入流动池中，与固定在芯片上的TEBSA偶联物的传感器表面接触，自由抗体就会与芯片上的偶联物结合，FTSPR实时记录的波数变化达到稳定时，再通入PBS至信号稳定。
2.2.5样品准备及检测用PBS配制系列梯度浓度的柠檬黄溶液，根据所配样品的最大浓度选择所需要的抗体量（一般按抗体与柠檬黄1∶1混合），保证抗体相对于待测物是过量的。不同浓度柠檬黄溶液中加入相同量的抗体，经孵育处理后，通入FTSPR传感器。
分别取50 mL橙色饮料1和2， 用旋蒸器将水分全部蒸干，用PBS定容至100 mL，备用。稀释至适宜倍数，进行检测，分别平行测定3次。取适量500 μg/L柠檬黄溶液，用橙色饮料1稀释后，经孵育处理，通入FTSPR传感器检测，平行测定3次。
3结果与讨论
3.1紫外光谱检测柠檬黄结果分析
由图1可见，柠檬黄在426和257 nm处有吸收峰，在200 nm处有半吸收峰，426 nm为主吸收峰。 通过线性拟合得线性方程为A=59.3286c （g/L）+0.0421， R2=0.9934。可以作为样品中柠檬黄检测的依据。基于信噪比为3，得出方法的检出限为0.17 mg/L。
利用标准曲线可得橙色饮料1中柠檬黄含量为21.7 mg/L， 换算后为0.02 g/kg，低于食品添加剂使用卫生标准（GB27602007）[16]规定柠檬黄在饮料中最大使用量0.1 g/kg。
摘要：建立了傅里叶表面等离子体共振传感器（FTsurface plasmon resonance，FTSPR）检测食品色素柠檬黄的方法。利用柠檬黄与柠檬黄小鼠单克隆抗体特异性结合的原理，将碳酰二亚胺盐酸盐法制备出的柠檬黄牛血清白蛋白偶联物成功结合到传感器芯片上，通过溶液竞争法检测柠檬黄。建立了标准曲线，获得检出限13 μg/L；研究了pH值对检测的影响，得到pH 7.4为适宜的体系酸度；回收实验、实际样品检测及干扰实验的结果表明， 本方法对柠檬黄有高选择性。与紫外检测方法相比较，FTSPR传感器检测柠檬黄方法表现出了选择性高和检出限低等优势。
关键词：表面等离子体共振传感器； 柠檬黄； 小鼠单克隆抗体； 饮料
1引言
食品色素广泛用于日常食品中。 合成色素由于颜色更加鲜艳，不易褪色，且价格较低而应用更广泛。但是， 合成色素中多含有RNNR键、苯环或氧杂蒽结构的化合物，使其安全性降低，使用受到限制。近几年由色素引发的食品安全事件都说明迫切需要建立灵敏的检测方法和手段。
柠檬黄是水溶性偶氮类合成色素，是被准许使用的最广泛的色素之一[1]，但是因其安全性， 使用量也受到了诸多限制。2007年英国南安普敦大学发表了一份关于食用人工色素对儿童发育影响的研究结果，发现包括酒石黄和日落黄在内的7种人工色素可能会使儿童智商下降5分。随后， 科学家们又对柠檬黄的危害进行进一步的研究，Kamel[2]和Soltan[3]分别对雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食柠檬黄， 发现柠檬黄与多动症、焦虑、沮丧等行为有直接因果关系，并使小鼠的肝脏和肾脏组织发生改变。 高浓度柠檬黄能使雄性小鼠精子畸形率增加，有一定的致突变性[4]。针对柠檬黄过量使用的危害，已经建立的检测方法有紫外可见光分光光度法[5，6]、荧光光谱法[7]、酶免疫联法[8]、高效液相色谱法[9]、电化学法[10]等。这些方法虽得到了很好的应用效果，但存在着操作繁琐、耗时长、用量大、灵敏度较低、特异性差等诸多缺点。表面等离子体共振传感器（SPR）作为一种选择性好，灵敏度高，免标记，能够实现实时、快速、在线检测等优点[11]，在食品安全方面得到了广泛的应用。Fernndez等[12]利用多通道SPR传感器在线监测了牛奶中的恩诺沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR传感器检测了食物中的霉菌毒素，同时利用金纳米扩大信号。本实验采用SPR生物传感器， 利用抗原抗体相互作用的原理[14]检测了实际样品中的柠檬黄，并与紫外检测的结果进行对比。 结果表明， SPR检测对柠檬黄有较高的选择性，并且检出限（ng级）较低。
2实验部分
2.1仪器与试剂
UV2450紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；FTSPR表面等离子体共振仪（美国Thermo公司）； RE52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；TGL20M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；KQ200KD型高功率数控超声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司），透析袋（27 mm，USA）。
