猪肉中氯丙嗪残留UPLC-MS/MS检测法的优化研究
王婷
摘 要：本文在《猪肾和肌肉组织中氯丙嗪残留量的测定》（GB/T 20763-2006）的基础上优化了样品的提取净化方式，增加了定性离子，建立了操作便捷、准确度高、重现性好的猪肉中氯丙嗪残留量液质检测的新方法。具体操作为，样品在碱性条件下经特丁基甲醚提取，冷冻离心除脂后取上清液，经液相色谱质谱联用仪分析检测。结果表明，优化后的方法在0.5～20ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r=0.9997;在0.5～5μg/kg范围内，3个浓度的加标回收率均在75%～95%之间，测定结果均满足国标方法中的重复性要求（含量范围：0.750～4.800μg/kg、r=0.4736m-0.1775）。
关键词：氯丙嗪 ?液相色谱-质谱联用法 ?残留量 ?猪肉
氯丙嗪属于吩噻嗪类药物，可作用于中枢神经系统，故被作为中枢多巴胺受体的阻断剂，具有镇静、催眠、镇吐、抗晕眩等功效[1-3]。当前，氯丙嗪常被一些养殖户违规添加至家畜饲料中，目的是通过抑制家畜运动来达到“短期育肥”的效果，或在家畜长途运输过程中减少其应激反应，进而降低死亡率[4-5]。氯丙嗪的药物滥用造成其在动物体内大量残留，并通过食物链进入人体，长期蓄积会引发人体食物中毒、肝脏和肾脏病变等，直接危害人体健康[6-7]。目前，欧盟及我国相关部门均明令规定“不得在动物源性食品中检出氯丙嗪”[8-9]。当前，我国对氯丙嗪药物在食品中的残留检测方法主要采用《猪肾和肌肉组织中氯丙嗪残留量的测定》（GB/T 20763-2006）。经过实验发现，该检测方法前处理过程中的提取和净化操作是通过调节pH值控制目标物在有机相和水相两相间重复萃取，处理过程繁琐，特丁基甲醚用量大、次数多，且目标物随特丁基甲醚使用量的增加而不断损失，导致回收率偏低。因此，本文对该方法的前处理方法进行改进，优化步骤，建立了操作便捷、准确度高、重现性好的前处理方法，希望为提高氯丙嗪的日常检验效率和标准更新提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器及试剂
1.1.1 主要仪器及设备
Thermo TSQ QUANTUM ULTRA超高效液相色谱-质谱联用仪，美国Thermo Fisher科技公司;台式冷冻离心机，盐城市安信实验设备有限公司。
1.1.2 试剂及样品
1.1.2.1 试剂
盐酸氯丙嗪标准品，购自北京北方伟业计量技术研究院;供试试剂试药：乙腈、甲酸均为色谱级，氢氧化钠、特丁基甲醚为优级纯，实验用水为屈臣氏蒸馏水;氢氧化钠溶液：5mol/L;甲酸水溶液：0.2%（体积分数）;盐酸氯丙嗪标准溶液：100μg/mL。
1.1.2.2 样品
将市售猪肉搅碎拌匀，密封，待用。
1.2 试验方法
1.2.1 样品处理
称取2.00g（精确到0.01g）均质试样于50mL离心管中，加入0.2mL乙腈混匀，然后加入5mol/L氢氧化钠溶液400μL，涡流混合30s。置于80±5℃恒温水浴中1h，期间进行两次涡流混合。1h后取出，冷却至室温。精密量取1mL特丁基甲醚加入离心管，高速振荡15min后置于冷冻离心机中离心10min（温度2℃、转速10000r/min），取上清液过0.2μm滤膜上机。
1.3 仪器分析方法
1.3.1 色谱条件
色谱柱：Thermo Fisher Hypersil Gold C18（内径100×2.1mm，粒径1.7um）;柱温：40℃;进样体积：5μL;流速：0.2mL/min;流动相A：0.2%甲酸水溶液，流动相B：乙腈。
洗脱程序：0min，B相：5%;0.5min，B相：5%;4min，B相：95%;6min，B相：95%;6.1min，B相：5%;10min，B相：5%。
1.3.2 质谱条件
ESI正离子模式，喷雾电压3.5kV，蒸发温度320℃，离子传输管温度300℃，鞘气（N2）流量35arb，辅助气（N2）10arb。
氯丙嗪母离子：319.063amu，子离子：58.585amu、86.434amu、214.124amu、246.156amu，86.434amu为定量离子。
2 结果与分析
2.1 样品前处理优化
按照GB/T 20763-2006中的前处理方法进行提取、净化，发现氯丙嗪回收率极低。参照标准溯源分析发现，氯丙嗪易溶于特丁基甲醚，故净化除酯操作过程中，目标物易随特丁基甲醚流失，从而导致回收率低，故针对上述问题做出如下调整。
①将标准中“加入12mL特丁基甲醚，……，待净化”改为“精密量取1mL特丁基甲醚加入离心管”，在保证充分萃取的前提下，减少醚类有毒试剂的使用量。
②将原标准净化步骤：“在上述15mL离心管中加入1mol/L磷酸二氢钾溶液（pH值=3）3mL，……，超声处理10min”改为“提取后置于冷冻离心机离心10min（温度为2℃，转速为10000r/min）”。经过离心，离心管内液体分为3层——下层为水层、中间层为结块的油脂、上层为特丁基甲醚，吸取醚层，过0.2μm有机滤膜直接上机测定。
采用优化后的步骤进行前处理，有效避免了原标准提取和净化操作步骤中目标物在有机相和水相两相间反复萃取造成的损失，且特丁基甲醚用量大幅降低，优化后的回收率提高至75%～95%，稳定性好，检测结果的准确性高。
2.2 质谱条件优化
原标准中氯丙嗪的定性子离子为：58.2amu和86.2amu。由于子离子碎片較小，相对丰度差异较大，因此容易出现共流出干扰。此外，如果出现阳性临界值样品，则难以快速准确定性。通过仪器优化，选取58.585amu、86.434amu、214.124amu和246.156amu为定性子离子，多选出来的两个子离子可用于辅助定性。
2.3 检测结果分析
2.3.1 线性实验
精密量取氯丙嗪标准溶液，加入特丁基甲醚制成浓度为0.5、1、2、5、10、20ng/mL的标准点，采用“1.3”中色谱质谱条件进行检测，测得氯丙嗪线性方程：Y=21341.9+190076X，相关系数R2=0.9997。
2.3.2 方法的灵敏度和稳定性
原标准方法中的氯丙嗪检出限为0.5μg/kg，本研究采用猪肉空白基质分别按0.5、1、5μg/kg这3个水平进行添加回收实验，依据上述方法进行测定，测定结果均满足国标方法中的重复性要求（含量范围：0.750～4.800μg/kg、r=0.4736m-0.1775），3个水平的阳性添加回收率均在75%～95%之间，回收率稳定。结果显示，优化后的方法在原标准检出限0.5μg/kg处可以准确定量。
2.3.3 样品检测结果
20批次样品中均未检出氯丙嗪残留。
3 结论
通过对前处理过程中的净化步骤进行改进，采用冷冻离心除脂代替了调节样品pH值重复萃取操作，不仅使有毒试剂的使用量减少，而且大幅缩减了操作时间，有效减少目标物的损失。该前处理方法操作简单，安全性高，结果准确度高、重现性好，灵敏度高于现行标准，故适用于大批量猪肉中氯丙嗪残留量的检测。
参考文献：
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[9] 《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB31650-2019）農业农村部、国家卫生健康委员会和国家市场监督管理总局公告2019年第114号.2019-09-06.
