家禽卵泡闭锁研究进展

    张昊　陈芳　梁振华　杜金平

    摘要：家禽卵泡闭锁是繁殖过程中重要生理现象，也是一种多因素调控的选择性细胞凋亡过程。研究卵泡的闭锁可以为家禽繁殖性能提高提供理论依据。对家禽的卵泡颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁、激素对颗粒细胞凋亡的影响、颗粒细胞凋亡的相关基因、生长因子、细胞因子和miRNAs等方面进行了综述。

    关键词：家禽；卵泡闭锁；进展

    中图分类号：S814.1 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2014）10-0061-05

    卵泡闭锁是卵泡从发育到排卵前所发生的退化并最终被清除的生理现象。哺乳动物和鸟类中，卵泡闭锁是一种正常的繁殖生理过程。在家禽中，卵泡闭锁在卵泡发育的任何时期都会发生，而闭锁卵泡的数量直接影响到产蛋率的高低。闭锁卵泡数少的个体进入等级卵泡的数量增多，产蛋序列延长，产蛋率增加。卵泡闭锁的潜在机理是卵泡中发生了细胞凋亡，其中卵泡颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的根本原因。而卵泡颗粒细胞凋亡是多因素参与的复杂调控过程，激素、细胞因子等可通过抑制或诱导细胞凋亡，对该进程进行调控。有关禽类卵泡闭锁的研究远不及哺乳动物深入，但哺乳动物卵泡闭锁发生机制的研究有助于探讨禽类卵泡闭锁的机理。而禽类卵泡闭锁的研究对提高家禽繁殖能力有重要的指导意义。

    1 卵泡颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁

    禽类的卵泡闭锁在卵泡发育的各个时期都有发生，并具有明显的形态特征：表现为卵泡表面出现出血点，卵泡塌陷变形。Gupta等[1]通过组织学方法对鸡部分卵泡观察研究发现，卵泡闭锁主要表现为两种形式：一种是直径小于1mm卵泡的非破裂型闭锁，表现为闭锁卵泡内容物吸收，膜细胞、颗粒细胞分离；另一种则是直径大于1 mm的破裂型闭锁，表现为细小、不可见的卵泡壁的破裂，蛋黄液和各种细胞通过破裂处进入间质。同时发现，破裂型闭锁卵泡的颗粒细胞的有丝分裂指数显著低于正常细胞。

    在哺乳动物中，有学者指出，羊卵泡内膜细胞在卵泡闭锁过程中发生核固缩、核破裂，然后进入卵泡液，最终被巨噬细胞吞噬。Zeleznik等采用生化手段研究大鼠的颗粒细胞和黄体，首次指出卵巢内表现出凋亡特有的DNA阶梯。后来，越来越多的研究表明，在哺乳动物中，细胞凋亡是卵泡闭锁的根本原因，颗粒细胞凋亡触发了卵泡闭锁[2]。

    细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是生物机体维持自身稳定的一种基本生理机制，是机体生长、分化、发育以及病理过程中由基因编码决定的生理性、主动性细胞死亡， 具有特定的时空顺序和形态学特征。卵泡闭锁的早期特征是颗粒细胞核固缩，最终导致卵泡坍塌，基膜不完整，颗粒细胞数减少。

    在家禽中，Tilly等[3]发现鸡的卵泡闭锁过程中存在颗粒细胞凋亡现象。而在正常的生长卵泡内，颗粒细胞分裂增殖和凋亡现象是并存的[4]，当发育卵泡中凋亡的颗粒细胞比率达到10%以上，发生卵泡闭锁[5]。Johnson等[6]证实鸡卵巢的卵泡闭锁起始于颗粒细胞层，并受到细胞凋亡过程的调节。鹅闭锁卵泡的颗粒细胞也表现出明显的凋亡特征[7]。禽类卵泡闭锁主要与卵泡发育程度[8]、卵泡在卵巢中的部位以及家禽品种有关。

    2 激素对颗粒细胞凋亡的影响

    对哺乳动物卵泡颗粒细胞凋亡的研究结果发现，生殖激素在这一过程中发挥了不可忽视的作用。研究认为，促卵泡生成素（FSH）是调节颗粒细胞凋亡的主要调控激素，其他激素通过影响FSH分泌间接发挥作用因此，下面主要从激素对卵泡颗粒细胞凋亡的影响进行阐述。

