以MIL－101为基底的核壳型氯霉素分子印迹聚合物的制备及应用

    于亭亭　苏立强　兰志满　李国武　韩爽　秦世丽　张维冰

    

    

    

    摘 要 以合成的金属有机框架材料MIL-101为基底， 氯霉素（CAP）为模板分子， 采用溶胶凝胶法， 制备核壳型CAP分子印迹聚合物（MIL-101@MIP）。通过X射线衍射光谱（XRD）、傅里叶红外光谱（FTIR）、扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）对MIL-101与MIL-101@MIP的结构和形貌进行了表征。结果表明， MIL-101为规整八面体结构， 在其表面覆盖了有序、多孔的印迹聚合物壳层。测试了分子印迹聚合物的静态、动态和选择性吸附性能。MIL-101@MIP对CAP的最大吸附量为66.56 mg/g，? 22.5 min达到吸附平衡， 且对CAP有较高的特异识别能力。将其作为固相萃取填料， 结合HPLC法， 对水产品中的CAP进行分析， 加标回收率为75.0%～103.7%， 相对标准偏差为1.2%～3.9%（n=5）。

    关键词 分子印迹; MIL-101; 氯霉素; 固相萃取

    1 引 言

    氯霉素（CAP）是一种抗生素， 广泛用于治疗各种敏感菌感染， 在水产养殖中， CAP被认为是对弧菌具有最强抑制的药物之一[1]。然而， CAP对肝脏有严重的不良影响， 食用CAP超标的食品会对人体健康造成危害。联合国粮农组织和世界卫生组织规定在动物性食品中不得检出CAP。中华人民共和国农业农村部公告第250号规定， 食品动物中禁止使用CAP及其盐、酯[2]。但是，由于CAP价格低廉、 抗菌效果好， 不法商家为了增大效益， 在水产品养殖的过程中仍违法使用。因此， 对于CAP的灵敏、准确检测十分重要[3]。

    目前，检测CAP的国标方法为气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法[4]， 也有文献报道使用液相色谱法[5，6]。CAP的检测过程多采用固相萃取对样品进行前处理， 但传统的固相萃取材料缺乏选择性， 富集效率低; 采用分子印迹技术[7～9]制备的分子印迹聚合物具有高选择性， 将其作为固相萃取填料可弥补传统材料选择性的不足。但是， 采用常规方法制备的分子印迹聚合物存在吸附量低、 吸附速率慢等问题。

    金属有机框架（MOF）材料[10～12]是一种新型杂化材料， 具有比表面积高、孔隙率大、热稳定性好、吸附能力高等优点， 在生物医学、催化活性、吸附分离等方面有着广阔的应用前景。将MOF材料与分子印迹技术结合， 制备MOF基底分子印迹聚合物， 二者优势互补， 可以提高分子印迹聚合物的吸附速度、吸附量等。Liang等[13]制备了拟除虫菊酯金属有机骨架-分子印迹聚合物， 最大吸附量为474.56 mg/g， 可在20 min内达到吸附平衡， 将其作为固相萃取材料， 与GC-MS/MS联用， 可快速、准确的检测小麦中的拟除虫菊酯。

    MIL-101是研究较多、较成熟的MOF材料[14，15]。与传统的SiO2等基体相比， MIL-101作为载体， 不仅具有优异的水热稳定性， 而且材料结构规整、比表面积大， 可提高材料的吸附容量， 有效改善吸附与解吸速率。Li等[16]以MIL-101为载体， 在其表面制备分子印迹聚合物， 对模板分子的吸附量为47.6 mg/g， 60 min即可达到吸附平衡， 与常规的本体法相比[17]， 时间缩短一半， 吸附量增大2.6倍， Wang等[18]制备了一种基于NH2-MIL-101的分子印迹聚合物， 该材料吸附模板在30 min即可达到平衡， 将其作为固相微萃取的吸附剂， 用于尿液中双氯芬酸钠的富集， 效果良好。龚梦婷等[19]以MIL-101为载体， 制备了一种对吗啉具备高选择性能的印迹材料， 对吗啉的静态吸附量高达183.3 mg/g， 将其用于水果粗提物中吗啉的固相萃取， 具有较高的富集效能， 且可多次重复使用。目前， 以CAP为模板分子， MOF材料与分子印迹技术结合的研究未见报道。

