网站首页  词典首页

请输入您要查询的论文:

 

标题 基于血液微透析技术探究五味子甲素的体内代谢过程
范文 诸明娜 徐瑞鑫



摘要:目的 建立高效液相色谱法测定大鼠血浆中五味子甲素的方法,探讨五味子甲素在大鼠血中的代谢过程。方法 采用血液微透析技术,将探针由右侧颈静脉植入大鼠右心房膨大处,透析取样。透析液检测的色谱条件为:以甲醇-乙腈-水(40∶35∶25)为流动相,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,UV检测波长254 nm。经体内测定探针的回收率校正后,绘制药时曲线,采用DAS2.0软件计算五味子甲素灌胃给药后在大鼠血液中的药动学参数。结果 五味子甲素在2~500 μg/mL浓度范围内线性关系良好(r=0.999 5),日内精密度和日间精密度均RSD<3%,五味子甲素的含药透析液室温放置12 h内稳定性良好。药动学参数ke为(0.364±0.047)/h,t1/2为(1.637±0.302)h,Tmax为(0.612±0.194)h,Cmax为(165.92±28.830)μg/mL,AUC0-t为(240.793±25.540)μg·h/mL,AUC0-∞为(282.710±30.727)μg·h/mL。结论 本方法操作便捷、液相保留时间短,能满足透析液中五味子甲素含量测定的需要,可用于五味子甲素在大鼠血液中代谢过程的研究。
关键词:血液微透析;五味子甲素;高效液相色谱法;药时曲线
DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.025
中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2016)06-0099-04
Abstract: Objective To establish an HPLC method for evaluating deoxyschizandrin in rat plasma; To explore deoxyschizandrin metabolic processes in blood. Methods The blood microdialysis probe was implanted into the right atrial enlargement through right jugular vein to detect the concentration of deoxyschizandrin in blood. Chromatographic conditions for detecting of dialysis fluid were as follows: mobile phase was methanol-acetonitrile- water (40:35:25); flow rate was 1 mL/min; column temperature was 30 ℃; UV detection wavelength was 254 nm. The data obtained after being calculated by the recovery rate of the probe in vivo were dealt with DAS 2.0 software. Pharmacokinetic parameters were calculated, and the concentration-time related curves were plotted. Results The deoxyschizandrin curve was linear (r=0.999 5) within the range of 2–500 μg/mL. The RSD of intra-day pecision and inter-day pecision were both <3%. The stability of the solution was good in 12 hours at roomtemperature. ke was (0.364±0.047)/h; t1/2 was (1.637±0.302)h; Tmax was (0.612±0.194)h; Cmax was (165.92±28.830) μg/mL; AUC0-t was (240.793±25.540) μg·h/mL; AUC0-∞ was (282.710±30.727) μg·h/mL. Conclusion The method is convenient to perform, and the retention time of HPLC is short. This method is suitable for detecting the content of deoxyschizandrin in dialysis fluid, which can also be used to investigate the metabolic processes of deoxyschizandrin in the rat blood.