    2.1 FSH对卵泡颗粒细胞的影响

    促卵泡生成素（FSH）又称卵泡刺激素，由脑垂体分泌。FSH的主要作用位点为成熟卵泡和小卵泡的膜细胞，可调节细胞分化，诱导黄体生产素受体的形成，刺激类固醇激素合成等。FSH通过与膜受体FSHR结合，从而激活相关的信号通路，如PKA、PI3K/Akt、ERK1/2、ERK5、p38 MAPK以及VEGF等发挥其生理作用[9]。其对卵泡的作用主要表现为：使卵巢血液循环加快并增强卵泡壁细胞的摄氧量，促进卵黄沉积，最终使卵泡的重量和体积增加。研究发现，摘除垂体的产蛋鸡，大中型卵泡萎缩，通过注射FSH可使卵泡继续生长[10]。对体外培养的卵巢颗粒细胞研究发现，FSH诱导6～8 mm的卵泡颗粒细胞芳香化酶活性，促进孕酮的合成，并促进颗粒细胞分化。由于FSH通过其受体（FSHR）发挥作用，鸡FSHR在产蛋期卵巢的不同等级卵泡内膜细胞和颗粒细胞中都有表达，等级卵泡颗粒细胞上FSHR数目随卵泡成熟下调。康丽等[11]研究结果显示，FSHR基因5调控区的多态位点可以通过调节FSHR的mRNA表达量，且FSHR表达与开产日龄正相关。由此可见，FSH与其受体在禽类卵泡发育中的作用是抑制颗粒细胞凋亡，防止卵泡闭锁，促进卵泡发育[12]。

    2.2 促性腺激素释放激素（GnRH）对颗粒细胞凋亡的影响

    GnRH通过下丘脑-垂体-性腺轴起作用，能够促进垂体前叶释放FSH和促黄体素（LH），故GnRH也具有与FSH相同的抑制颗粒细胞凋亡的作用。活体试验也表明，在生产中使用GnRH类似物能够增加产蛋量。说明GnRH对卵泡发育和排卵起促进作用。近年来，许多研究者将研究重点集中于GnRH的直接作用。GnRH具有其直接结合受体（GnRHR），在卵巢内膜的颗粒细胞和内膜细胞中都存在GnRHR表达。张海峰等[13]研究表明，GnRH单独处理能够促进离体培养的鸡卵泡颗粒细胞分泌孕酮。

    综上所述，GnRH对卵泡颗粒细胞的凋亡起抑制作用，主要通过两种方式：一种是通过刺激FSH分泌，另一种是直接作用于卵泡颗粒细胞，通过其受体发挥作用。但是两种方式之间如何协调，GnRH与其受体结合后通过何种信号通路抑制颗粒细胞凋亡，不同浓度下GnRH的不同作用等，均有待于进一步的研究。

    2.3 催乳素（PRL）对卵泡颗粒细胞的影响

    催乳素是一种具有多种生理功能的激素，能够促使禽类就巢。PRL作用于卵巢能够抑制卵泡生长。对禽类研究发现，当禽类就巢时，其卵泡发育停止，卵泡萎缩，血液中PRL浓度升高。对产蛋期母鸡注射外源PRL，也会产生就巢行为，卵巢中卵泡发生萎缩。然而，FSH与PRL同时处理的产蛋期母鸡不发生卵泡萎缩现象。活体试验发现，高水平PRL通过抑制GnRH的分泌降低FSH和LH的分泌，从而抑制鸟类卵泡发育[14， 15]。因此，推断PRL通过调控下丘脑-垂体-性腺轴引起卵泡萎缩[16]。RRL对靶组织发挥生理作用途径之一是通过与其受体（PRLR）结合，而卵泡的内膜细胞具有PRLR。在体外培养的颗粒细胞中的研究结果显示，PRL能够抑制膜细胞合成睾酮和雌二醇。由此可见，PRL还能够通过作用于卵泡膜，抑制类固醇激素合成，促进颗粒细胞凋亡。但PRL对卵泡颗粒细胞凋亡的具体发生机理仍有待于进一步研究。

    2.4 类固醇激素对卵泡颗粒细胞的影响

    与禽类卵泡生长凋亡相关的类固醇激素主要包括两种，一种是源于卵泡内膜细胞的雌激素，主要为雌二醇（E2），另一种是卵泡颗粒细胞产生的孕激素，主要为孕酮（P4），这两种激素都是甾醇类激素，是甾体化合物通过一系列酶促反应形成。

