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标题 糖痛方对高糖诱导RSC96细胞凋亡与增殖的影响
范文 刘晓星++朱晓云++韦茂英



摘要：目的 篩选中药糖痛方的体外作用最佳剂量。方法 采用含5～125 mmol/L不同浓度葡萄糖的DMEM培养基培养RSC96细胞，检测不同浓度（0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0 mg/mL）糖痛方高糖培养RSC96细胞增殖。采用含100、125 mmol/L葡萄糖培养基培养RSC96细胞72 h后，AV/PI凋亡试剂盒和流式细胞仪检测细胞凋亡，计算细胞凋亡率；CCK-8法检测不同时点RSC96细胞增殖。结果 RSC96细胞在100、125 mmol/L葡萄糖培养基培养下发生凋亡，凋亡率分别为（7.46±0.96）%、（16.53±1.01）%，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；不同浓度糖痛方可明显改善高糖对RSC96细胞增殖的抑制作用，24 h起效浓度为0.25 mg/mL；0.5、1.0、1.5 mg/mL 3个剂量糖痛方可明显抑制高糖诱导的细胞凋亡，与125 mmol/L高糖组比较，细胞凋亡率显著降低（P<0.05，P<0.01）。结论 在3个不同剂量中，1.5 mg/mL糖痛方抑制细胞凋亡作用最佳。
关键词：糖痛方；RSC96细胞；细胞凋亡；细胞增殖
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）10-0049-04
Effects of Tangtong Formula on RSC96 Schwann Cells Apoptosis and Proliferation Induced by High Glucose LIU Xiao-xing， ZHU Xiao-yun， WEI Mao-ying， DENG Lan， LI Ming-di （Department of Endocrinology， Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）
Abstract： Objective To screen the optimal dose of Tangtong Formula in vitro. Methods RSC96 Schwann Cells were cultivate by DMEM mediums which contains different concentrations of glucose （5–125 mmol/L）. The prevention effects of Tangtong Formula at different concentrations （0.25， 0.5， 0.75， 1.0， 1.5， 2.0， 3.0， 5.0 mg/mL） on the proliferation of RSC96 Schwann Cells induced by high glucose were detected. After the RSC96 Schwann Cells were cultivated in 100 mmol/L and 125 mmol/L high glucose mediums for 72 h， the apoptosis of RSC96 Schwann Cells was detected by flow cytometry Annexin V/PI， and the apoptosis rate was calculate； the proliferation situation of RSC96 Schwann cells in different times was detected by CCK-8 method. Results RSC96 Schwann cells were in apoptosis after being intervened by 100 mmol/L and 125 mmol/L high glucose mediums. The apoptosis rates were respectively （7.46±0.96）% and （16.53±1.01）%， with statistical significance compared with control group （P<0.01）. Different concentrations of Tangtong Formula could alleviate the inhibitory effect of high glucose on the proliferation of RSC96 Schwann cells， and the threshold concentration of Tangtong Formula in 24 h was 0.25 mg/mL. The concentrations of Tangtong Formula in 0.5 mg/mL， 1.0 mg/mL， and 1.5 mg/mL could inhibit the apoptosis of RSC96 Schwann cells induced by high glucos， compared with 125 mmol/L high glucose group， the apoptosis rate of RSC96 Schwann cells decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Among three different doses， when the dose of Tangtong Formula is in 1.5 mg/mL， the effects on inhibiting apoptosis are the best.