    本研究以CAP为模板分子， 无氟法制备的MIL-101作为基底， 通过溶胶凝胶法在其表面包覆分子印迹聚合物层， 制备核壳型CAP分子印迹聚合物。此材料对CAP具有较大的吸附量和快速的平衡吸附， 将其作为固相萃取填料， 结合HPLC对水产品中的CAP进行分离与检测， 结果令人满意。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    LPG 3400液相色谱仪（美国戴安公司）; D/Max-IIIC型X射线衍射仪（XRD， 日本理学公司）; S470型扫描电子显微镜（SEM）、H-7650透射电子显微镜（TEM）（日本日立公司）。

    Cr（NO3）3·9H2O、对苯二甲酸（H2BDC）、甲砜霉素（TAP）、氟甲砜霉素（FF）、CAP（阿拉丁试剂公司）; 醋酸、3-氨丙基三乙氧基硅烷（ATPES）、正硅酸乙酯（TEOS）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、HNO3（天津科密欧化学试剂开发中心）。所用试剂均为分析纯。实验用贝类、鱼、虾均购自当地超市。

    2.2 无氟法制备MIL-101

    参照文献[20]方法并稍加改进制备MIL-101。将4 g（10 mmol）Cr（NO3）3·9H2O和1.66 g（10 mmol）H2BDC加入48 mL去离子水中， 搅拌30 min使混合均匀， 加入0.625 mL（10 mmol）HNO3， 转移至反应釜， 在220℃下反应8 h。反应完成后， 冷却至室温， 离心分离， 用热的去离子水洗涤3次， 在80℃的DMF中搅拌10 h， 并在80℃以乙醇为洗脱液， 采用索式提取纯化， 80℃真空干燥。

    2.3 分子印迹聚合物的制备

    将150 mg MIL-101分散在30 mL乙醇中， 加入模板分子CAP 0.3230 g（1 mmol）、功能单体ATPES 1.87 mL（8 mmol）， 搅拌1 h， 使其充分接触。加入交联剂TEOS 5.38 mL、引发剂醋酸 1 mL（1 mol/L）， 在60℃的条件下回流20 h， 保持高速持续搅拌。反应结束后， 离心分离， 用乙醇洗涤3次， 80℃真空干燥。通过索式提取洗脱聚合物， 洗脱液为甲醇-乙酸（9∶1， V/V）， 制得以MIL-101為基底的分子印迹聚合物（MIL-101@MIP）。以相同的方法制备非印迹聚合物， 在制备的过程中不加模板分子， 制得以MIL-101为基底的非印迹聚合物（MIL-101@NIP）。

    在不加MIL-101的条件下， 采用相同的方法制备分子印迹聚合物（MIP）与非印迹聚合物（NIP）。

    2.4 静态和动态吸附实验

    称取MIL-101@MIP、MIL-101@NIP、MIP和NIP各5 mg若干份， 分别加入到2.5～30 μg/mL的系列CAP溶液中， 静置吸附一段时间， 取适量上清液， 经滤膜过滤后， 测定并计算吸附量。分别称取MIL-101@MIP、MIL-101@NIP、MIP和NIP各5 mg， 加入到20 μg/mL CAP溶液中。在一定时间间隔内， 取适量上清液， 经滤膜过滤后， 测定并计算吸附量。

    2.5 选择性吸附和重复性实验

    取20 mL 20 μg/mL CAP溶液、TAP溶液、FF溶液各两份， 分别加入5 mg MIL-101@MIP和MIL-101@NIP， 静置吸附一段时间， 测定并计算吸附量。

    称取5 mg MIL-101@MIP， 加入20 mL 20 μg/mL CAP溶液中， 静置吸附一段时间， 取适量上清液， 过滤膜后， 测定并计算吸附量。采取2.3节的方法洗脱聚合物后再次进行吸附， 重复此步骤7次， 计算方法的重复性。

    2.6 水产品中CAP的测定

    2.6.1 样品前处理 贝类取可食部分， 分别切块捣碎匀浆。称取5 g， 分两次向其中加入共计40 mL乙酸乙酯， 振荡5 min后离心， 取上清液， 合并两次上清液， 蒸干。加入1 mL甲醇、25 mL 4% NaCl溶液， 振荡1 min， 加入15 mL正己烷， 充分混合后离心， 除去上层油相， 向水相中再次加入15 mL正己烷， 重复提取1次。鱼、虾样品的处理方法同上。

    2.6.2 固相萃取 取100 mg MIL-101@MIP装入3 mL SPE空柱管中， 两侧放置筛板固定， 制备分子印迹固相萃取（MISPE）小柱用5 mL水和10 mL甲醇活化， 吸取3 mL待测液， 以0.4 mL/min的流速上样， 用5 mL水淋洗， 用4 mL冰乙酸-甲醇溶液 （1∶9， V/V） 洗脱吸附在小柱上的CAP， 收集洗脱液， 氮气吹干， 加入流动相溶解， 过滤膜后， 进行HPLC测定。C18柱（250 mg/3 mL， 博纳艾杰尔科技）固相萃取步骤同上。

