| 标题 | 流式细胞术在体育科研中的应用 |
| 范文 | 李松波 金卫东 王 隽 张爱芳 摘 要：流式细胞术是一种综合应用光学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术,对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。用它不仅可以来对细胞进行计数，还可以对细胞的混合物进行细胞类型的分析研究，并同时测定细胞的多个参数,如测定细胞的特征(形态、膜电位等)和细胞内pH,细胞DNA、蛋白质含量、表面受体、Ca2+等。流式细胞术分析细胞的灵敏度、精密度大大超越了传统的技术，因此广泛应用于医学生物学等许多领域。主要综述流式细胞术在体育科研中的应用并讨论它在应用中的局限性和面临的挑战。 关键词：流式细胞术;免疫功能;细胞凋亡;综述 中图分类号：G804.7 文献标识码：B 文章编号：1007-3612(2008)08-1102-03 Application of Flow Cytometry in Sports Research LI Song-bo1, JIN Wei-dong2, WANG Jun3, ZHANG Ai-fang1 (1.Beijing Sport University, Beijing 100084, China; 2.Hebei University of Technology, Langfang 065000, Hebei China; 3.Capital Institute of Physical Education, Beijing 100084, China） Abstract:Flow cytometry is a method for rapidly analyzing large numbers of cells individually using light fluorescence and integrating optics, fluidics, electronics, and computer technology. Now it is a powerful tool for characterizing the composition of complex cell populations. Flow cytometric assays have been developed to determine both cellular characteristics such as size, membrane potential, and intracellular pH and the levels of cellular components such as DNA, protein, surface receptors, and calcium. The accuracy and precision of this technology for describing and enumerating cells exceeds traditional methods. With its high sensitivity and specificity, the flow cytometric has become the preferred method for the lineage assignment and maturational analysis of m alignant cells in acute leukemia and lymphoma。