    雌激素具有促进卵泡生长的作用，能够抑制颗粒细胞凋亡。在卵巢中，雌激素主要由大中型卵泡分泌，因此，在高产家禽中，雌激素含量相对较高，而在休产期和就巢期E2的水平显著低于产蛋期[17]。陈秀萍等[7]研究发现，鹅闭锁卵泡卵黄的雌激素水平极显著低于正常卵泡。雌激素主要通过结合其受体后经特定的细胞信号通路发挥其生理作用。雌激素的受体有多种亚型，包括经典的雌激素受体α（ERα）和雌激素受体β（ERβ）以及膜性受体等。关于雌激素通过其受体发挥生理作用的研究主要在哺乳动物上，且主要集中于表达定位。在生殖系统中，ERα主要存在于卵囊泡膜细胞中，ERβ主要存在于卵泡颗粒细胞[18]。由于雌激素与其受体主要通过ERα/ERβ同二聚体或ERα/ERβ异二聚体结合，故靶器官中ERα、ERβ的比例也是激素发挥作用的重要因素。目前，具体的作用机理仍有待于进一步研究。

    禽类卵巢中无黄体，因此孕酮主要由卵泡颗粒细胞产生。哺乳动物中研究发现，孕酮拮抗剂可以促进颗粒细胞凋亡，刺激卵泡闭锁，说明孕酮具有抑制卵泡颗粒细胞凋亡的作用。而大剂量的孕酮抑制FSH和LH的分泌，对卵泡发育起抑制作用，说明孕激素发挥作用具有浓度依赖性。随着孕酮的相应核受体（PGR）的发现，孕激素对卵泡闭锁的研究将进一步深入。

    3 颗粒细胞凋亡相关基因、生长因子和细胞因子的研究进展

    3.1 影响颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁的相关基因

    抑癌基因P53蛋白定位于闭锁卵泡的颗粒细胞核上，可以抑制细胞的有丝分裂，促进颗粒细胞凋亡。在闭锁卵泡中，P53的mRNA表达显著增加。FSH可以通过影响体外培养颗粒细胞中P53蛋白的表达，减少颗粒细胞凋亡发生。

    WT-1抑癌基因mRNA在小鼠卵泡颗粒细胞 中高表达。FSH抑制颗粒细胞凋亡时，WT-1基因3种亚型的mRNA表达量均下降。在鸟类和哺乳动物中，WT-1主要在未成熟的卵泡中表达。WT-1可能参与调控卵泡的成熟，阻止卵泡体细胞过早分化[19]。有报道认为WT-1可能通过抑制生长因子的转录促进颗粒细胞凋亡。

    B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）基因家族，其作用不是促进细胞增殖，而是通过阻断程序性细胞死亡信号通路中的最终共同通道而延长细胞生命期，是一种重要的细胞存活基因[20]。卵泡自噬体的积累会增加颗粒细胞的凋亡，而该过程主要是通过降低Bcl-2的表达水平实现的[21]。敲除Bcl-2小鼠，初级卵泡减少；而Bcl-2过表达则导致出生后小鼠体内卵泡数增加，该结果说明Bcl-2具有促进颗粒细胞存活作用[22]。鸡的4～8 mm卵泡颗粒细胞易发生凋亡引起卵泡闭锁，此时期的颗粒细胞中检测不到Bcl-2家族蛋白表达产物，而F1卵泡中颗粒细胞的Bcl-2家族蛋白产物最多[23]。

    Fas/FasL系统是肿瘤坏死因子（TNF）和神经生长因子受体（NGF-R）家族的细胞表面分子，具有3个与细胞凋亡诱导功能相关的结构域。Fas是介导细胞凋亡的细胞膜表面蛋白，存在于颗粒细胞和黄体细胞中。以此蛋白为抗原的配体FasL在颗粒细胞核有活性的T细胞中存在。Fas抗体或FasL通过与Fas结合来导致携带Fas的细胞凋亡[24]。研究发现大鼠闭锁卵泡的颗粒细胞中Fas的mRNA表达，而健康的颗粒细胞中未发现Fas抗原，说明该系统发生在闭锁的卵泡中。Fas调节小鼠颗粒细胞凋亡的功能可以被生长因子抑制，也可以受到一些细胞因子活化。