Key words: microdialysis; deoxyschizandrin; HPLC; concentration-time curve
微透析技术是近年来发展起来的一种新型的生物在体采样技术,在组织或者血管中植入具有半透膜的探针,小分子物质可以随着浓度梯度通过半透膜,而分子量较大的物质如蛋白等则不能自由通过半透膜。采用微量灌流泵使一定量的灌流液流经探针,即可在收集装置中定量检测所测物质的含量。微透析技术最早用于测定实验动物脑内神经递质的含量[1],目前,该技术已成为研究各种动物脑内神经递质变化所不可缺少的方法之一。由于微透析技术可从实验动物血液中连续动态取样,而且所采集的样本都是小分子物质,无需除去血清中蛋白的纯化过程,可以直接采用高效液相色谱法(HPLC)进行检测,大大提高了实验操作的便利性[2],因此近年来其在药动学领域的应用越来越广泛[3-4]。
五味子是多年生木兰科植物,具有收敛固涩、补肾宁心、益气生津的功效。现代药理学研究表明,五味子可作用于机体多个系统,如中枢神经系统、心血管系统和免疫系统等[5],尤其是在保护肝损伤[6]和抗氧化[7]方面具有非常显著的疗效。五味子甲素是中药五味子中的木脂素类成分之一,具有诱导肝微粒体细胞色素P450酶活性进而增强肝脏的解毒功能、降低血清转氨酶、阻断多种毒性物质对肝细胞膜的损伤等作用。中药的药效物质基础研究是中药现代化的重点和核心内容,本研究采用微透析技术对五味子中主要药效成分之一五味子甲素在大鼠体内的代谢过程进行研究,以期初步阐明五味子甲素在血液中的代谢特点,为五味子制剂在临床的更广泛应用提供依据。
1 仪器、试药与动物
e2695高效液相色谱仪(Waters公司),2998UV二极管阵列检测器,kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,大连依利特分析仪器有限公司),CMA402透析液灌流泵(瑞典CMA公司),微透析探针(shaft:5 cm,cut off:15 kD,瑞典MAB公司)。
五味子甲素,成都科普生物有限公司,HPLC测定纯度>98%,批号110857-201311。吐温-80,化学纯,天津市东丽区天大化学试剂厂;甲醇,HPLC级,美国迪马试剂公司;氯化钠,分析纯,天津市红岩化学试剂厂;氯化钾,分析纯,天津市东丽区天大化学试剂厂;硫酸镁,分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司;纯净水,Millipore water purification systems 制备;氯化钙,分析纯,天津市基准化学试剂有限公司;磷酸二氢钾,分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司;碳酸氢钠,分析纯,齐齐哈尔市华侨化工厂。
清洁级雄性Wistar大鼠6只,体质量(250±20)g,购自南京医科大学动物实验中心,许可证号SYXK(苏)2002-0013。实验前在本实验室条件下单笼饲养1周,以适应环境,减少应激对实验结果的影响,温度20~22 ℃,相对湿度45%~65%。
2 方法与结果
2.1 微透析取样方法的建立
2.1.1 透析液的配制 采用Ringer's Solution作为透析液[8],包括0.4 mmol/L KH2PO4、3.0 mmol/L KCl、25.0 mmol/L NaHCO3、1.2 mmol/L CaCl、1.2 mmol/L MgSO4、122.0 mmol/L NaCl,另加入1%吐温-80,混悬后超声震荡20 min使其形成均一稳定的溶液。透析液均为每次使用前现配。
2.1.2 微透析探针的植入 10%乌拉坦溶液(10 mL/kg)麻醉大鼠,仰位固定于手术台上,剪开颈部皮毛,钝性剥离右侧颈静脉,远心端结扎,采用眼科剪刀在静脉血管处开一小口,将含有保护套管的微透析探针经由颈静脉植入大鼠右心房膨大处[9](上腔静脉与下腔静脉汇合位置,距离颈外静脉和颈内静脉汇合处约3.3~3.5 cm),用非吸附性手术线固定,防止探针脱位。整个植入过程中用吐温-80润滑保护套管,以保证探针顺利植入。
2.2 五味子甲素测定方法
2.2.1 色谱条件 参考文献[10-12]中五味子甲素的HPLC检测方法,并结合本试验中透析液的特性,对检测条件进行适当优化。最终确定色谱条件如下:流动相为甲醇-乙腈-水(40∶35∶25),流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,UV检测波长254 nm。
2.2.2 对照品储备液的制备 精密称取五味子甲素对照品1.0 mg,溶解在2 mL透析液中,配制成浓度为0.5 mg/mL的对照品储备液。
2.2.3 专属性考察 分别进样五味子甲素对照品储备液、空白透析液和大鼠给药后血液透析液各10 μL,按“2.2.1”项下色谱条件进行检测,考察该色谱条件的专属性。五味子甲素对照品、空白透析液和大鼠给药后血液透析液的高效液相色谱图见图1,五味子甲素的保留时间约为9.8 min,五味子甲素峰与周围杂质峰能够达到基线分离,且峰形良好,透析液中其他成分对信号峰无干扰。