Flow cytometry has revolutionized the field of immunology, in both the basic science and clinical settings, as well as having been instrumental to new and exciting areas of discovery such as stem cell biology and detecting microorganisms in environmental samples. This review focuses primarily on the use of flow cytometry in sport research area. Finally, a discussion of the challenges and limitations of the method is presented along with a future outlook. Key words: flow cytometry; immune function; apoptosis; review 流式细胞术（Flow Cytometry，简称FCM）是上世纪70年代发展起来的一项新技术,它是利用流式细胞仪测量在液流中细胞或颗粒悬液中的标记物荧光强度并进行多参数的快速定量分析和分选的技术。已经在细胞生物学、分子生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、遗传学等方面得到了广泛的应用；并已广泛应用于体育科研领域中，主要有运动与免疫功能、运动与细胞凋亡和运动相关基因的蛋白产物免疫标记的检测等方面。 1 FCM基本原理 FCM的基本原理是将待测样本的细胞悬液，在鞘液的包围和约束下，使细胞排成单列由流动室喷嘴高速喷出，形成细胞液柱，当液柱通过检测区，在入射的激光束照射下产生前向散射光(FCS)和侧向散射光(SSC)，它们分别反映细胞的大小和颗粒度，根据这些特性可将细胞分类。同时经一种或几种特殊荧光标记的样本细胞，在激光束的激发下产生特定荧光，该荧光信号可被光学系统检测并输送到数据处理系统进行分析。 2 FCM在体育科研中的应用 2.1 运动与外周血白细胞的免疫表型分析 细胞免疫表型的研究是FCM应用最成熟的领域之一。运动影响外周血白细胞的免疫表型的研究基本集中在T淋巴细胞、NK细胞等在医学领域研究较早的细胞上。大量研究表明T淋巴细胞在不同的CD4和CD8群中，表面标记与功能的关系存在普遍的规律，这也正是利用T淋巴细胞的免疫表型来分析其功能的理论基础。运动对T淋巴细胞的影响研究很多。研究发现，一次比赛或训练前、即刻、和之后24 h CD3+、CD4+、CD8+和CD19+等一般会有一个升高、降低并恢复的过程［1］,长时间大强度训练会导致外周血CD4+比例下降，CD8+比例上升，CD4+/CD8+比值下降，NK细胞活性下降［2］。其中，运动强度是影响运动过程中NK细胞变化的关键因素,运动强度愈大NK细胞的变化愈明显,主要表现为外周血NK细胞数量与功能的下降［3］。近几年研究表明，高原训练及低氧暴露可抑制机体免疫功能［4］。王恬等研究发现不同的模拟低氧训练过程中,淋巴细胞及其亚群(CD3+、CD4+、CD8+T)的变化总体趋向较为一致,但变化程度有所差异。低氧训练第4周、第5周, HiHiLo组NKT(Natural killer T)细胞下降幅度更大；低氧训练第5周CD3+、CD4+均呈上升趋势,但LoHi组上升更明显［5］。 运用FCM研究营养补剂调节运动导致的免疫功能抑制时发现，运动员通过长期低剂量口服补充谷氨酰胺、补充牛初乳、服用黄芪多糖和牛膝多糖能有效防止训练期后CD4+/CD8+比值的下降，抑制淋巴细胞数量的减少和活化T细胞数量的下降［6］。 可见利用FCM监测T淋巴细胞变化的幅度可以反映运动员的疲劳程度，对训练的适应及恢复情况；所以，在大负荷训练期必须重视运动员免疫机能的变化，积极采取措施预防疾病的发生、发展。 2.2 运动对红细胞的影响分析 FCM在红细胞中的最大应用价值是其能检测少量红细胞群体。朱荣等研究HiHiLo对足球运动员红细胞的影响发现HiHiLo和LoLo均可下调人体红细胞CD58、CD59（荧光强度）表达, HiHiLo影响红细胞CD58表达下降较LoLo有更明显趋势，从而影响红细胞对T淋巴细胞免疫的调控［7］。HiLo实验中灵芝多糖可以明显影响红细胞CD35数量的表达,并且可以调节实验中出现的运动员红细胞继发性免疫低下的现象。