微紫青霉果胶酶降解再造烟叶高浓混合浆中果胶的研究
许春平 曲利利 姜宇 马宇平 孙斯文 王宣静
摘要：为降低再造烟叶中的果胶含量，采用单因素试验和正交试验对微紫青霉产果胶酶降解果胶的工艺条件进行优化，分析了酶解前后样品的热裂解产物，并将酶解后样品抄造制丝添加至卷烟中进行感官评价，结果表明：微紫青霉产果胶酶降解果胶的最佳反应条件为酶活力3000 U/mL，高浓混合浆干重与粗酶液体积的料液比1GA6FA1，反应温度50 ℃，处理时间3 h.在此条件下果胶降解率达到最大，为28.63%，相对分子量由341 kDa减小到55 kDa.酶解后样品裂解产物的组成和含量发生明显变化，除醇类物质外，其他香味物质酚类、醛酮类、酯类、杂环类减少.将酶解后的样品抄造制丝添加于卷烟中，香气质丰满细腻，透发性、甜润感增强，刺激性减小，余味纯净舒适，吸食品质得以改善，但劲头略有不足.
关键词：微紫青霉;果胶酶;再造烟叶;果胶降解率
中图分类号：TS41文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2019.01.004
文章编号：2096-1553（2019）01-0027-09
0 引言
果胶是构成烟草细胞壁的主要物质之一，在烟草中的含量约占5%～13%（若无特指，百分数均为质量分数），它是以半乳糖醛酸为主链，并连接着2-吡喃型鼠李糖基的复合多糖类物质[1-3].这类物质在热解时会产生甲醇，并进一步氧化为甲醛、甲酸等，这些氧化产物会增加烟草燃吸时的刺激性，对烟草的内在品质和安全性产生不利影响[4-6]，对人体有害.因此，适当降低烟叶中果胶的含量，对于提升烟叶品质、降低卷烟危害，具有重要的意义.
烟草果胶降解通常采用生物酶解方法.施林燕[7]通过对烟梗丝施加复合酶，使烟梗丝中的果胶含量降低13.08%.于建军等[8]研究发现，对烟叶施加果胶酶后会使烟草香气物质含量增加29.94%，可能是由于施加果胶酶后使烟叶中总糖含量增加所致.于兴伟等[9]采用固态发酵法用黑曲霉处理烟梗，发现烟草中果胶含量也明显降低.马东萍等[10]选用复合中性纤维素酶、酸性蛋白酶、复合果胶酶和中性脂肪酶配制成一种改性添加剂，这种改性添加剂可对烟梗中果胶、蛋白质等大分子化合物进行有效的生物降解和转化，从而改善萃取液中的致香物質.柏婷[11]利用生物酶解技术和化学技术对果胶进行降解.结果表明，当果胶酶质量分数为0.5%时，烟草中果胶含量由18.61%降低至 9.52%，且再造烟叶烟香较浓，刺激性明显下降，感官品质也得到明显改善.然而，利用微紫青霉生产果胶酶并将其应用于烟草果胶降解的报道则相对较少[12-14].鉴于此，本研究拟采用从烟田土壤中分离出的微紫青霉（Penicillium janthinellum）sw09菌株，根据该菌株高产果胶酶的特性，利用其粗酶液对造纸法再造烟叶混合浆料进行果胶降解处理，并进一步开展化学分析和感官质量评价，以期为烟叶品质提升和卷烟危害成分降低研究提供参考和借鉴.
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
供试材料：配方烟丝，河南中烟工业有限责任公司提供;高浓混合浆，取自河南烟草工业薄片有限公司工艺生产线;果胶酶为由郑州轻工业大学食品科学与工程学院实验室筛选的微紫青霉sw09产出的粗果胶酶液，即发酵上清液.
试剂：3，5-二硝基水杨酸（DNS），天津市光复精细化工研究所产;果胶标准品（酯化度67%～70%），Sigma＼|Aldrich公司产;D-（+）-半乳糖醛酸一水化合物标准品（纯度97%）和0.15%的咔唑溶液，天津市光复精细化工研究所产.
仪器：ATY124型电子分析天平，日本岛津公司产;Ultra3400型紫外分光光度计，北京普源精电科技有限公司产;HH-2型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司产;Agilent6890/5973型气质联用仪，安捷伦科技有限公司产;CDSPYROPROBE2000裂解仪，上海光谱仪器有限公司产.