Key words： Tangtong Formula； RSC96 Schwann cells； apoptosis； proliferation
糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最为常见的慢性并发症之一，可引起不同程度的感觉和运动神经功能损害，先后出现肢端
基金项目：国家自然科学基金（81473464）
通讯作者：李鸣镝，E-mail：mdlee2009@126.com
感觉异常、肌力减弱甚至肌萎缩等，严重影响患者的生存和生活质量。糖痛方是本院内分泌科林兰教授治疗DPN的经验方，前期临床应用疗效较好[1-2]。课题组前期药理研究表明，糖痛方可提高Bcl-2，降低Caspase-9、Caspase-3活性的表达，抑制雪旺细胞凋亡、促进增殖[3-4]。但糖痛方抑制细胞凋亡、促进增殖的最佳剂量前述实验并未进行深入研究。本实验对糖痛方的有效治疗剂量进行了相关研究，为今后研究提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 细胞
RSC96细胞系，美国模式培养物集存库ATCC。
1.2 药物及制备
糖痛方（黄芪30 g，桂枝10 g，白芍10 g，细辛3 g，土鳖虫10 g，姜黄15 g，川芎10 g），饮片由康美药业提供，煎取水煎液，浓缩为约1 g/mL，本院煎药室提供。冷却后3000 r/min离心15min，取上清液，0.22 μm滤膜过滤，烘干，收集药粉，每50 mg分装于1.5 mL EP管中，-20 ℃保存备用。
1.3 试剂
DMEM低糖培養基（美国Gibco），胎牛血清（FBS，美国Gibco），CCK-8检测试剂盒（日本同仁化学研究所）。
1.4 仪器
LP400型全自动酶标仪（法国巴斯德公司），荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems），AV/PI凋亡检测试剂盒（美国BD），流式细胞仪（美国BD）。
2 实验方法
2.1 RSC96细胞复苏及培养
从液氮罐中快速取出RSC96细胞，37 ℃水浴快速解冻约1 min，将细胞悬浮液（1 mL）吸入15 mL离心管内并加入1 mL DMEM完全培养基，混匀后1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入5 mL含10%FBS、1%双抗、5 mmol/L葡萄糖的完全DMEM培养基；置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。显微镜下观察复苏的RSC96细胞生长状态，当细胞生长状态良好且铺满T25培养瓶的90%时进行细胞传代。1～2 d换液1次，2～4 d传代。取对数生长期的RSC96细胞进行后续实验。
2.2 分组
细胞增殖实验：对照组（含糖5.5 mmol/L、10%FBS、1%双抗的DMEM培养基）、高糖组（含25、50、75、100、125 mmol/L的葡萄糖），以2000个/孔的密度接种于96孔板，每组6个复孔，培养12、24、36、48、60、72 h检测细胞增殖。高糖诱导细胞凋亡实验：根据细胞增殖实验结果分为对照组（含糖5.5 mmol/L、10%FBS、1%双抗的DMEM培养基）、高糖组（分别含糖100、125 mmol/L及10%FBS、1%双抗的DMEM培养基），以5×104/孔浓度接种于6孔板，每组3个复孔，培养72 h。剂量筛选实验Ⅰ：对照组（含糖5.5 mmol/L）、高糖组（含糖125 mmol/L）、糖痛方组（含糖125 mmol/L+糖痛方0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/mL），培养24、48、72 h。剂量筛选实验Ⅱ：根据实验Ⅰ结果分为对照组（含糖5.5 mmol/L）、高糖组（含糖125 mmol/L）、糖痛方组（含糖125 mmol/L+糖痛方0.5、1.0、1.5 mg/mL），培养24、48、72 h。以2000个/孔的密度接种于96孔板，每组6个复孔。糖痛方诱导细胞凋亡实验：对照组（含糖5.5 mmol/L、10%FBS、1%双抗的DMEM培养基）、高糖组（含糖125 mmol/L、10%FBS、1%双抗的DMEM培养基）、糖痛方（含糖125 mmol/L+糖痛方0.5、1.0、1.5 mg/mL），以5×104/孔浓度接种于6孔板，每组3个复孔，培养72 h。
2.3 CCK-8法检测细胞增殖
将96孔板加入CCK-8试剂，作用30 min，用酶标仪于波长450 nm处测定吸光度（OD），按照试剂盒说明书进行操作。
2.4 AV/PI流式细胞仪检测细胞凋亡
0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集细胞，PBS洗2次，每组收集1×105～5×105个细胞，1000 r/min离心5 min；加500 μL稀释1倍的Binding Buffer并轻轻重悬细胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混匀，再加入5 μL PI混匀，室温下避光反应10～15 min后筛网过滤；1 h内进行流式细胞仪检测，激发波长488 nm，发射波长530 nm，按照试剂盒说明书进行操作。应用流式软件分析结果，左上象限为坏死细胞，左下象限为正常细胞，右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞。实验重复3次。计算细胞凋亡率。细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数÷（凋亡细胞数+正常细胞数）×100%。