    3.2 影响颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁的生长因子

    多种生长因子能够调节颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁。EGF、TGF-α可以促进颗粒细胞增殖， 抑制其凋亡。EGF可促进有丝分裂活性和颗粒细胞分化，调节类固醇激素的合成。EGF与TGF-α具有同源结构。体外培养的颗粒细胞中，EGF和TGF-α的添加可以抑制颗粒细胞的自发凋亡[25]。胰岛素生长因子（IGFs）是一种多能细胞增殖调控因子，在哺乳动物卵巢的颗粒细胞区，IGF- I 与其受体结合，可以促进颗粒细胞增殖，并维持芳香化酶功能，使雌激素合成增加，促进卵泡进一步发育。卵泡体外培养试验结果表明，IGF-I 能显著提高产蛋鸡 SYF 颗粒层和膜层的细胞数目以及厚度[26]。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能够促进有丝分裂，颗粒细胞可以分泌bFGF，通过旁分泌途径影响卵泡内膜血管的发生，促进卵泡生长。生长分化因子-9（GDF-9）通过抑制颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁，对卵母细胞的增殖起促进作用，并能影响类固醇激素的合成，抑制FSH诱导的颗粒细胞黄体化。GDF-9敲除的卵母细胞，卵泡不能发育到次级卵泡阶段[27]。

    3.3 影响颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁的细胞因子

    细胞因子能够调节多种细胞的生理功能，是一类具有广泛生物活性的激素样多肽。其中，白血病抑制因子（LIF）能够促进颗粒细胞的生长，诱导原始卵泡的发育。干细胞生长因子（SCF）具有促进细胞增殖和分化的作用，颗粒细胞可以合成SCF。SCF在颗粒细胞与内膜细胞互作中发挥重要作用，并能促进卵母细胞发育。

    4 与卵泡闭锁相关miRNA的研究

    miRNA是一类长度为18-25核苷酸，对靶基因mRNA进行转录后调节的内源性非编码单链小RNA。到目前为止，已有许多研究证实miRNA参与凋亡调控。Yamakuchi等[28]研究结果证实，miR-34a可以通过靶向p53的去乙酰化酶SIRT1基因促进细胞凋亡。miR-15和miR-16可通过靶向调节抗凋亡基因Bcl-2促进细胞凋亡[29， 30]。miR-29可以通过靶向Bcl-2家族成员Mcl-1基因促进细胞凋亡[31]。除此之外，miR-23a也被证实可促进颗粒细胞的凋亡[32]。与这些miRNAs作用相反，miR-21、miR-17-5p以及miR-20a等具有抗凋亡作用[33， 34]。在小鼠卵泡发育过程中，miR-383和miR-320可通过不同的靶基因对颗粒细胞的增殖和激素分泌进行调控[35]。林飞[36]检测了猪卵泡闭锁过程中的miRNAs，在卵泡闭锁过程中鉴定出近200种差异表达的miRNAs，并认为let-7a、miR-26b等可能在细胞凋亡通路中起调控作用。刘吉英[37]的研究结果也证实，miR-26b可靶向Smad4调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。但到目前为止关于miRNA在家禽卵泡闭锁中的研究还较少。

    5 营养因素对家禽卵泡闭锁的影响

    刘立文等[38]试验发现，低能量日粮组和高能量日粮组饲喂的柴鸡卵巢中，FSHR和LHR的mRNA表达水平呈极显著差异，并认为日粮能量可通过下丘脑-垂体-性腺轴对其生殖机能产生影响。张弘馨等研究发现，体外无血清培养的种母鸡颗粒细胞中，维生素E的添加可以降低颗粒细胞的凋亡率[39]。研究饲粮中不同营养成分对家禽卵泡闭锁的影响，对提高家禽产蛋性能具有重要的指导意义。

    6 家禽卵泡闭锁的意义

    家禽产蛋期卵巢中有大小不等的卵泡，以及等级排列的成熟卵泡。卵泡的闭锁是家禽繁殖过程中的重要生理现象，能够清除受损和减数分裂异常的细胞，有效防止机体对非优势卵泡营养和能量的供给，对保证优势卵泡发育具有重要意义。外界环境改变、优势卵泡选择、不同品种家禽的产蛋习惯等都会影响卵泡闭锁。家禽卵泡闭锁的调节机制作为一个多种因素参与的复杂过程，至今尚须深入的研究探讨。

    研究家禽卵泡闭锁的机制，将有助于家禽繁殖性能提高。为在养殖生产中通过育种手段进行低产基因筛选，及促繁殖添加剂的开发提供更有力的理论依据。

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