1.2 实验方法
1.2.1 微紫青霉产果胶酶粗酶液的获取
将活化后的微紫青霉sw09接种至发酵培养基（质量浓度分别为葡萄糖50 g/L，酵母浸粉3 g/L，KH2PO4 1 g/L，果胶2 g/L，pH=5）[15].发酵条件为：5 L发酵罐培养，搅拌速度150 r/min，通气量2 V/（V·min），发酵温度32 ℃，初始pH=5，发酵时间72 h.待发酵结束后，将发酵液离心取上清液，即为果胶酶粗酶液[16].
1.2.2 微紫青霉产果胶酶粗酶液降解混合浆中果胶单因素试验
酶活的定义为：在45 ℃，pH=5条件下，1.0 mL酶液每min分解果胶产生1.0 μg 的D-半乳糖醛酸，即为一个酶活单位（1 U/mL）.通过单因素试验研究不同酶活力、酶解时间和反应温度条件下，微紫青霉产果胶酶粗酶液对混合浆中果胶含量的降解情况.
1.2.2.1 不同酶活力的粗酶液降解果胶能力的试验[17]
将不同酶活力的粗酶液（14 000 U/mL，6000 U/mL，3000 U/mL，1000 U/mL，700 U/mL 和450 U/mL），以料液比（m（混合浆干重/g）GA6FAV（粗酶液体积/mL），下同）为1GA6FA3的比例均匀喷施于10 g混合浆上，在50 ℃下酶解2.0 h.待酶解结束后，置于70 ℃烘箱中使酶灭活，测定各处理组样品果胶含量，每组试验重复3次.
1.2.2.2 不同酶解时间下粗酶液降解果胶能力的试验
将酶活力为14 000 U/mL的粗酶液，以料液比1GA6FA3，均匀喷施于10 g混合浆上，在50 ℃下分别酶解0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h和3.0 h.待酶解结束后，置于70 ℃烘箱中使酶灭活，测定各处理组样品果胶含量，每组试验重复3次.
1.2.2.3 不同料液比降解果胶能力的试验
将酶活力为14 000 U/mL的粗酶液，以不同料液比（1GA6FA1，1GA6FA3，1GA6FA5，1GA6FA7和1GA6FA9）均勻喷施于10 g混合浆上，在50 ℃下酶解2.0 h.待酶解结束后，置于70 ℃烘箱中使酶灭活，测定各处理组样品果胶含量，每组试验重复3次.
1.2.2.4 不同反应温度下粗酶液降解果胶能力的试验
将酶活力为14 000 U/mL的粗酶液，以料液比1GA6FA3，均匀喷施于10 g混合浆上，分别在30 ℃，35 ℃，40 ℃，45 ℃，50 ℃和55 ℃条件下酶解2.0 h.待酶解结束后，置于70 ℃烘箱中使酶灭活，测定各处理组样品果胶含量，每组试验重复3次.
1.2.3 正交试验设计
根据单因素试验结果设计正交试验，以果胶降解率为优化目标，对酶活力、酶解时间、料液比、反应温度等果胶降解条件进行优化.
1.3 测定方法
1.3.1 果胶含量测定方法
分别称取5 g（精确至0.001 g）经果胶酶处理前后的样品进行粉碎，过250目筛.然后参考刘玉佳等[18]的方法对样品中的果胶含量进行定量分析.
根据咔唑比色法测定果胶含量，以D-（+1）-半乳糖醛酸一水化合物为标准品.首先移取1 mL待测液于装有6 mL浓H2SO4的试管，摇匀.在85 ℃水浴条件下加热15 min.待试管冷却后，加入0.3 mL 0.15%的咔唑无水乙醇溶液，摇匀，暗置30 min后在 530 nm下测吸光度值.根据咔唑比色法标准曲线和下列公式，计算待测液中果胶含量[19].
果胶含量=C×V×K×100/（W×106）
式中，C为对照标准曲线求得的果胶提取稀释液的果胶含量/（μg·m-1），V为果胶提取液原液体积/ mL，K为果胶提取液稀释倍数，W为样品质量/g，106为质量单位换算系数.