3 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 不同浓度高糖培养基对RSC96细胞增殖的影响
RSC96细胞在低糖DMEM完全培养基中培养36～48 h时生长最快，在不同浓度高糖培养基RSC96细胞均能生长，但随着高糖浓度的增加，生长速度逐渐下降，在同一高糖浓度下生长速率亦有变化。在48～60 h各高糖组生长速率均减慢，而60～72 h又较前升高。60 h后，各高糖组与对照组比较，RSC96细胞增殖明显降低（P<0.05，P<0.01），在72 h时差异最明显。结果见表1。
4.2 不同浓度高糖培养基对RSC96细胞凋亡的影响
与对照组比较，培养72 h后，100、125 mmol/L高糖组细胞凋亡率明显升高（P<0.01），125 mmol/L高糖组细胞凋亡率升高更明显（P<0.05），凋亡细胞以晚期凋亡为主。结果见表2。
4.3 糖痛方干预高糖培养RSC96细胞剂量筛选实验Ⅰ结果
经24、48、72 h多次重复检测，125 mmol/L高糖组RSC96细胞增殖呈现明显抑制状态。给予糖痛方后，高糖对RSC96细胞增殖抑制作用减弱，表明糖痛方对高糖抑制RSC96细胞增殖有保护作用。24 h起效浓度0.25 mg/mL，随糖痛方剂量增加，糖痛方对高糖抑制细胞增殖的保护作用增强，但当糖痛方浓度超过2.0 mg/mL时，其保护作用减弱。结果见表3。
4.4 糖痛方干预高糖培养RSC96细胞剂量筛选实验Ⅱ结果
根据筛选实验Ⅰ结果，最终确定培养基中糖痛方低、中、高浓度为0.5、1.0、1.5 mg/mL。3个不同剂量糖痛方均对高糖环境造成的RSC96细胞增殖抑制均有明显的改善作用。结果见表4。
4.5 糖痛方对高糖培养RSC96细胞凋亡的影响
与对照组比较，高糖组细胞凋亡率明显升高（P<0.05），凋亡细胞中以晚期凋亡为主；与高糖组比较，糖痛方各浓度组RSC96细胞凋亡率明显降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表5。
5 讨论
雪旺细胞是周围神经系统的胶质细胞，其在周围神经正常的生长发育过程中发挥重要的作用。有学者研究发现，雪旺细胞在周围神经损伤后修复中分泌神经营养因子、参与髓鞘的生成、营养神经元、引导轴突再生等[5]。细胞凋亡或称程序性细胞死亡，是指局部环境生理或病理性变化引起的、由自身内部机制调节的一种主动的、按一定程序进行的细胞自发性死亡方式。诸多研究表明，高糖对雪旺细胞增殖有显著抑制作用，并促进细胞凋亡。氧化应激和细胞线粒体功能障碍是细胞凋亡的重要启动因素[6-7]。
糖尿病患者由于长期处于高糖应激状态，引起一系列的代谢障碍，如葡萄糖旁路代谢途径-多元醇通路的激活，葡萄糖在特定关键酶——醛糖还原酶作用下生成山梨醇，而细胞对于山梨醇的清除能力有限，最终导致山梨醇在细胞内积聚，导致细胞内的高渗状态，破坏细胞内环境的稳定性，引起神经细胞水肿、坏死、凋亡增加[8]；同时高糖又加重神经纤维组织的氧化应激反应，使成熟的雪旺细胞发生脱髓鞘，从而加速DPN的发生[9-10]。
因此，研究雪旺细胞的凋亡损伤，对防治DPN有重要意义。本实验采用细胞培养技术，对T4代的RSC96细胞进行传代培养，由于RSC96细胞系是大鼠原代雪旺细胞自发转化的永生化细胞，较提取的原代雪旺细胞纯度更高，易于培养，故近几年较多应用于DPN的研究[11-12]。
我们所建立高糖诱导的RSC96细胞凋亡损伤模型，结合前期实验并参照他人经验[6，12]，选取100、125 mmol/L高糖濃度干预，采用流式细胞仪经Annexin V-FITC/PI荧光染色细胞方法进行凋亡检测。结果显示，对照组细胞以活细胞为主，而125 mmol/L高糖诱导72 h后，凋亡细胞比例明显增加，以晚期为主。糖痛方干预后，活细胞分布比例明显增加，凋亡细胞比例明显减少。为摸索糖痛方抑制凋亡、促进增殖的最佳剂量，本实验考察了不同剂量糖痛方对高糖培养RSC96细胞凋亡的影响。结果发现，1.5 mg/mL糖痛方抑制凋亡作用最好。这一结果为今后进行体内实验及在DPN动物模型上进行药物剂量筛选提供了数据支持。
参考文献：
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[3] 林兰，郑亚琳，李鸣镝，等.糖痛方及其有效成分对高糖培养的施万细胞增殖的影响[J].医学研究杂志，2013，42（9）：44-47.
[4] 郑亚琳，李鸣镝，林兰.糖痛方对施万细胞凋亡及Bcl-2、caspase-3、caspase-9表达的影响[J].医学研究杂志，2014，43（11）：39-42.
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（收稿日期：2016-11-15）
（修回日期：2017-04-07；编辑：华强）
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更新时间：2025/3/14 21:45:15