重组人促红细胞生成素对大鼠急性脊髓损伤后炎症因子表达及运动功能的影响
吴海峰 胡治平 赵慧毅 华强 谢柏臻 张仕开
【摘要】 目的 研究重組人促红细胞生成素（rhEPO）对大鼠急性脊髓损伤（SCI）后肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子的表达及运动功能的影响， 探讨其减轻脊髓损伤、保护神经功能的可能机制以及对运动功能恢复的影响。方法 36只SD大鼠， 采用随机数字表法分为假手术组（Sham组）、脊髓损伤组（SCI组）、治疗组（EPO组）， 每组12只。Sham组：不损伤脊髓， 仅行椎板切除术;SCI组和EPO组：行椎板切除术后， 均采用改良的Allen's撞击法造成脊髓损伤。EPO组于术后1 h、1 d、3 d、7 d、14 d腹腔注射rhEPO;Sham组及SCI组， 于术后1 h、1 d、3 d、7 d、14 d腹腔内注射等量的0.9%氯化钠溶液。术后第3天， 各组分别处死6只大鼠并取材， 用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测 TNF-α、IL-1β 、IL-6 的表达水平;并用脊髓损伤Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分法评价大鼠术后第1、3、7、14 天的运动功能情况。比较三组脊髓组织中各炎症因子表达情况及不同时间点BBB评分。结果 术后第3天， Sham组的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI组及EPO组， EPO组的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。BBB评分最高分21分， Sham组无脊髓损伤， 术后大鼠运动功能正常， BBB评分接近正常值。术后第1、3、7、14天， EPO 组和SCI组大鼠的BBB评分随着时间的延长而升高， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。术后第1、3、7、14天， EPO 组和SCI组大鼠的BBB评分均低于Sham组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。术后第7、14天， EPO组大鼠的BBB评分分别为（10.04±1.01）、（12.50±1.17）分， 均高于SCI组（7.92±1.04）、（9.92±1.12）分， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论 rhEPO可减少急性脊髓损伤后炎症因子TNF-α、IL-1β 、IL-6的表达， 减轻炎症反应， 从而发挥保护神经的作用;且rhEPO 可明显改善脊髓损伤后大鼠的运动功能， 有利于神经功能的恢复。
【关键词】 脊髓损伤;重组人促红细胞生成素;炎症因子;运动功能
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.03.093
【Abstract】 Objective? ?To investigate the effects of recombinant human erythropoietin （rhEPO） on the expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6（IL-6） and motor function after acute spinal cord injury （SCI） in rats， and to explore the possible mechanism of its reduction of spinal cord injury and protection of nerve function， as well as its effect on the recovery of motor function. Methods? ?A total of 36 SD rats were divided into sham-operated group （Sham group）， spinal cord injury group （SCI group） and treatment group （EPO group） by random number table method， with 12 rats in each group. Sham group： no spinal cord injury， only laminectomy; SCI group and EPO group： after laminectomy， modified Allen's impact method was used to cause spinal cord injury. EPO group was intraperitoneally injected with rhEPO 1 h， 1 d， 3 d， 7 d and 14 d after operation. In the Sham group and SCI group， the same amount of 0.9% sodium chloride solution was injected intraperitoneally 1 h，?1 d， 3 d， 7 d and 14 d after operation. On 3rd day after operation， 6 rats in each group were killed and sampled， and the expression levels of TNF- α， IL-1β and IL-6 were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. The exercise function of rats on the 1st， 3rd， 7th and 14th days after operation was evaluated by spinal injury Basso-Beattie-Bresnahan（BBB） score. The expression of inflammatory factors and BBB scores at different time points in the three groups were compared. Results? ?At 3rd day after operation， the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in Sham group was lower than those in SCI group and EPO group， and EPO group was lower than SCI group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. The highest BBB score was 21 points. There was no spinal cord injury in the Sham group. The postoperative rats had normal motor function， and BBB score is close to normal. On the 1st， 3rd， 7th and 14th day after operation， BBB scores of EPO group and SCI group increased with time， and the difference was statistically significant （P<0.05）. On the 1st， 3rd， 7th and 14th day after operation， the BBB scores of EPO group and SCI group were lower than those of sham group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. On the 7th and 14th day after operation， the BBB scores of EPO group were （10.04±1.01）， （12.50±1.17） points respectively， which were higher than those of SCI group （7.92±1.04）， （9.92±1.12） points. The difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? ?RhEPO can reduce the expression of inflammatory factors TNF-a， IL-1β and IL-6 after acute spinal cord injury， and reduce the inflammatory response， thereby playing a neuroprotective role.? rhEPO can significantly improve the motor function of rats after spinal cord injury and is beneficial to the recovery of nerve function.