实验组和对照组果胶含量的测定按照上述方法进行，果胶降解率的计算公式如下：
Ei=（C0-Ci）/C0×100%
式中，Ei为果胶的降解率/%，C0为空白对照样中果胶水解生成的半乳糖醛酸的质量浓度/（mg·mL-1），Ci为加酶处理的样品中果胶水解生成的半乳糖醛酸的质量浓度/（mg·mL-1）[13].
1.3.2 果胶相对分子量的测定
在1.3.1中总果胶提取液中加入质量浓度为0.1 g/mL的活性炭进行脱色，脱色完成后离心提取上清液进行旋蒸，待旋蒸至原体积1/5后加入1.5倍体积的无水乙醇用于沉淀果胶，静置、离心得到果胶粗品后再复溶以Sevage法[18]除蛋白，再经醇沉、离心、冷冻干燥得到果胶粉末.
用浓度为0.2 mol/mL的NaCl缓冲液平衡Sepharose CL-6B凝胶柱，每5 min收集一管洗脱液，洗脱速度为1.5 mL/min.用2 mL质量浓度为5 mg/mL的标准葡聚糖（T-150，T-70，T-40，T-10）分别上样，采用苯酚-硫酸法[20]在波长490 nm处跟踪显色，峰值处为洗脱体积Ve，标准糖的分配系数Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo），其中Vt为柱床体积/mL，Vo为外水体积/mL.以Kav为横坐标，葡聚糖标准品分子量的对数（logM）为纵坐标绘制标准曲线.在相同条件下测定酶解前后果胶的Ve/mL，根据标准曲线计算其相对分子量.
1.3.3 热裂解产物的测定
称取一定量酶解前后的样品置于裂解装置中，对裂解产物进行重复测定.裂解条件参考郝辉等[13]的方法.试验重复3次，结果取平均值.
1.4 感官评价
在正交试验得到的最佳酶解条件下，对高浓混合浆进行酶解，然后抄造切丝，按烟丝重量15%的比例与配方烟丝均匀混合后上机卷制.酶解处理后的样品作为试验组，100 ℃煮沸灭活酶液处理后的样品作为对照组，蒸馏水处理后的样品作为空白组.
按照标准要求[21]，将处理前后的烟丝进行卷制，然后在（22±2）℃，（60±5）%相对湿度的恒温恒湿箱中平衡48 h后进行感官评价.
2 结果与分析
2.1 果胶酶解的单因素试验结果
图1为酶活力、酶解时间、料液比和反应温度对果胶降解率的影响.由图1可以看出，随着酶活力的减小，样品中果胶的降解率呈现逐渐减小的趋势.当酶活力达到3000 U/mL后，进一步增加酶活力对样品果胶的降解率无明显影响.因此选择酶活力为14 000 U/mL，6000 U/mL，3000 U/mL的粗酶液作为正交试验设计中酶活力的3个水平.果胶的降解率随酶解时间的延长而增大.当酶解时间增加到2.5 h时，样品中果胶的降解率达到最大值，接近28%.因此选择酶解时间2.0 h，2.5 h和3.0 h作为正交试验设计中酶解时间的3个水平.料液比对样品中果胶的降解率的影响不大，因此选择料液比1GA6FA1，1GA6FA3，1GA6FA5作为正交试验设计中料液比的3个水平.随反应温度的升高，样品中果胶的降解率呈现先增大后减小的趋势.当反应温度为45 ℃时，果胶的降解率达到最大值，接近28%.因此选择温度40 ℃，45 ℃和50 ℃作为正交试验设计中反应温度的3个水平.
2.2 正交试验优化结果
根据以上单因素试验结果，选取酶活力（A），料液比（B），酶解温度（C），反应时间（D）4种因素设计L9（34）的正交试验方案，试验结果和方差分析结果分别见表1和表2.
对表1中极差R值大小进行比较可知，各个因素对降解率的影响由大到小依次为：反应时间>反应温度>酶活力>料液比.其中酶活力以3000 U/mL为最优，料液比以1GA6FA1为最优，酶解温度以50 ℃为最优，反应时间以3.0 h为最优，4种因素对果胶降解率的最优组合为A3B1C3D3.在该最优组合条件下进行验证，果胶的降解率达到最大28.63%.杨慧芳[22]以酶活 1 467.29 U/mL的青霉JXY-17发酵粗酶液在50 ℃条件下酶解烟梗12 h，果胶质降低29.38%.与其结果相比，本研究的酶活力更高，降解效果相似，但酶解时间大大缩短，更适用于工业生产.施林燕[7]以工业复合酶酶解烟梗丝4 h，果胶降解13.08%.与其结果相比，本研究的降解效果大大提升.
