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标题 新疆阿魏乙酸乙酯分离部位对HCT116细胞迁移和侵袭能力的影响
范文 罗福祥 卢军 张海英



摘要：目的 观察新疆阿魏乙酸乙酯分离部位对人结肠癌细胞HCT116迁移和侵袭能力的影响，探讨其相关作用机制。方法 将体外不同浓度阿魏乙酸乙酯分离部位作用于人结肠癌HCT116细胞24 h，CCK-8法检测细胞增殖，计算细胞生长抑制率和IC50，细胞划痕实验和Transwell小室实验观察HCT116细胞迁移和侵袭能力。结果 新疆阿魏组与顺铂组随着药物浓度的增加，OD值逐渐变小，抑制率呈药物浓度依赖性，新疆阿魏组IC50为43.98 μg/mL，顺铂组IC50为36.77 μg/mL。与空白组比较，经新疆阿魏树脂乙酸乙酯分离部位作用后，HCT116细胞迁移和侵袭能力明显减弱（P<0.01）。结论 新疆阿魏树脂乙酸乙酯分离部位对人结肠癌细胞HCT116的增殖、迁移和侵袭能力具有一定的抑制作用。
关键词：新疆阿魏；人结肠癌HCT116细胞；迁移；侵袭
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.017
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）12-0069-04
Effects of Separation Parts of Ethyl Acetate from Ferula Sinkiangensis Resin on Migration and Invasion of HCT116 Cells LUO Fu-xiang1， LU Jun2， ZHANG Hai-ying1，2 （1. School of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China； 2. Affiliated Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）
Abstract： Objective To investigate the effects of separation parts of ethyl acetate from Ferula sinkiangensis resin on migration and invasion of HCT116 cells. Methods In vitro separation parts of ethyl acetate from Ferula sinkiangensis resin with different concentrations were acted on human colon cancer HCT116 cells for 24 h. CCK-8 method was used to detect cell proliferation， calculate the cell growth inhibition rate and IC50. Method of scratches the legitimacy and Transwell room were used to observe HCT116 cell migration ability. Results With the increase of medicine concentration， OD value in Ferula sinkiangensis resin group and cisplatin group decreased gradually； inhibition ratio and medicine concentration were dependent； IC50 was 43.98 μg/mL in Ferula sinkiangensis resin group and 36.77 μg/mL in cisplatin group. Compared with control group， affected by separation parts of ethyl acetate from Ferula sinkiangensis resin， migration and invasion abilities of HCT116 cells were weakened significantly （P<0.01）. Conclusion Separation parts of ethyl acetate from Ferula sinkiangensis resin can reduce proliferation， migration and invasion abilities of HCT116 cells to some extent.