曹建民等研究表明运动训练导致运动性贫血大鼠红细胞膜转铁蛋白受体含量明显增加,且与血清铁呈高度相关,说明红细胞膜转铁蛋白受体含量能更为准确地反映红细胞内和机体铁代谢状况，同时发现抗贫血铁制剂复合营养补剂的干预能显著降低红细胞膜转铁蛋白受体含量［8］。 2.3 运动对网织红细胞的影响分析 前已述及，由于激光束可射入细胞内，因而可进行红细胞内容物的分析，网织红细胞浆内含有一定量的 RNA，经染色后可显示网织结构且其形式与 RNA 含量有关。这样用FCM测定网织红细胞,根据荧光强度将其分为低、中、高(LFR,MFR, HFR)三种荧光类型；幼稚网织红细胞有最强的荧光，多为MFR，HFR；较成熟的荧光强度弱，为LFR。在造血受到刺激，幼稚的从骨髓释放入外周血MFR, HFR显著增高，即未成熟网织红细胞指数(IRF)显著增高［9］，往往提示红细胞生成开始。所以此方法可及时的反映骨髓的造血状况,其在监测红细胞生成和破坏,监测体内铁的存储形式和利用情况,及补充铁剂的效果时,均可提供及时可靠的信息，对运动性贫血的诊断、鉴别诊断和疗效观察有重要意义。 运用FCM研究不同项目运动员网织红细胞参数时发现, 表现性项群运动员LFR最高，而RET%和MFR比例却显著低于耐力性项群、速度力量性项群和对抗性项群。提示表现性项群网织红增生活性较低。4个项群中,对抗性项群运动员Hb最低,网织红细胞参数中CHr及网织红细胞内血红蛋白量浓度（HDWr）显著低于其它项群运动员［10］。 许多研究表明低氧训练时的Hb的变化与RET有很高的相关性［11］。刘媛媛等研究了13名国家女子中长跑队运动员RET在26d的低氧训练的变化发现， HiHiLo组的IRF、RMI以及Hb、RET%的增加幅度均高于LoHi组同时段各指标；并且受检网织红细胞参数反映骨髓红系增生的敏感性依次为IRF=RMI>RPI=RET%和RET%>Hb［12］。张春丽等还发现模拟HiLo的大鼠高强度定量负荷组与极限负荷组的RET%显著低于常氧组。两氧环境中,高强度定量负荷组RET%显著低于运动后40h安静组［13］。但Ashenden M J等对澳大利亚国家女自行车运动员为期70d的高住(海拔高度2 650 m)低练的研究结果表明,对RET和Hb没有显著意义［14］。Lundby等对8名运动员模拟高原(4 100 m)的低氧舱中为期14d的间歇性低氧训练后,RET还包括EPO、Hb和HCT无明显改变［15］。产生这种不同的研究结果，除有运动项目自身的因素外，研究时还要考虑网织红细胞变化先于Hb的特点。因为有人动态观察显示HFP(早期网织红细胞)比率的升高可早于Hb变化3～5 d，早于MCV变化5～7 d［16］。 2.4 运动与血小板相关免疫球蛋白和血小板微粒膜蛋白分析 血小板功能变化是血栓形成的病理过程的重要因素。FCM已经成为检测血小板功能状态的重要实验手段,因为它有助于区分血小板病理学形态变化和膜蛋白分析；可以研究不同诱导剂作用下、剪切力诱导下血小板活化时其钙离子浓度的变化，检测活化血小板，血小板缺陷性、减少性疾病；检测网织血小板（RP）可用于发生栓塞的危险性判断。 运动作为一种预防高血压患者血栓性疾病发生的手段,已为人们所接受并在实践中广泛应用, 窦丽等研究发现进行10周中等强度的游泳运动能提高高血压大鼠血小板内NOS活性,增加血小板NO的释放,提高血小板内cGMP水平来抑制血小板的聚集,对防治高血压血栓性疾病有重要的作用［17］。研究还有长期规则游泳运动对Wistar大鼠血小板L-Arg转运的影响,结果表明,适宜运动可提高血小板L-Arg（L-精氨酸）转运率,据此推测运动可通过增加L-Arg的转运,促进血小板NO的合成和释放,以负反馈方式抑制血小板的聚集,从而对预防血管栓塞性疾病有积极的作用［18］。研究表明早期康复训练可下调急性脑梗死（ACI）早期血小板活化及血小板胞浆内-α粒膜上糖蛋白CD62P的表达［19］。 2.5 用于细胞凋亡的检测 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性的死亡。近年来研究多用FCM来检测细胞凋亡，包括凋亡DNA的检测、细胞质膜的完整性、线粒体跨膜电位、溶酶体质子泵、蛋白质和DNA含量、光的散射、DNA的原位降解、细胞凋亡的定量测定等。