| 标题 | HPLC双波长法同时测定甘草药渣提取物中甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及甘草酸含量 |
| 范文 | 罗燕燕+刘效栓+肖正国+李喜香+李季文+毕映燕+张柏桃 摘要：目的 建立甘草藥渣提取物中甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及甘草酸的测定方法。方法 采用HPLC双波长法对甘草药渣提取物中的主要成分甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素和甘草酸进行定量分析。色谱柱为Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），以乙腈（A）-0.085%磷酸水（B）为流动相，采用梯度洗脱（0～8 min，81%B；8～35 min，81%→50%B；35～60 min，50%B），流速1.0 mL/min，进样量10 ?L，柱温为室温，双波长检测（λ1=237 nm，λ2=254 nm）。结果 甘草苷在0.040 8～0.816 ?g、异甘草苷在0.052 8～1.056 ?g、甘草素在0.022 4～0.448 ?g、异甘草素在0.021 2～0.424 ?g、甘草酸在0.044 8～0.896 ?g范围内均呈良好的线性关系，平均回收率分别为98.69%、98.31%、99.10%、98.55%、99.14%，RSD分别为1.39%、1.29%、1.78%、2.14%、1.15%。结论 本法准确可靠，专属性强，结果稳定，重复性好，可用于甘草药渣提取物中上述5种成分的测定。 关键词：甘草药渣提取物；高效液相色谱法；双波长法；含量测定 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.016 中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）12-0064-04 Simultaneous Determination of Liquiritin， Isoliquiritin， Glycyrrhizin， Isoliquiritigenin and Glycyrrhizic Acid in Licorice Extract by HPLC Dual Wavelength Spectrophotometry LUO Yan-yan1， LIU Xiao-shuan2， XIAO Zheng-guo2， LI Xi-xiang2， LI Ji-wen2， BI Ying-yan2， ZHANG Bo-tao3 （1. Pharmacy College， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Pharmacy Department， Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730050， China； 3. Pharmaceutical Inspection Institute of Gansu Province， Lanzhou 730070， China） Abstract： Objective To establish a method for the simultaneous determination of liquiritin， isoliquiritin， glycyrrhizin， isoliquiritigenin and glycyrrhizic acid in licorice extract. Methods Liquiritin， isoliquiritin， glycyrrhizin， isoliquiritigenin and glycyrrhizic acid in licorice extract were determined by HPLC dual wavelength spectrophotometry. Symmetry C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m） was used. The mobile phase was acetonitrile （A） - 0.085% phosphoric acid water （B）， ingradient elution mode （0–8 min， 81% B； 8–35 min， 81%→50% B； 35– 60 min， 50% B） with the flow rate of 1.0 mL/min. The sample size was 10 ?L， and column temperature was room temperature. Dual wavelength detection， λ1=237 nm， λ2=254 nm. Results Liquiritin， isoliquiritin， glycyrrhizin， isoliquiritigenin and glycyrrhizic acid were linear in the ranges of 0.040 8–0.816 ?g， 0.052 8–1.056 ?g， 0.022 4– 0.448 ?g， 0.021 2–0.424 ?g， and 0.044 8–0.896 ?g， respectively. The average recovery was 98.69%， 98.31%， 99.10%， 98.55%， and 99.14%， respectively； RSD was 1.39%， 1.29%， 1.78%， 2.14%， and 1.15 %， respectively. Conclusion The method is accurate， reliable and specific. The results are stable with good repeatability. It can be used for the determine of above 5 components in licorice extract. Key words： licorice extract； HPLC； dual wavelength spectrophotometry； content determination 基金项目：兰州市科技计划项目（2014-2-32） 通讯作者：刘效栓，E-mail：liuxiaoshuan1964@163.com 甘草为豆科甘草属甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草G.inflata Bat.、光果甘草G.glabra L.的干燥根和根茎，具补脾益气、清热解毒、止咳化痰、缓急止痛、调和诸药之功。甘草的主要有效成分为甘草酸和甘草黄酮[1]。 近年来，随着对甘草开发利用的不断深入，甘草和甘草制品的需求量逐年增加，甘草资源急剧减少。与此同时，甘草提取甘草酸或甘草浸膏后剩余的残渣（甘草渣）也逐渐成为危害生态环境的又一物质[2]。目前甘草的利用率仅为30%，剩余物基本作为药渣弃去，据估计，我国每年有数万吨甘草药渣未被资源化利用[3]。而甘草药渣是一种宝贵的可再利用资源，其中含有大量的黄酮[4-5]及甘草酸[6]。因此，有效地从甘草渣中再次提取黄酮和甘草酸对充分开发利用甘草资源意义重大。 通常情况下，仅采用单一波长检测黄酮类和三萜类2类物质无法实现其整体表达和全面评价，而双波长法同时测定具操作简便、灵敏可靠、重现性好等优点。本试验采用HPLC双波长法同时测定甘草药渣提取物中4种黄酮成分及甘草酸的含量，为甘草药渣提取物的质量控制提供依据。 1 仪器与试药 高效液相色谱仪（Waters1525泵，Waters717进样器，Waters2487双通道紫外检测器），AR124CN型电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司），SB-3200D型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。 甘草饮片（甘肃冠兰中药饮片有限公司，批号20160325、20160402，经甘肃省药品检验研究院宋平顺主任药师鉴定为Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎；甘草药渣（自制，批号20160826）；甘草药渣提取物（自制，批号20161102、20161104、20161106、20161108、20161110、20161112、20161114）；甘草苷对照品（批号B-20414）、异甘草苷对照品（批号B-21524）、甘草素对照品（批号B-20416）、异甘草素对照品（批号B-21525）、甘草酸对照品（批号B-20414），上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇（色谱纯，批号20160905）、乙腈（批号20160505）、磷酸（批号20160307），天津市大茂化学试剂厂；含量测定用水为纯化水。 2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照品溶液的制备 分别精密称取甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及甘草酸对照品适量，加70%乙醇制成每1 mL含甘草苷0.040 8 mg、异甘草苷0.052 8 mg、甘草素0.022 4 mg、异甘草素0.021 2 mg、甘草酸0.044 8 mg的混合溶液，即得。 2.1.2 供试品溶液的制备 取甘草药渣提取物（批号20161102）约100 mg，精密称定，加70%乙醇超声处理（温度37 ℃，功率300 W）5 min，定容至25 mL，摇匀，过滤，取续滤液，经0.45 ?m微孔滤膜过滤，即得。 2.2 色谱条件及系统适应性试验 色谱柱：Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相：乙腈（A）-0.085%磷酸水（B），梯度洗脱（0～8 min，81%B；8～35 min，81%→50%B；35～60 min，50%B）；流速：1.0 mL/min；进样量：10 ?L；柱温：室温；双波长检测[7-8]：λ1=237 nm，λ2=254 nm。色谱图见图1。 A B C D 注：A.