【Key words】 Spinal cord injury; Recombinant human erythropoietin; Inflammatory factors; Motor function
脊髓损伤是脊柱骨折脱位中常见而严重的损伤， 不仅给患者带来严重的身心伤害， 也给社会带来巨大经济负担。目前临床上对脊髓损伤的治疗效果欠佳， 对脊髓损伤后炎症作用机制了解较少。近年来， 促红细胞生成素（EPO）已被证明在神经退行性疾病、神经元死亡相关的损伤和其他疾病的各种体内外模型中具有保护作用[1]。Okutan等[2]的研究表明， EPO具有抗细胞凋亡和抗炎的作用， 可显著改善大鼠的早期运动功能。本实验旨在通过建立大鼠的SCI撞击模型， 观察rhEPO对大鼠SCI后TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平及运动功能的影响， 探讨其减轻脊髓损伤、保护神经功能的可能机制以及对运动功能恢复的影响。现报告如下。
1 材料与方法
1. 1 大鼠来源 36只SD大鼠（SPF级， 体重220～250 g）， 由厦门大学实验动物中心提供。大鼠饲养条件为：室温20～25 ℃，?光照和黑暗持续时间为12 h， 可随意获取水和食物。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组（Sham组）、脊髓损伤组（SCI组）、治疗组（EPO组）， 每组12只。
1. 2 方法 Sham组：不损伤脊髓， 仅行椎板切除术;SCI组及EPO组：行椎板切除术后， 均采用改良的Allen's撞击法造成脊髓损伤。EPO组于术后1 h、1 d、3 d、7 d、14 d腹腔注射rhEPO（按照5000 U/kg注射）;Sham组及SCI组于术后1 h、1 d、3 d、7 d、14 d腹腔内注射等量的0.9%氯化钠溶液。实验开始前， 大鼠经腹腔注射1.5 %戊巴比妥钠麻醉后（40 mg/kg）， 取俯卧位， 将大鼠固定于无菌操作台上， 背部剃毛， 消毒后铺无菌洞巾， 以T10棘突为中心作一长约3 cm的正中切口， 依次分离各层组织， 显露T9～T11的上下棘突及椎板， 用咬骨钳咬除T10棘突及双侧椎板， 使硬脊膜充分暴露。然后用自制的改良Allen's装置， 造成T10脊髓的急性挫伤。（在硬脊膜表面放置一个与其弯曲度一致的塑料垫片， 垫片上垂直放置一个带有刻度的玻璃管， 让重量为10 g的圆柱状金属棒， 在玻璃管的引导下， 从刻度3 cm的高度垂直下落， 使其撞击垫片， 造成致伤力为30 gcf的脊髓损伤。）随即大鼠出现身体颤抖， 尾巴痉挛性摆动， 双下肢迅速回弹， 术后大鼠出现双侧后肢软瘫， 肌张力消失， 损伤平面以下对刺激无反应， 提示SCI模型制备成功。操作完成后， 用0.9%氯化钠溶液冲洗伤口并逐层缝合， 术后所有大鼠饲养条件同前。脊髓损伤后， 每只笼饲养2只大鼠， 按压大鼠膀胱3次/d， 直至恢复排尿功能。各组术后第3天完成BBB评分后， 分别处死6只大鼠， 沿原切口取出以 T10节段为中心长约1.5 cm的伤段脊髓， 保存于液氮中备用。
1. 3 观察指标及判定标准
1. 3. 1 各炎症因子的表达情况 rhEPO注射液购自沈阳三生制药有限公司， TNF-α、IL-1β、IL-6 的ELISA 试剂盒购自武汉博士德生物科技有限公司。检测TNF-α、IL-1β、IL-6的表达情况， 采用ELISA法， 严格按照说明书步骤操作。
1. 3. 2 BBB评分 参照Basso等提出的BBB评分法进行评分， 满分21分[3]。评分由2名非本组但熟悉 BBB 评分的研究人员进行， 术后第1、3、7、14天对每只大鼠进行BBB评分（术后第1、3天各组随机抽取6只大鼠进行评分， 以保证各时间点评分的大鼠数量一致）， 双人独立观察， 主要观察大鼠行走步态以及四肢关节的协调性。观察时间≥4 min/次， 最终取平均值。
1. 4 统计学方法 采用SPSS25.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验， 多组比较采用方差分析;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差異有统计学意义。
2 结果
2. 1 三组脊髓组织中各炎症因子表达情况比较 术后第3天， Sham组的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI组及EPO组， EPO组的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI组，?差异均具有统计学意义（P<0.05）， 说明EPO可以明显减少脊髓损伤后炎症因子的表达。见表1。
2. 2 三组大鼠不同时间点BBB评分比较 BBB评分最高分21分， Sham组无脊髓损伤， 术后大鼠运动功能正常， BBB评分接近正常值。术后第1、3、7、14天， EPO组和SCI组大鼠的BBB评分随着时间的延长而升高， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。术后第1、3、7、14天， EPO 组和SCI组大鼠的BBB评分均低于Sham组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。
术后第7、14天， EPO 组大鼠的BBB评分均高于SCI组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表2。
3 讨论
脊髓损伤的机制包括即刻的机械损伤（原发性损伤）和随之发生的血管、生化反应所致的继发性损伤。其中继发性损伤阶段其病理生理机制涉及血管功能障碍、水肿、局部缺血、兴奋性毒性、电解质移位、自由基产生、炎症和延迟的凋亡性细胞死亡[4]。研究表明， 炎症反应在脊髓继发性损伤中起重要作用[5]。