柠檬黄（Tartrazine，TE，95%），牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，AR），巯基丙酸（Thiohydracrylic acid， MPA， AR），碳酰二亚胺盐酸盐（1Ethyl（3dimethyl aminopropyl）carbodiimide，EDC，98%），N羟基琥珀酰亚胺（NHydroxysuccinimide，NHS，AR），日落黄（>87%），胭脂红（AR），苏丹红I（AR），以上试剂均为上海晶纯试剂有限公司生产；小鼠柠檬黄单克隆抗体（北京瀚海生物试剂有限公司）， N，N二甲基甲酰胺（AR，天津市凯力达化工有限公司），盐酸乙醇胺（AR，东京化成工业株式会社），磷酸盐缓冲溶液（PBS），橙色饮料1和2购于市场。实验用水为双蒸水。
2.2实验方法
2.2.1柠檬黄的紫外光谱检测称取柠檬黄0.05 g，用PBS（0.02 mol/L）配成0.5 g/mL溶液，实验中进一步稀释。以PBS为参比，1 cm比色皿，在200～600 nm测定吸收光谱。配制一系列浓度梯度在λmax处测吸光度值，建立吸光度浓度的标准曲线。取适量橙色饮料1，在0 ℃， 12000 r/min离心30 min， 取上清液稀释5倍备用。
2.2.2制备柠檬黄半抗原采用紫外可见分光光度法检测， 平行测定3次。根据文献[15]， 利用EDC法将柠檬黄与牛血清白蛋白进行偶联。因柠檬黄分子中含有羧基，可通过中间物N羟琥珀酰亚胺（NHS）与蛋白质的氨基结合，形成蛋白质与小分子的偶联物。得到的偶联物用透析袋纯化至透析液为无色。将得到的TEBSA产物用紫外可见光分光光度法表征。
2.2.3SPR传感器检测柠檬黄 （1） 检测方法采用溶液竞争法检测柠檬黄：将分析物与对应的抗体混合，并流过固定分析物的传感器表面。保证抗体的量固定不变，这样响应信号与分析物浓度成正比。因为抗体会带着结合上的分析物再次结合到固定在传感器表面的分析物上，因此响应信号会放大。当平衡量的分析物和抗体混合时，只有未与分析物结合的抗体才会与传感器表面的分析物结合，因此响应信号与分析物浓度成反比关系。首先将MPA键合到芯片上，再用EDC/NHS活化羧基，然后将TEBSA偶联物键合到芯片上，利用溶液竞争法检测柠檬黄。（2） SPR传感器制备及再生在室温下将金片放入新配洗液（30% H2O2浓H2SO4，3∶7， V/V）中清洗2～3 min，取出用大量水冲洗，再用氮气吹干。将干净的芯片放入10 mmol/L MPA溶液中，在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反复冲洗，再将芯片放入EDC（0.2 mol/L）/NHS（0.05 mol/L）中活化1 h。取出用大量水冲洗，再将芯片转入TEBSA溶液（0.1 g/L，pH=7.4）中浸泡12 h，取出用水冲洗后，用氮气吹干备用。在室温下，将芯片放入预先配置好的洗液中浸泡10 min中，将芯片表面的结合物清除，浸泡过程中需要振荡3～5次。取出后用水冲洗，氮气吹干备用。
2.2.4FTSPR传感器检测柠檬黄将处理过的芯片安装入仪器，设定参数，PBS缓冲溶液作为流动缓冲液（所有实验用试液经0.45 μm孔径膜过滤和超声脱气处理），流速固定为1.20 mL/min，采集背景。背景采集完毕后，固定流速为0.2 mL/min，得到稳定的FTSPR基线。再通过流动泵将系列处理过的柠檬黄溶液引入流动池中，与固定在芯片上的TEBSA偶联物的传感器表面接触，自由抗体就会与芯片上的偶联物结合，FTSPR实时记录的波数变化达到稳定时，再通入PBS至信号稳定。
2.2.5样品准备及检测用PBS配制系列梯度浓度的柠檬黄溶液，根据所配样品的最大浓度选择所需要的抗体量（一般按抗体与柠檬黄1∶1混合），保证抗体相对于待测物是过量的。不同浓度柠檬黄溶液中加入相同量的抗体，经孵育处理后，通入FTSPR传感器。
分别取50 mL橙色饮料1和2， 用旋蒸器将水分全部蒸干，用PBS定容至100 mL，备用。稀释至适宜倍数，进行检测，分别平行测定3次。取适量500 μg/L柠檬黄溶液，用橙色饮料1稀释后，经孵育处理，通入FTSPR传感器检测，平行测定3次。
3结果与讨论
3.1紫外光谱检测柠檬黄结果分析
由图1可见，柠檬黄在426和257 nm处有吸收峰，在200 nm处有半吸收峰，426 nm为主吸收峰。 通过线性拟合得线性方程为A=59.3286c （g/L）+0.0421， R2=0.9934。可以作为样品中柠檬黄检测的依据。基于信噪比为3，得出方法的检出限为0.17 mg/L。
利用标准曲线可得橙色饮料1中柠檬黄含量为21.7 mg/L， 换算后为0.02 g/kg，低于食品添加剂使用卫生标准（GB27602007）[16]规定柠檬黄在饮料中最大使用量0.1 g/kg。