    2.6.3 色谱条件 Hypersil ODS2色谱柱 （200 mm×4.6 mm， 5 μm， 戴安公司），流动相为乙腈-水（1∶1， V/V）， 流速1.0 mL/min，检测波长272 nm， 进样量20 μL。

    3 结果与讨论

    3.1 MOF材料的表征

    3.1.1 MOF材料XRD分析 对所制备的MIL-101进行XRD表征， 结果如图1所示， 在2θ为2.78°、3.28°、5.11°、8.43°和9.02°处出现5个明显衍射峰， 分别对应于MIL-101的（311）、（511）、（531）、（882）和（911）晶面衍射， 与文献[20]一致， 表明合成的材料符合MIL-101的晶体结构。

    3.1.2 MOF材料的红外光谱表征 图2为制备的MIL-101和MIL-101@MIP的红外谱图。3400 cm-1处的特征峰为羟基的特征峰， 1400和1591 cm-1为OCO的伸缩振动峰， 1508 cm-1为CC伸缩振动峰。578 cm-1处的特征峰是由于CrO伸缩振动， 表明铬离子金属簇与H2BDC的羧基的成功连接， 说明成功制备了MIL-101， 与文献[21]一致。与MIL-101的红外光谱相比， MIL-101@MIP中在792和1075 cm-1处出现单体ATPES和交联剂TEOS水解缩合所产生的Si-O-Si的特征吸收峰， 表明MIL-101的表面成功包覆了一层分子印迹聚合物。

    3.1.3 MOF材料的电镜表征 图3A和3C为MIL-101的TEM和SEM图， 可见MIL-101為规整的八面体结构， 分散性良好， 表面较平整光滑， 粒径在300～500 nm之间， 分布均匀。图3B和3D为MIL-101@MIP的TEM和SEM图， 与MIL-101相比， 粒径增大， 在400～600 nm之间， 在MIL-101表面包覆了分子印迹聚合物， 形成了结构疏松、有序、多孔的聚合物壳层。表面形态的这种变化， 有利于目标物吸附和介质快速传输。

    3.2 聚合物的吸附性能

    为考察聚合物的吸附性能， 对MIP、NIP、MIL-101@MIP和MIL-101@NIP进行了静态吸附实验和动态吸附实验。由图4可见， 两种印迹聚合物的吸附量明显高于两种非印迹聚合物， 这是由于印迹聚合物内部存在与模板分子相匹配的印迹孔穴， 可对目标物进行特异性吸附， 这是分子印迹的特点决定的。引入MOF材料制备的印迹聚合物MIL-101@MIP的吸附量为65.56 mg/g， 明显高于未加入MOF材料制备的MIP的吸附量（43.72 mg/g）， 一方面， 由于MIL-101的高比表面积和有序的孔径增大了MIL-101@MIP对CAP的吸附能力; 另一方面， MIL-101中的不饱和金属位点对CAP结构中的含氮基团具有亲和力， 也增强了MIL-101@MIP与模板分子的结合能力。两种非印迹聚合物的吸附量均较小， 且差别不大， 是由于没有印迹孔穴， 因此吸附量也较低。

    MIL-101@MIP在22.5 min即达到吸附平衡， 而MIP达到吸附平衡时间为75 min。高比表面积材料MIL-101的引入使得吸附平衡时间明显缩短， 快速达到吸附平衡， 有利于吸附材料的实际应用。

    3.3 选择性吸附

    以TAP和FF作为CAP的结构类似物进行选择性吸附实验， 并计算印迹因子和分配系数， 结果见图5和表1。由图5可见， MIL-101@MIP对CAP的吸附量为65.56 mg/g， 明显大于对其类似物的吸附量29.73和26.35 mg/g， 主要原因是印迹聚合物内部有与CAP相匹配的印迹孔穴， 可对CAP进行特异性吸附。TAP和FF虽与CAP具有相似的分子结构， 但与聚合物内部的识别位点不完全匹配， 所以吸附量较小。非印迹聚合物对3种底物的吸附量均较小， 并且无明显差别， 是因为非印迹聚合物中没有与之匹配的印迹孔穴， 无选择性吸附。由表1可知， 聚合物对CAP的印迹因子为3.77（对于TAP、FF为1.69、1.53）， 分配系数为18.16 mL/g（对于TAP和FF为2.36和1.96）， 均远高于结构类似物， 这是由于MIL-101@MIP对CAP有较高的选择性。