从表2可以看出，反应温度和反应时间的F值均大于F0.01（2，18）=6.01，说明反应温度和反应时间对果胶的降解率影响极显著;酶活力和料液比的F值均大于F0.05（2，18）=3.55，但小于F0.01（2，18）=6.01，說明酶活力和料液比对果胶的降解率影响显著.
2.3 相对分子量的测定结果
以分配系数（Kav）为横坐标、葡聚糖标准品分子量的对数（logM）为纵坐标作标准曲线，结果如图2所示.其线性回归方程为
y=-5.485 8x+6.537 9R2=0.993 7
由此计算得出的高浓混合浆中果胶相对分子量为341 kDa，经果胶酶处理后样品中果胶的平均相对分子量明显降低至55 kDa，说明经微紫青霉果胶酶处理后，样品中果胶大分子得到有效降解.
2.4 样品酶处理前后热裂解产物分析
实验选择300 ℃，600 ℃和900 ℃共3个温度对高浓混合浆酶解前后的热裂解产物进行裂解分析.结果发现，在裂解温度为600 ℃时裂解物质最多，裂解效果最好，因此本实验仅列出热裂解温度为600 ℃的结果.根据官能团不同，将检测出的化合物分为7类，分析结果见表3.
从表3可以看出，与原样品相比，混合浆经酶解后香气组分和含量均发生了变化.其中，18种酚类物质总量由7.10%减少到0.63%，以苯酚、邻甲酚、对甲酚的减少最为明显，酚类物质含量的下降有助于减少杂气的生成.果胶热裂解生成乙酸[8]，酶解后的果胶含量降低，乙酸含量由12.71%减少到10.65%，减轻了烟气吸味的刺激性.烟气中酚类物质和羧酸类物质部分来自于果胶的分解，由于果胶被果胶酶酶解，导致裂解产物中酚类物质和羧酸类物质下降[23].酶解后含氮杂环类物质总含量降低，由5.98%降至4.28%，其中烟碱由2.2%降低至1.88%，减少了有毒物质的生成.酶解后醇类物质总量由2.51%增加到2.83%.酶解后样品中醛酮类含量由16.27%减少到15.45%，由于烟草热裂解过程中产生的大部分挥发性羰基类物质是在纤维素、半纤维素、木质素和果胶等裂解之后的燃烧过程中形成的，因此果胶被降解，会导致烟草热裂解后挥发性羰基类物质含量下降[24]，醛酮类物质含量下降有可能会影响卷烟的风格特性，但是可以通过加香加料或者增加配方烟丝的用量进行弥补.
2.5 感官评价结果
感官评吸结果见表4.由表4可知，将经过微紫青霉产果胶酶处理的高浓混合浆抄造制丝加入卷烟后，卷烟香气质丰满细腻，烟气透发性更好，甜润感增强，刺激性减轻，也减少了烟气中的杂气，口感发涩程度减小且余味纯净舒适，吸食品质得以改善，但劲头略有不足.
3 结论
本文通过单因素试验和正交试验对微紫青霉产果胶酶降解高浓混合浆中果胶的工艺条件进行了优化，对酶解前后样品的热裂解产物进行了分析，并将酶解后样品添加至卷烟中进行感官评价，得到如下结论.
1）微紫青霉酶降解高浓混合浆中果胶的最优条件为：酶活力3000 U/mL，料液比1GA6FA1，酶解温度50 ℃，处理时间3 h，此时样品中果胶降解率为28.63%，果胶分子量由341 kDa降低至55 kDa.
2）酶解后样品的热裂解产物中，除醇类外，其他香味物质醛酮类、酯类、杂环类等的含量均减少.
3）将酶解后的高浓混合浆抄造制丝加入卷烟后，卷烟香气质丰满细腻，烟气透发性更好，甜润感增强，刺激性减轻，也减少了烟气中的杂气，口感发涩程度减小且余味纯净舒适，吸食品质得以改善，但劲头略有不足.
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