FCM常用于凋亡检测的方法有Caspase-3、Annexin V和DNA断裂片段的分析等方法，其中Annexin V联合PI法是一种新的较为理想的检测方法。 FCM在运动与淋巴细胞凋亡研究中的应用。大多数研究发现小负荷运动不影响淋巴细胞的凋亡［20］；有趣的是有研究发现，中等负荷运动训练可以降低心理应激导致的大鼠外周血淋巴细胞凋亡量，降低心理应激对大鼠机体免疫功能的危害［21］。大负荷运动会导致运动后血液中淋巴细胞的凋亡，王安利较全面地研究了不同负荷对小鼠淋巴细胞凋亡的影响， 发现 6月龄小鼠、12月龄小鼠淋巴细胞凋亡的发生率由高到低，其排列顺序依次是，负重运动组>一次性力竭运动组>对照组>无负重组［22］。 FCM在运动与骨骼肌细胞凋亡研究中的应用。Biral等研究发现成年小鼠经过12 h的钢笼内自发跑后，运动后即刻肌细胞凋亡率最高，6 h后稍微有所下降，96 h后凋亡率大幅度下降［23］。越来越多的证据表明，运动训练导致的肌肉细胞凋亡有一定的时相性和矛盾性,运动可以导致骨骼肌细胞凋亡,但是运动本身对已经凋亡骨骼肌细胞可能具有清除作用或对即将凋亡的骨骼肌细胞有恢复作用，这两种作用结果之间调控失衡，可能是造成骨骼肌运动损伤原因之一，说明运动影响骨骼肌细胞的凋亡具有双向性［24］。 许多研究采用FCM检测大鼠各组心肌、肾组织细胞和肝细胞凋亡率的变化发现运动可以诱导肝细胞凋亡、心肌细胞凋亡，且随运动强度增加而增加［25］。金其贯等研究还发现力竭后即刻心肌细胞凋亡与肾细胞凋亡率即明显升高; 之后的24 h之内,它们会有一个明显升高然后降低的过程但仍明显高于对照组［26］。还有研究发现补充银杏制剂、胆红素可通过其抗氧化作用及影响凋亡相关基因的表达而抑制大强度运动训练诱导的肝、心肌细胞过度凋亡，从而发挥一定的保护作用［27］。 总之，FCM不仅为细胞是否发生凋亡提供客观证据，而且还能对细胞凋亡进行定量分析，并可从多方面证实细胞凋亡和细胞坏死的区别，同时还能检测同一群体的不同亚群细胞中的凋亡细胞，并可进行分选。 2.6 用于检测与运动能力相关基因的表达产物 FCM在此方面的研究国内未见报道，它的优势在于不必分离蛋白质就可以对细胞膜表面、细胞浆中的蛋白质进行分析检测。如近几年的研究热点淋巴细胞的细胞因子（γ-INF、α-TNF）的分泌［28］。Staats R等为了解剧烈运动后运动员体内NK细胞毒活性(NKCA)和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)抑制的原因,研究了淋巴细胞亚群改变和细胞内穿孔素（PFR）基因表达改变的相关性,使用流式细胞仪对PFR进行了分析。他们发现:训练有素的运动员外周血中PFR的百分比相对较高,但在过度疲劳后PFR出现暂时性下降［29］。 3 FCM在体育科研应用中存在的问题 综上所述，FCM以其快速、准确、灵活、多参数同时分析等优点,已成为体育科研的重要方法之一。但其中也存在以下问题：1）联用抗体对运动影响人体免疫细胞功能的组合设计处于初级阶段。FCM对临床白血病和淋巴瘤等疾病的诊断已有多种成熟的抗体“组合”方式；但关于运动对人体免疫细胞影响的研究还多停留在T细胞亚群水平，并没有形成比较成熟的抗体组合（没有系统的CD研究方案）。2）通常检测的是外周血标本，更应考虑留取其他标本（如骨髓、淋巴节、胸腔液、腹腔液或脑脊液）。因为这样才有可能及时、准确、全面地反映机体功能的变化，但这些样本不易从健康个体获取。3）应加强研究不同训练负荷量和不同补剂对血小板功能、粒细胞功能的影响，为运动疾病的防治提供理论依据。4）加强质量控制，一些FCM检测技术在方法学和抗体选择上还没有统一,分析结果亦存在多种影响因素,如样本与试剂准备、免疫荧光染色方法、对照设置、流式细胞数据的获取与分析等。只有充分了解这些影响因素,建立标准化的操作程序并做好严格的质控,才能保证检测结果准确、可靠。相信,随着FCM的不断发展完善,它将为体育的基础与应用研究开创新局面。 参考文献： ［1］ Eliakim A, Wolach B, Kodesh E. et al. 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