Key words： Ferula sinkiangensis resin； human colon cancer HCT116 cells； migration； invasion
结肠癌是胃肠道常见的恶性肿瘤，在我国死亡率较高。阿魏味苦、辛，性温，具有杀虫、散痞、消积的功效[1]。在维吾尔、哈萨克等民族民间常用于治疗虫积腹痛、腹中痞块、肉食积滞等。现代药理研究发现，阿魏提取物倍半萜香豆素类化合物具有抗病毒、抗血管新生、抗氧化、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤
基金项目：国家自然科学基金（81260625）
通讯作者：张海英，E-mail：1030737878@qq.com
细胞凋亡的作用[2-3]。前期研究显示，新疆阿魏乙酸乙酯分离部位对人结肠癌HCT116细胞增殖具有较强的抑制作用及促进细胞凋亡的作用[4]。本实验通过细胞划痕实验和Transwell小室实验观察新疆阿魏对结肠癌HCT116细胞迁移及侵袭能力的影响，探讨其相关作用机制。
1 材料与方法
1.1 细胞株和药物
人结肠癌HCT116细胞株，中国科学院上海细胞所。新疆阿魏，产地新疆伊犁，经新疆自治区中医院李永和主任药师鉴定为伞形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis K. M. Shen的树脂，新疆伊犁阿萨克自治州药检所检验，批号2012001。
1.2 主要试剂与仪器
DMEM高糖培养液（批号AZG190856）、胎牛血清（批号F120121）、青链霉素混合液（批号SV30010）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（批号SH3004201）、PBS（批号AZE189217），美国Hyclone公司；DMSO（批号67685TT），美国Sigma公司；Cell Counting Kit-8（批号10A01A60），武汉博士德生物公司；Transwell小室（批号2500655），美国密理博公司。超净工作台（中国上海智诚ZHJH-C1112B），酶标仪（美国Thermo公司），CO2培养箱（美国Thermo公司），倒置荧光研究级三目显微镜（IX71-12FL/PH），移液器（德国Eppendorf公司）。
1.3 新疆阿魏乙酸乙酯部位分离
新疆阿魏400 g，研碎成颗粒状，用2000 mL石油醚（30～60 ℃）超声提取40 min，温度小于40 ℃，相同方法提取3次，过滤，浓缩。60 ℃干燥，至无气泡产生，即得石油醚部位。上述残渣再用95%乙醇2000 mL相同方法提取1次，过滤，合并提取液，减压浓缩。浓缩的膏液用硅藻土拌样分散均匀后，依次用乙酸乙酯、正丁醇、无水甲醇超声萃取5 min，滤过，滤液浓缩干燥，即得乙酸乙酯、正丁醇、甲醇分离部位。
1.4 CCK-8法检测HCT116细胞增殖抑制率
收集处于生长对数期的HCT116细胞，计数，调整其浓度为1×105个/mL。取96孔板，每孔加入细胞混悬液100 μL，150 μL无菌PBS填充边缘孔，常规培养48 h。取新疆阿魏乙酸乙酯分离部位，无菌DMSO助溶后用培养液逐级稀释成100、50、25、12.5、6.25 μg/mL 5个浓度。弃去孔中原有培养液，给药组加入含不同药物浓度的完全培养液200 μL。每组设6个复孔。阳性药顺铂用培养液稀释成100、50、25、12.5、6.25 μg/mL 5个浓度，每孔200 μL。将96孔板继续放入培养箱中常规培养24 h，并在此前设置空白组、对照组。药物作用24 h后观察细胞生长情况并记录。弃去96孔板中上清液，将CCK-8反应溶液配成终浓度为10%DMEM培养液，每孔加入100 μL，置于CO2培养箱孵育1 h。于酶标仪波长450 nm处测定OD值。实验重复3次，取其平均值，计算细胞增殖抑制率[（OD值对照组-OD值给药组）÷（OD值对照组-OD值空白组）×100%]。根据各浓度抑制率，采用Graphpad Prism5软件计算IC50。求出3次实验各浓度的抑制率与IC50，以平均值作为最终结果。
1.5 细胞划痕实验
收集对数生长期HCT116细胞，常规消化，计数为1×105个/mL的细胞混悬液。6孔板中每孔加2 mL细胞混悬液常规培养，直至细胞铺满单层约80%，用10 μL无菌移液枪枪头垂直于底面的培养板底部呈“一”字形轻轻划痕，每孔3条。弃上清液，用培养液清洗划下细胞。用完全培养液稀释DMSO助溶的新疆阿魏乙酸乙酯分离部位至12.5、6.25 μg/mL 2个浓度，阳性对照药顺铂稀释至12.5、6.25 μg/mL 2个浓度，6孔板中分别每孔加2 mL，同时设空白组。常规培养，镜下拍照，记录0、24、48 h划痕距离。实验重复3次，记录结果，计算细胞迁移率[（划痕时两侧距离-检测时距离）÷划痕时两侧距离×100%]。