混合对照品（λ1）；B.供试品（λ1）；C.混合对照品（λ2）；D.供试品（λ2）； 1.甘草苷；2.异甘草苷；3.甘草素；4.甘草酸；5.异甘草素 图1 甘草药渣提取物中5种成分HPLC图 2.3 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液1、5、10、15、20 ?L，在上述色谱条件下依次进样，以对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。甘草苷Y=2 154 989.975X-14 196.073，r=0.999 7；异甘草苷Y=1 270 876.187X-10 898.366，r=0.999 7；甘草素Y=4 705 003.769X-18 178.439，r=0.999 8；异甘草素Y=1 883 245.602X-7160.195，r=0.999 7；甘草酸Y=838 071.814X-6863.610，r=0.999 8。结果表明，甘草苷在0.040 8～0.816 ?g、異甘草苷在0.052 8～1.056 ?g、甘草素在0.022 4～0.448 ?g、异甘草素在0.021 2～0.424 ?g、甘草酸在0.044 8～0.896 ?g范围内均呈良好的线性关系。 2.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 ?L，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定峰面积，结果甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及甘草酸的RSD分别为1.36%、1.08%、1.92%、1.64%、1.83%，表明仪器精密度良好。 2.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，每隔2 h进样1次，运用双波长融合谱技术对提取物具有代表性和互补性的237、254 nm波长下色谱图进行融合。选择图1B、D中特征峰1、2、3、4、5号，以1号色谱峰为内标，考察其相对保留时间和峰面积。计算相对保留时间γi，s=t'i/t's，式中i和s分别为特征峰和内标峰。结果所标定色谱峰（甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸及异甘草素）的相对保留时间RSD<0.3%；峰面积的RSD分别为1.36%、2.15%、2.14%、1.26%、1.23%，表明样品在10 h内稳定性良好。 2.6 重复性试验 称取甘草药渣提取物（批号20161102）6份，按“2.1.2”项下方法制备，在上述色谱条件下进行分析测定，结果甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及甘草酸的RSD分别为1.87%、1.62%、1.93%、1.32%、1.08%，表明本法重复性良好。 2.7 加样回收率试验 精密量取6份已知含量的供试品溶液5 mL，用移液器分别精密加入甘草苷对照品（0.040 8 g/L）、异甘草苷对照品（0.052 8 g/L）、甘草素对照品（0.022 4 g/L）、异甘草素对照品（0.021 2 g/L）及甘草酸对照品溶液（0.044 8 g/L）适量，按供试品溶液制备方法制备并测定，结果见表1。 2.8 样品含量测定 取7批甘草药渣提取物，每批平行3份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样，通过测得的峰面积值计算甘草药渣提取物中甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及甘草酸的含量，结果见表2。 表1 甘草药渣提取物中5种成分加样回收率试验 成分 样品中 含量/?g 加入量 /?g 测得量 /?g 回收率 /% 平均回 收率/% RSD /% 甘草苷 153.36 40.80 193.96 99.50 153.36 40.80 194.34 100.43 153.36 40.80 193.19 97.62 98.69 1.39 153.36 40.80 193.67 98.79 153.36 40.80 193.83 99.18 153.36 40.80 192.78 96.61 异甘草苷 51.83 26.40 77.47 97.13 51.83 26.40 78.03 99.25 51.83 26.40 78.19 99.85 98.31 1.29 51.83 26.40 77.76 98.22 51.83 26.40 77.93 98.87 51.83 26.40 77.32 96.56 甘草素 7.21 6.72 13.91 99.75 7.21 6.72 13.87 99.15 7.21 6.72 13.79 97.96 99.10 1.78 7.21 6.72 14.02 101.38 7.21 6.72 13.68 96.32 7.21 6.72 13.93 100.04 异甘草素 18.34 10.60 28.92 99.81 18.34 10.60 28.39 94.81 18.34 10.60 28.95 100.09 