    3.4 重复性实验

    合成的MIL-101@MIP材料的多次吸附-解吸附实验结果如图6所示， 随着使用次数增加， 吸附量略降， 使用7次后， 吸附量由65.52 mg/g降至59.85 mg/g， 降低了9.13%， 仍具有较高的吸附能力， MIL-101@MIP具有较稳定的刚性结构， 在反复吸附洗脱的过程中， 吸附位点损失较少， 具有良好的重复使用性能。

    3.5 CAP分析方法的建立

    将MISPE与HPLC法结合， 建立测定CAP的分析方法。采用不同浓度的CAP标准溶液， 进行色谱分析， 平行进样5次。以CAP浓度为横坐标， 色谱峰面积为纵坐标， 绘制标准曲线。结果表明， 在所考察范围内， CAP浓度（C）与色谱峰面积（A）有良好的线性关系， 线性回归方程A=152.65C+5.2673， 线性相关系数R2=0.9997， 检出限为0.08 μg/L（S/N=3）， 定量限为0.25 μg/L （S/N=10）。

    3.6 实际样品分析

    以制备的印迹聚合物作为固相萃取填料， 制备MISPE小柱， 使用C18柱和MISPE小柱分别对贝类、鱼、虾样品进行固相萃取处理， 并对上样流速和洗脱液用量进行了优化（图7）。在优化的条件下， 进行HPLC分析， 3种样品中均未检出CAP。 对样品进行加标处理后再进行分析， 结果见表2， 在0.08、0.16和0.80 μg/L的添加水平下， 测得不同样品基质中CAP的回收率在75.0%～103.7%范围内， 相对标准偏差（RSD）小于1.2%～3.9%。

    贝类样品固相萃取前后色谱图如图8所示， C18柱和MISPE小柱均有较好的富集能力， 与C18柱相比， MISPE小柱对CAP的选择富集效果更好， 这是由于C18可同时吸附CAP和其它物质， 而MISPE小柱有与CAP的结构有较高匹配度的结合位点， 对CAP特异性吸附， 故富集效果更好， 去杂质能力更强。

    4 结 论

    以MOF材料MIL-101为基底， 制备了核壳型CAP分子印迹聚合物。制备的聚合物吸附速度快、吸附量较大， 具有良好的CAP特异吸附性能。以此聚合物为固相萃取的填料， 能够选择性富集水产品中的CAP， 为CAP等兽药的分离富集提供了一种有效的方法。

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    Preparation and Application of Core-shell Chloramphenicol

    Molecularly Imprinted Polymer Based on MIL-101

    YU Ting-Ting1， SU Li-Qiang*1， LAN Zhi-Man1， LI Guo-Wu1，

    HAN Shuang1， QIN Shi-Li1， ZHANG Wei-Bing*2

    1（College of Chemistry and Chemical Engineering， Qiqihar University， Qiqihar 161006， China）

    2（Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry，

    East China University of Science and Technology， Shanghai 200237， China）

    Abstract Core-shell chloramphenicol （CAP） molecularly imprinted polymer was prepared by sol-gel method with chloramphenicol as template molecule and metal-organic framework material MIL-101 as substrate. The structure and morphology of MIL-101 and molecularly imprinted polymer were characterized by X-ray diffraction （XRD）， Fourier transform infrared spectrum （FTIR）， scanning electron microscope （SEM） and transmission electron microscope （TEM）. The results showed that MIL-101 had a regular octahedral structure， and the surface was covered with ordered and porous imprinted polymers. The kinetics and selective adsorption properties of molecularly imprinted polymers were tested. The maximum adsorption capacity of the imprinted polymer was 66.56 mg/g， and the adsorption equilibrium reached within 22.5 min. The imprinted polymer had high selective recognition ability to chloramphenicol. The molecularly imprinted polymers were used as solid phase extraction filler for analysis of chloramphenicol in aquatic products by HPLC method， with recoveries of 75.0%-103.7% and relative standard deviations of 1.2%-3.9% （n=5）.

    Keywords Molecular imprinting; MIL-101; Chloramphenicol; Solid phase extraction

    （Received 4 August 2020; accepted 10 October 2020）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 21974045） and the Research Project of Education Department of Heilongjiang Province （No.135409305）.

    2020-08-04收稿; 2020-10-10接受

    本文系国家自然科学基金项目（No.21974045）和黑龙江省教育厅科研项目（No.135409305）资助

    * E-mail： slq202@163.com; weibingzhang@ecust.edu.cn