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标题

鸭疫里氏杆菌的分离及PCR鉴定

范文

范荣香

鸭疫里氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎，是危害养鸭业的主要细菌性传染病。该病主要侵害1-8周龄健康鸭，尤其引起2-3周龄雏鸭大批发病，病死率可高达80%或以上。发病鸭以倦怠、缩颈、不食或少食、眼鼻出现大量分泌物、绿色下痢、共济失调和抽搐为主要临床特征。随着集约化养鸭业的发展，该病的流行日趋严重，而细菌分离鉴定、PCR检测，是实验室最常用的检测方法，灵敏度较高、特异性较强，在微生物检测方面应用十分广泛。本文根据实验室采集的病料进行细菌分离、形态染色观察、生化鉴定、PCR反应，鉴定该菌株为鸭疫里氏杆菌。

一、材料和方法

1、材料

（1）病料来源

某养殖场饲养的300只肉鸭突然发病，发病日龄为16日龄，临床表现：主要以偏颈、眼鼻有分泌物、绿色下痢、站立不稳、运动失调为基本特征。并出现死亡，每天死亡10-20只左右，3天死亡57只，死亡率为19%。发病后用青霉素、土霉素、磺胺二甲嘧啶等抗菌药物治疗均未见效。

（2）病料处理

剖检病（死）鸭5只，呈现典型纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎。无菌操作采病死鸭脑、心血、肝脏做病料触片及细菌分离培养。

（3）药品与试剂

革兰氏染色液、PBS、普通培养基、鲜血琼脂平板、巧克力平板、伊红美蓝平板、麦康凯平板、SS培养基、TSA培养基、生化发酵管、PCR反应试剂（rTaq、dNTP、Mgcl2、10×PCRbuffer）和DNAMarker等购自宝生物工程（大连）有限公司。

（4）主要试验仪器

恒温箱、冰箱、干燥箱、厌氧培养箱、显微镜、高速离心机、BIORAD凝胶成像系统。

2、方法

（1）细菌分离培养

无菌操作取病（死）鸭脑、心血、肝脏病料划线接种于普通琼脂平板、鲜血琼脂平板、巧克力琼脂平板各2份，分别放在厌氧和有氧条件下，37℃培养24-48h，观察菌落特征，挑选单个菌落革兰氏染色。

（2）细菌的纯化

在巧克力琼脂平板上钩取厌养条件下生长的鸭疫里氏杆菌可疑菌落，分别接种于伊红美蓝平板、麦康凯平板，SS培养基，TSA培养基，置厌氧条件下，38℃培养24-48h，观察细菌的生长情况、菌落特征等。并将纯化后的菌种放入-20℃的冰箱中冻干保存。

（3）生化试验鉴定

挑选TSA培养基上单个、典型菌落，接种于各生化发酵管中，37℃厌养培养24-48h后，观察发酵情况。

（4）PCR鉴定

①模板DNA的提取

无菌挑取2-3个待鉴定的菌株长成的菌落，放于EP管中，加入500ul双蒸水，吹打悬浮;4000rpm离心5min，弃上清，加500ul的TE（PH=8.0）悬浮;加入5ul溶菌酶，37℃，20min;加入RNase1.5ul、10%SDS62.5ul，充分混匀，37℃水浴30min;加入20mg/ml蛋白酶K2.5ul，充分混匀，37℃水浴90min;用苯酚，苯酚：氯仿：异戊醇，氯仿各抽提一次，经乙醇沉淀后溶于20ulTE中保存备用。

②引物的设计

运用primer5.0软件，根据已发表的RA的camp基因序列，设计一对引物，引物序列分别为：

上游引物（RAF）：5' GAA ?CTT ?TGG ?TCT ?TGG ?TAT ?CC 3'

下游引物（RAR）：5' CAG ?ATG ?CAG ?CTC ?TTT ?CTC ?TA 3'

③PCR反应循环参数

将混合物吹打均匀后，至PCR仪中扩增。反应条件如下：95℃预变性4分钟，94℃45秒，55℃45秒，72℃45秒，30个循环，72℃延伸10分钟，PCR反应结束后，取5ulPCR产物在1%琼脂糖凝胶中90V电泳35min，在BIORAD凝胶成像系统下观察扩增片段大小。

二、结果与分析

1、细菌分离培养

该菌株在普通琼脂平板上不生长，在厌氧条件下的鲜血琼脂平板和巧克力琼脂平板上生长良好。菌株接种鲜血琼脂平板37℃烛缸培养24h后，鲜血琼脂平板上不溶血、长凸起、闪光呈奶油状小菌落，约1.5mm;在巧克力琼脂平板上长隆起、表面光滑、透明的圆形菌落，约2mm。

2、细菌的纯化

在巧克力琼脂平板上钩取的鸭疫里氏杆菌可疑菌落，分别接种的伊红美蓝平板、麦康凯平板、SS培养基均不生长，在TSA平板上37℃烛缸内培养24h，形成圆形、隆起、露珠样、直径为0.5-2mm的菌落。

3、生化特性

将从病料中分离出的细菌进行生化鉴定，结果（见表1）。

4、PCR扩增产物

对样品进行检测，扩增出1条670bp的特异性目的片段（见图1）。

三、结论

鸭疫里氏杆菌病的诊断可根据鸭群发病情况，临床症状和病理变化做出初步诊断，确诊需结合实验室诊断分离出鸭疫里氏杆菌。本病的发生与病原污染饲养环境的累积有关，主要经呼吸道或通过皮肤伤口感染而发病。此外，饲养管理不当、密度过大、地面潮湿、空气混浊、过冷和过热，饲料缺乏维生素、微量元素或蛋白质等均是发病不可忽视的诱因。还应在冬春季节做好防寒保暖工作，尽量减少不良应激因素的刺激，养殖场最好实行“全进全出”的饲养管理制度。建议加强鸭群的饲养管理，对发病鸭通过药敏试验选出敏感抗生素进行治疗，在治疗的同时要结合电解多维饮水，提高鸭群机体抵抗力。

（作者单位：271600 山東省肥城市畜牧兽医服务中心）

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