在炎症反应中， TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子具有促进炎症反应的进展， 加重脊髓继发性损伤的作用， 其主要病理机制包括[3]：①炎症因子激活一系列的炎症反应加重脊髓组织的水肿和坏死;②炎症因子刺激胶质细胞增殖， 形成瘢痕;③TNF-α通过与其受体结合触发凋亡信号转导， 导致神经元凋亡;④炎症因子通过正反馈机制增强NF-B（核因子B）的表达， 从而形成级联放大效应， 进一步促进TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达。Zhou等[6]通过研究表明， EPO可以降低受损脑组织中促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的表达， 减少中性粒细胞和分化簇3（CD3）+T细胞在脑组织中的浸润和活化， 增加抗炎细胞因子白细胞介素-10（IL-10）的表达， 从而调节炎症反应， 改善神经和认知功能。本文实验中显示， 术后第3天， Sham组的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI组及EPO组， EPO组的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）， 说明EPO可以明显减少脊髓损伤后炎症因子的表达。说明rhEPO可能通过抑制脊髓损伤后 TNF-α、IL-1β、IL-6的表达， 减轻炎症反应， 从而改善神经功能。
EPO是一種在神经保护中具有新兴作用的细胞因子。EPO通过降低谷氨酸毒性， 增加抗细胞凋亡因子的产生， 减少炎症和通过直接和间接抗氧化作用减少一氧化氮介导的损伤来促进中枢神经系统（CNS）损伤后的神经再生。Noguchi等[7]通过大鼠脊髓损伤模型发现EPO对大鼠神经根撕脱伤后脊髓运动神经元具有神经保护作用。Simon等[8]在兔的脊髓缺血/再灌注损伤模型上证实EPO可减轻神经细胞损伤和凋亡， 且有助于运动功能的恢复。本实验中， BBB评分最高分21分， Sham组无脊髓损伤， 术后大鼠运动功能正常， BBB评分接近正常值。术后第1、3、7、14天， EPO 组和SCI组大鼠的BBB评分随着时间的延长而升高， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。术后第1、3、7、14天， EPO 组和SCI组大鼠的BBB评分均低于Sham组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。术后第7、14天， EPO 组大鼠的BBB评分分别为（10.04±1.01）、（12.50±1.17）分， 均高于SCI组（7.92±1.04）、（9.92±1.12）分， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。说明rhEPO 可明显改善脊髓损伤后大鼠的运动功能， 有利于神经功能的恢复。
总之， 本研究为EPO的神经保护作用提供了一定的实验证据， 但是， 由于继发性脊髓损伤涉及的机制繁多复杂， 因此仍然需要大量更深入的研究去揭示其本质。鉴于EPO诱导的神经保护作用越来越多， 相信在不远的将来EPO很可能成为临床上治疗脊髓损伤的有效治疗方法。
参考文献
[1] Grasso G， Sfacteria A， Erbayraktar S， et al. Amelioration of spinal cord compressive injury by pharmacological preconditioning with erythropoietin and a nonerythropoietic erythropoietin derivative. Journal of neurosurgery Spine， 2006， 4（4）：310-318.
[2] Okutan O， Solaroglu I， Beskonakli E， et al. Recombinant human erythropoietin decreases myeloperoxidase and caspase-3 activity and improves early functional results after spinal cord injury in rats. Journal of Clinical Neuroscience， 2007， 14（4）：364-368.
[3] 李基民， 权正学， 刘渤. 核转录因子-κB 信号途径与急性脊髓损伤继发伤的研究进展. 创伤外科杂志， 2009， 11（1）：85-87.
[4] Rowland JW， Hawryluk GW， Kwon B， et al. Current status of acute spinal cord injury pathophysiology and emerging therapies： promise on the horizon. Neurosurgical focus， 2008， 25（5）：E2.
[5] Alexander JK， Popovich PG. Neuroinflammation in spinal cord injury： therapeutic targets for neuroprotection and regeneration. Progress in brain research， 2009（175）：125-137.
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[7] Noguchi T， Ohta S， Kakinoki R， et al. The neuroprotective effect of erythropoietin on spinal motor neurons after nerve root avulsion injury in rats. Restorative neurology and neuroscience， 2015， 33（4）：461-470.
[8] Simon FH， Erhart P， Vcelar B， et al. Erythropoietin preconditioning improves clinical and histologic outcome in an acute spinal cord ischemia and reperfusion rabbit model. Journal of vascular surgery， 2016， 64（6）：1797-1804.
[收稿日期：2019-11-22]