2.2.4 标准曲线的制备 取对照品储备液适量用空白透析液进行梯度稀释,得到系列浓度梯度的对照品透析液,即500、200、100、20、2 μg/mL。按“2.2.1”项下色谱条件进样分析,进样量为10 μL,以峰面积对五味子甲素浓度做线性回归,制备标准曲线,回归方程为Y=4781.0X+18 697.1,r=0.999 5,表明五味子甲素在2~500 μg/mL浓度范围内线性关系良好。
2.2.5 日内精密度和日间精密度考察 取浓度分别为500、200、20 μg/mL的五味子甲素透析液,按“2.2.1”项下色谱条件在同日内连续5次进样分析,进样量为10 μL,分别测定3个浓度的日内精密度。将上述3个浓度的五味子甲素透析液连续5 d重复进样检测,进样量为10 μL,测定日间精密度。结果见表1。结果表明,无论日内精密度还是日间精密度,500、200、20 μg/mL五味子甲素峰面积RSD值均在0.58%~2.89%之间,符合定量检测的要求。
2.2.6 稳定性试验 取浓度分别为500、200、20 μg/mL的五味子甲素透析液,室温放置,按“2.2.1”项下色谱条件分别于2、4、6、8、12 h进样分析,进样量为10 μL,记录峰面积。结果表明500、200、20 μg/mL五味子甲素峰面积RSD值分别为0.62%、0.82%、1.34%,符合定量检测的要求,表明五味子甲素透析液室温放置12 h内稳定性良好。
2.3 五味子甲素药动学研究
2.3.1 样品采集与测定 打开透析液灌流泵(流速2 μL/min),用空白透析液灌流1 h后,灌胃给药五味子甲素20 mg/kg,灌胃后立即开启透析液自动收集装置,样品采集点分别为第5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、115、135、155、185、215、245 min,共连续收集16个样品。所得透析液样品按“2.2.1”项下色谱条件立即进样分析,进样量为10 μL,记录峰面积。
2.3.2 体内回收率测定 收集样品后,用空白透析液继续灌流2 h,然后换用已知浓度的五味子甲素透析液(浓度100 μg/mL)继续灌流,平衡1 h后,收集连续3个样品,收集间隔为10 min。收集样品按“2.2.1”项下色谱条件立即进样分析,进样量为10 μL,记录峰面积,测定探针在大鼠体内的回收率(R),计算公式R=(1-Cout/Cin)×100%[13]。个体血药浓度均经自身的体内回收率进行校正。个体实验结束后,处死大鼠,开胸检查探针半透膜植入的位置,位置不正确的个体数据不纳入统计。
2.3.3 药动学参数的计算 运用DAS2.0药动学软件进行统计分析,采用统计矩的方法计算各药动学参数,并以血药浓度对时间做药时曲线,结果见图2、表2。
3 讨论
血液微透析技术可在同一实验动物的不同组织中植入探针,进而同时连续动态地监测药物在多个组织的代谢过程,既降低了实验误差,又减少了实验动物的样本数。与传统的采静脉血测定方法相比,血液微透析的在体取样技术不减少动物体液含量,而且透过透析膜的小分子物质可直接进行液相检测,所测血药浓度更加准确。另外,采得的样本都是游离态药物,相对来说能更加准确反映有效成分的药物浓度[14]。
有研究表明,雄性大鼠细胞色素P3A1、P3A2、P3A18在微粒体内的含量分别为雌性大鼠的5、10、20倍以上,另外,雄性大鼠细胞色素P450酶的含量也较雌性大鼠高10%~30%[15],这也解释了与五味子甲素同为木脂素类成分的五味子醇甲在雌性大鼠体内代谢相对较慢的现象。为最大程度上减少实验动物性别因素对结果的影响,本研究全部采用Wistar品系雄性大鼠。
探针的植入位置对实验结果的影响较大[16]。在本研究的预实验中,曾考察过其他植入位置,如大鼠的颈静脉,但此处空间狭小且血流速度较慢,探针植入后阻碍颈静脉血液回流,并且极易造成凝血,致使探针透析膜堵塞。最终选用大鼠上下腔静脉汇合处作为探针植入处,此处接近大鼠的右心房,空间较大,将探针植入此处,虽然阻碍了一小部分上腔静脉血液的回流,但下腔静脉会提供充足的血流供透析采样。经过反复预试验的摸索,最后确定采用体质量250 g左右的大鼠、探针由颈静脉植入的深度在3.3~3.5 cm之间较为合适。
常用的测定微透析探针回收率的方法主要有体外测定和体内测定2种[17-18]。由于体内测定的环境、温度、pH值和血流速度等都与探针实际透析时一致,测定结果更加准确、客观。因此,本研究采用体内减量法测定探针的回收率。
本研究考察的是大鼠灌胃给药五味子甲素后在体内的代谢过程,在预实验中没有考察五味子甲素在大鼠体内是否符合线性药动学的特征,在药动学参数的计算过程中采用房室模型拟合是不合理的,因此,本研究采用统计矩的方法计算相关的药动学参数,该方法主要通过药时曲线下面积分析药物在体内的代谢过程,不受限于数学模型,适用于任何隔室模型,是非隔室分析法之一[19]。