98.55 2.14 18.34 10.60 28.88 99.43 18.34 10.60 28.65 97.26 18.34 10.60 28.93 99.91 甘草酸 378.33 44.80 423.12 99.98 378.33 44.80 423.09 99.91 378.33 44.80 423.10 99.93 99.14 1.15 378.33 44.80 422.98 99.67 378.33 44.80 422.05 97.59 378.33 44.80 422.12 97.75 表2 甘草药渣提取物中5种成分含量测定结果（mg/g） 批号 甘草苷 異甘草苷 甘草素 异甘草素 甘草酸 总含量 20161102 7.39 2.50 0.35 0.88 18.22 29.34 20161104 9.15 3.06 0.38 1.01 22.71 36.30 20161106 9.17 3.05 0.38 1.02 22.75 36.35 20161108 9.33 3.10 0.38 1.02 23.15 36.98 20161110 9.35 2.99 0.39 1.04 23.18 36.94 20161112 9.43 3.15 0.39 1.03 23.36 37.37 20161114 6.77 2.33 0.32 0.79 17.27 27.48 3 讨论 本试验考察了不同溶媒（包括甲醇及不同浓度的乙醇）超声提取样品，比较各溶媒对样品的溶解性，发现样品在70%乙醇溶液中溶解度大于甲醇溶液，同时考虑到溶剂的安全性和环保因素，故选择70%乙醇作为样品提取溶剂。 本试验曾参考文献[9-11]，对甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸-水、乙腈-磷酸-水的不同比例和梯度洗脱系统进行考察，发现以乙腈-0.085%磷酸为流动相所得到的色谱图中，化合物的分离效果好，色谱峰形佳且相对稳定，故选用乙腈-0.085%磷酸为系统流动相。 本试验在选择波长时，以检测甘草黄酮（甘草苷）具有代表性的波长237 nm[12]为主。依据文献[8]，甘草酸的最大紫外吸收波长是254 nm。通过进一步实验发现，在254 nm波长下甘草药渣提取物中甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及甘草酸均有较好的吸收，故选择λ1=237 nm，λ2=254 nm。 在HPLC特征图谱或指纹图谱研究中，传统的定位方法为随行对照或者相对保留时间定位。通过试验发现，对于复杂化合物中某一组分的定位测定，还可以参考同一时间2个波长下面积的比值来确定指纹峰，以排除相邻峰的干扰，避免因实验室温湿度变化造成保留时间不恒定所致的误差。 同时，曾试验在梯度洗脱时间变换同时变换检测波长，发现其重复性较差、操作较复杂。而双波长同时检测提高了精密度和灵敏度，重复性良好。 目前，对这5种成分（包括甘草黄酮和甘草酸）含量的同时测定尚未见文献报道。本试验将5个对照品按一定体积混合进样得出其混合图谱，同时测定，不仅简化了操作，还节省了成本及时间，为甘草药渣指纹图谱的研究奠定了基础。 参考文献： [1] 崔永明.甘草黄酮的分离鉴定、药效及其指纹图谱研究[D].武汉：华中科技大学，2008. [2] 黄明进，王文全，魏胜利.我国甘草药用植物资源调查及质量评价研究[J].中国中药杂志，2010，35（8）：947-952. [3] 刘芬，李宁，倪慧，等.甘草药渣的研究进展[J].中国现代中药，2011， 13（2）：6-9. [4] 张娟，倪慧，卿德刚，等.HPLC法指認甘草废渣中黄酮类成分及含量测定[J].中国中医药科技，2012，19（3）：233-234. [5] 沈阳药科大学.从甘草药渣中制备抗炎、抗肿瘤有效成分组的方法及其应用：CN102552239A[P].2012-07-11. [6] 李炳奇，刘振华，马燕.超声法联合提取甘草渣中多糖和甘草酸的研究[J].现代食品科技，2006，22（4）：26-28. [7] 孙国祥，王佳庆.基于双波长HPLC指纹谱和其融合谱的系统指纹定量法鉴定甘草质量[J].中南药学，2009，7（5）：378-383. [8] 孙国祥，王佳庆.HPLC数字化指纹图谱控制甘草质量[J].中南药学， 2009，7（1）：51-54. [9] 卓越，王新春，甘永祥，等.高效液相色谱法测定甘草中4种黄酮类化合物[J].中成药，2010，32（4）：697-698. [10] 赵月然，卢丹.HPLC法同时测定复方甘草片中甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸[J].中成药，2014，36（4）：867-869. [11] 刘永，文振催，黄志刚，等.HPLC法同时测定甘草总黄酮分散片中甘草素和甘草查尔酮A的含量[J].今日药学，2016，26（1）：19-21，26. [12] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：86-87. （收稿日期：2017-03-10） （修回日期：2017-04-01；编辑：陈静） |
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