1.6 Transwell小室实验
迁移实验分组、给药同“1.5”项。Transwell小室24孔板上层加50 μL无血清DMEM高糖培养基，于培养箱中孵育30 min弃去上清液。药物作用48 h后将6孔板中上清液弃去，常规消化、离心，分别以无血清的DMEM培养基稀释，计数，调整其浓度为3×105个/mL细胞混悬液，分别加至Transwell小室上层，每孔200 μL，小室下层加600 μL含10%FBS的DMEM高糖养液，常规培养。48 h后，弃去小室上、下层液，4%多聚甲醛固定细胞30 min后取出小室，PBS清洗2次后染色。30 min后取出小室，PBS再次清洗，用棉签拭去小室上层细胞，镜下观察小室上层细胞是否全部拭去，小室晾干后进行拍照。显微镜每孔选取5个视野200目拍照后统计穿膜细胞数，计算细胞迁移抑制率[（空白组穿膜细胞数-给药组穿膜细胞数）÷空白组穿膜细胞数×100%]。
侵袭实验分组、给药同“1.5”项。药物作用48 h后，活化小室同Transwell小室迁移实验。将6孔板中上清液弃去，常规消化、离心，分别以无血清的DMEM培养基稀释，细胞计数板分别计数制成1×106个/mL的细胞混悬液，分别加至Transwell小室上层。每孔200 μL，小室下层加600 μL完全培养液，常规培养72 h，染色，统计穿膜细胞数，计算侵袭抑制率[（空白组穿膜细胞数-给药组穿膜细胞数）÷空白组穿膜细胞数×100%]。
1.7 统计学方法
采用Statistics17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 新疆阿魏乙酸乙酯分离部位对HCT116细胞增殖的影响
新疆阿魏组与顺铂组随着药物浓度的增加，OD值逐渐变小，抑制率呈药物浓度依赖性。新疆阿魏组IC50为43.98 μg/mL。顺铂组IC50为36.77 μg/mL。结果见表1。
2.2 新疆阿魏乙酸乙酯分离部位对结肠癌HCT116细胞愈合的影响
细胞划痕实验显示，一定浓度新疆阿魏乙酸乙酯分离部位能降低人结肠癌细胞HCT116的划痕愈合速度。与空白组比较，各给药组HCT116细胞迁移率明显降低，除24 h顺铂6.25 μg/mL组外，差异均有统计学意义（P<0.01）。结果见表2、图1。
2.3 新疆阿魏乙酸乙酯分离部位对HCT116细胞迁移能力的影响
药物作用48 h后，进行Transwell小室迁移实验。与空白组比较，各给药组HCT116细胞穿膜数明显降低（P<0.01）。结果见表3、图2。
2.4 新疆阿魏乙酸乙酯分离部位对HCT116细胞侵袭能力的影响
药物作用48 h后，进行Transwell小室侵袭实验。与空白组比较，各给药组HCT116细胞穿膜细胞数明显降低（P<0.01）。结果见表4、图3。
3 讨论
阿魏属植物含有许多生物活性物质，如单糖、含硫衍生物、香豆素、香豆素类、倍半萜、倍半萜内酯和胡萝卜烷酯等[5-7]。本课题组前期体内外实验显示，阿魏属植物提取物在抗肿瘤、降脂、抗氧化等方面均取得有益的研究成果[8-10]，其具有较大的开发价值。
细胞迁移是细胞接收到迁移信号或感受到趋化物质后产生的移动，由伪足的形成和延伸、新的黏附位点建立、细胞收缩和尾部退缩4个循环步骤组成，通过重复4个过程向前迁移[11]。有学者研究发现，细胞迁移中引领细胞的出现往往预示着肿瘤细胞迁移浸润的开始。引领细胞具有特殊的分子表型，相较于跟进细胞具有更活跃的迁移表型和更强的迁移动力[11-12]。
本研究观察了新疆阿魏乙酸乙酯部位对人结肠癌HCT116细胞增殖的影响，筛选药物最适浓度，以细胞划痕实验对细胞迁移实验做出初步探讨，确定合适的药物浓度、正常的细胞形态。以Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭作用，排除划痕实验中细胞增殖对迁移结果的影响。结果新疆阿魏乙酸乙酯部位各浓度均对结肠癌细胞的迁移和侵袭具有一定的抑制作用，且随着浓度的增高，划痕痕距愈合减慢，肿瘤细胞穿膜细胞数减少，呈现一定的浓度依赖性，与空白组比较差异有统计学意义。新疆阿魏虽不及同浓度顺铂对HCT116细胞的迁移和侵袭抑制作用强，但与空白组比较，新疆阿魏能有效抑制HCT116细胞的迁移及侵袭，为后期有效成分的提取提供了一定的实验依据。
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（收稿日期：2016-01-05）
（修回日期：2016-01-31；编辑：华强）
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更新时间：2024/12/22 23:51:09