五味子甲素在大鼠体内的药时曲线表明,大鼠灌胃五味子甲素后血药浓度迅速升高,约35 min后血药浓度达到峰值(165 μg/mL左右),随后迅速下降。由药动学参数可以看出,五味子甲素在大鼠体内的半衰期和滞留时间均较短,属于快速代谢型药物,这与以往文献报道的结果相似[20]。
参考文献:
[1] DELGADO J M, DEFEUDIS F V, ROTH R H, et al. Dialytrode for long termintracerebral perfusion in awake monkeys[J]. Arch Int Pharmacody Ther,1972,198(1):9-21.
[2] 张英丰,汪小根,吴阳,等.微透析技术进行药动学研究的发展趋势及局限性探讨[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(15):270-273.
[3] 单连菊,丁涵滢,王锐,等.关节微透析技术在药动学及药效学的研究进展[J].中国新药杂志,2015,24(10):1124-1127.
[4] 何治芬,张岩,汤湛,等.HPLC测定大鼠微透析液和血浆中苦参碱的浓度[J].中国现代应用药学,2014,32(12):1514-1519.
[5] 齐雁辉,赵彩玉.五味子的现代药理作用研究进展[J].中国医药指南, 2011,9(26):43-44.
[6] 高雁,李廷利.五味子有效成分的药理作用研究进展[J].中医药学报, 2011,39(6):104-106.
[7] 赵云,单安山,郭晓秋.五味子乙醇提取物对肉仔鸡抗氧化功能和血液生化指标的影响[J].安徽农业科学,2012,40(9):5268-5270.
[8] Lisa A H Rottb?ll, Christian Friis. Microdialysis as a tool for drug quantification in the bronchioles of anaesthetized pigs[J]. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology,2014,114(3):226-232.
[9] 张英丰.微透析法进行青藤碱贴剂透皮特性及药物动力学的研究[D].广州:广州中医药大学,2006.
[10] 史敏,林超,秦华.HPLC测定养肝片中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量[J].食品与药学,2014,16(6):433-435.
[11] 汪荣斌,王义祁,秦亚东,等.LC-UV法测定华中五味子中五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素含量[J].长春中医药大学学报,2014,30(2):213-215.
[12] 乔春凤,董仲生.高效液相色谱法测定抗风湿液中染料木苷、染料木素、去氢二异丁香酚、五味子甲素的含量[J].中南药学,2014,12(9):896-899.
[13] 左代英,吴英良,曹悦.微透析结合HPLC-ECD测定头抱他啶在大鼠血中含量及其药动学研究[J].中国药学杂志,2005,40(12):931-933.
[14] 魏凤环.微透析采样技术在药动学研究中的应用及意义[J].中药材, 2008,31(6):940-943.
[15] HEDLUND E, GUSTAFSSON J A, WARNER M. Cytochrome P450 in the brain:a review[J]. Curr Drug Metab,2001,2(3):245-263.
[16] 鄢欢,曹玲娟,李焕德.提高微透析探针回收率方法的研究进展[J].中南药学,2014,12(2):140-144.
[17] 吴丽颖,吕红博,张运好,等.替硝唑、达克罗宁和氯己定微透析探针体外回收率及大鼠体内稳定性的研究[J].药物分析杂志,2014,34(11):1942-1947.
[18] 王秀云,方俊聪,杨光,等.基于LC-MS/MS技术的罗库溴铵微透析探针回收率测定的方法学研究[J].第二军医大学学报,2015,36(4):396-401.
[19] 梁文权,李高,刘建平.生物药剂学与药物动力学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2000:272.
[20] 郭庆英,王振华,张长水,等.五柴颗粒中五味子甲素的小鼠血清药动学研究[J].时珍国医国药,2008,19(10):2487-2488.
(收稿日期:2015-07-10)
(修回日期:2015-08-03;编辑:陈静)
随便看

 

科学优质学术资源、百科知识分享平台,免费提供知识科普、生活经验分享、中外学术论文、各类范文、学术文献、教学资料、学术期刊、会议、报纸、杂志、工具书等各类资源检索、在线阅读和软件app下载服务。

 

Copyright © 2004-2023 puapp.net All Rights Reserved
更新时间:2025/3/11 23:38:21